持续性多克隆B淋巴细胞增多症B细胞可通过CD40-CD154相互作用被激活

摘要

持续性多克隆B细胞淋巴细胞增多症（PPBL）是一种罕见的疾病，主要诊断于成年女性吸烟者，其特征是CD19的扩增⁺CD27⁺IgM⁺记忆B细胞，存在双核淋巴细胞，血清IgM适度升高。临床过程通常是良性的，但尚不清楚PPBL是否可能是导致恶性增生性疾病出现的过程的一部分。在本研究中，我们试图通过一个基于CD40-CD154相互作用的最佳记忆B细胞培养模型来研究PPBL患者B细胞的功能反应。我们发现PPBL B细胞的增殖几乎与正常对照B细胞的增殖一样重要，导致高免疫球蛋白的分泌体外同型的切换。我们得出的结论是，CD40-CD154激活通路在PPBL患者的记忆B细胞群中发挥作用，这表明该障碍可能是由于微环境中其他细胞的功能障碍或可能是另一个B细胞激活通路的缺陷。

1.介绍

持久性多克隆B细胞淋巴细胞增多症(PPBL)是一种罕见的非恶性淋巴细胞增生性疾病，主要诊断于女性[1，2]但是虽然少数人也被诊断出了这种情况[3.- - - - - -5］.在大多数患者中，除了轻微疲劳外，临床症状是非特异性的[1，6］.患者，通常是香烟吸烟者，存在升高的多克隆血清IgM和记忆B细胞的持续多克隆淋巴细胞症，如流式细胞术，通过CD27的群体证明⁺IgM⁺IgD⁺细胞与正常κ/λ比例[7- - - - - -11.占B淋巴细胞总数的70%以上[12.］.这些患者的血液涂片的特征是存在大多数非典型淋巴细胞，胞浆丰富，细胞核成熟。在他们的淋巴细胞中可以观察到1-9%的双核[13.]患者主要表达HLA-DR7表型，而这种特殊的等位基因通常只出现在26%的正常高加索人群中[14.］.

临床课程通常是良性的，但我们之前已经描述了在PPBL诊断后19年开发了弥漫性大B细胞淋巴瘤（DLBCL）的一个人的情况[15.].总的来说，文献中报告的一小部分PPBL患者发展成恶性疾病[16.- - - - - -18.］.尽管这种疾病的病理生理学仍不清楚，但家族联系是其不变的特征之一，表明存在潜在的遗传缺陷[19.].尽管B细胞增殖具有明显的多克隆性，但B细胞之间的重排频率bcl - 2免疫球蛋白重链基因是正常B细胞的100倍，并且是多重的bcl - 2 /搞笑在所有PPBL患者中观察到基因重排[20.］.同位染色体3q+ (i3)(q10)也已在不同比例的B细胞群体中被描述[3.，18.］.这种遗传畸变通常局限于B细胞，表明PPBL患者中存在明显的克隆细胞遗传群体[3.］.这证实了这种疾病中的一些B细胞与正常的B细胞不同。然而，关于B细胞在PPBL中的功能特性的信息还很少。

已经证明PPBL B细胞是呈现CD27的记忆细胞⁺IgM⁺IgD⁺免疫型[11.，21]拥有丰富多样的曲目[11.，22它们可能来源于脾边缘区B细胞群[23］.边缘区CD27⁺IgM⁺IgD⁺B细胞可能是记忆细胞，可以独立于生发中心反应产生，T细胞帮助，同时也能够对CD40-CD154相互作用作出反应[24，25］.CD40至CD154在活化的T细胞上表达的结合在B细胞活化，增殖和免疫球蛋白同种型切换中发挥着中心作用[26］.来自健康对照组的B淋巴细胞在基于IL-4存在的这种相互作用的培养系统中生长良好[26，27］.然而，我们之前已经表明PPBL B淋巴细胞不能延续体外CD40-CD154相互作用。这些观察结果提示CD40通路可能存在缺陷，尽管CD40表达、测序和酪氨酸磷酸化似乎正常[28］.其他人后来报道了循环中的CD19⁺CD27⁺正常人的记忆B细胞对高水平CD40-CD154相互作用无反应[29]最后，研究表明，在IL-2、IL-4和IL-10存在的情况下，CD40-CD154相互作用强度降低，导致正常记忆CD19的增殖、扩张和免疫球蛋白分泌⁺CD27⁺B细胞(30.，31］.

由于PPBL B细胞共享正常记忆B细胞的CD27表达，我们设计了一项研究，研究PPBL患者B淋巴细胞在低强度CD40-CD154相互作用培养中的反应，并进一步表征这些细胞，特别是它们的同型转换和免疫球蛋白分泌。

2.患者与方法

2.1。患者和健康对照

本研究对象为6名女性患者(8010、8011、8013、8030、8031、8032)，年龄47 - 69岁。所有人都被要求回答一份关于他们生活习惯和健康状况的问卷。PPBL患者最初在st - sacement和CHU de Québec的Enfant-Jésus医院进行诊断和随访。诊断标准为(a)持续性CD19⁺/ CD5^-B细胞淋巴细胞增多症，持续时间至少6个月，正常κ/λ比;(b)血清IgM浓度多克隆增加;(c)如前所述，在血液涂片上出现双核淋巴细胞[11.，28];(d)外周血淋巴细胞中存在多个bcl-2/Ig基因重排。所有患者均经知情同意后采血。本研究已得到楚德Québec研究伦理委员会的批准。如前所述，通过常规的从白细胞减少室回收血小板，从健康个体中获得外周血单个核细胞(PBMCs) [32]因此，与参加魁北克研究的健康个体的样本进行比较得到魁北克研究伦理委员会的批准，所有这些样本都是在每个个体知情同意后获得的。

2．2．PPBL标本中人外周血B细胞的分离

采用Ficoll-paque密度梯度离心法(Amersham Pharmacia Biotech, Baie d 'Urfé， Canada)从外周血中分离出PBMCs，悬浮在冷冻培养基(Roswell Park Memorial Institute (RPMI)培养基(Gibco-BRL, Burlington, Ont, Canada))中，添加20%胎牛血清和5% DMSO (FBS;Hyclone, Logan, UT, USA)，在液氮中冷冻保存。来自患者或健康对照的B细胞，使用StemSep CD19混合物，根据制造商说明，通过阴性选择从冷冻保存3个月或更短的解冻的PBMCs中纯化。30.］.纯化的人B细胞有95%以上的CD19⁺由流式细胞术测定。

２．３．在体外用CD154刺激人B细胞⁺贴壁细胞

L4.5细胞源自遗传修饰的L929细胞系（CCL-1，美国型培养收集，Manassas，VA），并每种细胞表达约21,000±4000cd154分子[30.，33］.从PPBL患者和对照组中纯化的B细胞(~2.5 × 10⁵细胞/mL）在伽马照射（75%）的情况下接种在Primaria平板（BD Biosciences，Mountain View，CA）中 Gy/7500 rad）L4.5细胞，其比率为每L4.5细胞3个或25个B细胞，分别对应于高和低刺激[30.］.B细胞在含有10%超低IgG FBS的Iscove改良Dulbecco培养基(IMDM)中培养μ5.5 g / mL胰岛素μg/mL转铁蛋白，6.7 ng/mL亚硒酸钠（均来自加拿大伯灵顿的Invitrogen）和细胞因子混合物，即5 ng/mL IL-2（~50 U/mL），40 ng/mL IL-10（~20 U/mL）（均来自美国新泽西州洛基山PeproTech）和3.5 ng/mL IL-4（100 U/mL）（研发系统，美国明尼苏达州明尼阿波利斯市）。进行了三个单独的培养实验，每个实验由1名健康对照者和2名患者纯化的细胞组成。通过台盼蓝染料排除法对细胞计数和活力进行了三次评估。培养的B细胞始终是稳定的≥95%CD19⁺并且，除非另有说明，否则活力> 90％。

2.4.流式细胞术分析

联素聚糖蛋白 - 缀合的抗CD27和抗IgG，PERCP-CYANIN 5.5-缀合的抗CD19和PE缀合的抗IgD及其共轭同种型对照均来自BD Biosciences。多元化山羊IgG Fitc-antigm抗体来自杰克逊实验室（加拿大安大略省Mississauga）。所有染色都是使用1进行的 μg (Ab) = 1 × 10⁶细胞。用2%多聚甲醛固定细胞。同型匹配对照Ab染色为>95%双阴性细胞。根据制造商说明，使用7-氨基放线菌素D染色描绘含有死亡细胞的区域(BD Biosciences)。使用FACSCalibur流式细胞仪和CellQuest Pro软件(BD Biosciences)对≥10,000个细胞进行门控分析。随后使用FCS Express II软件(De Novo software, Thornhill, ON, Canada)对数据进行分析。

2．5．Ig-Secretion率

分别于第13天和第14天测定IgG和IgM分泌率。简单地说，细胞收获，PBS洗涤，1-2 × 10播种⁶如前所述，在裸IMDM培养基中收集上清液，并通过标准酶联免疫吸附试验（ELISA）测定IgG和IgM浓度[29］.提示时，用ELISA法检测培养上清中IgG和IgM的含量。

3.结果

３．１．病人资料

6例患者均为女性，表现出与PPBL相关的临床特征(表)1）.如前所述[19.]，高于正常循环淋巴细胞计数(变成6,4 × 10⁹/L)，由于B细胞数量增加，且血清IgM多克隆性增加(至12,1 g/L）。他们的κ/λ在所有病例中，该比例与淋巴增生的多克隆起源一致(数据未显示)。一个Bcl2/Ig每个人都存在基因重排(表)1）.所有患者都是吸烟者，无论是现在还是以前。

３．２．患者外周血B细胞的表型特征

对6例患者纯化的B细胞进行流式细胞术，评估CD19、CD27、IgD和IgM的表达(图)1).如前所述[11.]，CD19的73%±13%（平均值±标准差；范围为58%至87%）⁺B细胞的特征是CD27阳性和90%±6%(平均±SD;(81% ~ 96%)表达IgD和IgM。PPBL患者的所有B细胞也表达CD40(数据未显示)。如此高的CD27频率⁺IgM⁺IgD⁺纯化CD19中的B细胞亚群⁺细胞与预期一致，与我们的PPBL患者的临床数据一致。

３．３．PPBL B细胞对低CD40刺激的反应

来自PPBL患者和健康个体的B细胞在高（3个B细胞/L4.5细胞）和低（25个B细胞/L4.5细胞）刺激条件下进行培养，并监测其增殖13至14天（图2）.如前所述，PPBL B细胞对高CD154相互作用的反应仍然比对照B细胞低6- 30倍，可能是由于它们的高CD27频率⁺IgM⁺IgD⁺细胞。相反，所有PPBL B细胞样本对低刺激条件均有反应，其扩增因子比在高CD40-CD154相互作用实验中观察到的扩增因子高出3到20倍。然而，PPBL B细胞对低CD40相互作用的反应低于对照B细胞，后者含有正常值l幼稚CD27的比率^-和内存CD27⁺B细胞(数据未显示)。很可能是CD27的增殖程度占优势⁺IgM⁺IgD⁺在我们的患者中观察到的B细胞亚群远低于其他更显著的CD27^-我们对照组的B细胞亚群[11.］.

3.4.长期CD40刺激后PPBL B细胞的演变

在第9天和第9天和第14天的CD19，CD27，IgM和IGD表达后监测PPBL B细胞的表型。一个代表性PPBL样品和对照B细胞的实例的表型曲线如下（图3（a））.CD19的频率⁺CD27^-, CD19⁺CD27⁺, IgM^-IgD^-, IgM⁺IgD^-将细胞显示为所有PPBL样品的平均值（)和三个控件(图3（b））.CD19的表型进化⁺B细胞，在所有PPBL样品中类似，通过显示较高频率的CD27频率不同地与对照B细胞的细胞不同⁺和IgM⁺IgD^-细胞（数字3（a）和3（b））.在所有样本中，有两种主要表型，对应于CD19⁺CD27^-和CD19⁺CD27⁺在第9到14天观察细胞。基于CD27的表达，PPBL患者B细胞在低CD40刺激下的进化与健康对照组B细胞的进化相似。在静止状态下，81 ~ 96%的PPBL B细胞处于静止状态(图1)，一种与正常边缘区B细胞相似的表型[11.，34].在CD40刺激后，所有PPBL B细胞样本中的表面IgD几乎消失（图3（a）和3（b））.此外，总IgM出现的频率⁺对照组的B细胞减少，从88 - 95%(第0天)到CD19的不足10%⁺细胞(第14天)，而PPBL样品中保持57%±15%。总的来说，这些结果表明，PPBL B细胞对CD40刺激的反应导致表型变化，与正常B细胞群体中观察到的变化非常相似，但仍偏向于IgM的增长⁺B细胞的子集。

3．5．PPBL B细胞能够转换并分泌IgG

基于上述结果，我们对cd40活化的PPBL B细胞进行流式细胞术分析，以监测其IgG表达情况(图)4(一)）.由此发现IgM的比例增高^-IgD^-B细胞与IgG的产生具有相当精确的相关性⁺B细胞。此外，在来自六个PPBL患者样品的CD40-活化的B细胞中观察到高IgG分泌率，类似于对照B细胞中观察到的那些（图4 (b)）.相反，PPBL B细胞内的IgM分泌率高于对照B细胞，这与较高的IgM比例有关⁺细胞。此外，PPBL B细胞转换同型和分泌IgG的能力表明，PPBL B细胞的体外对CD40的反应与正常B细胞相似。另一个证明体外在低相互作用的CD40-CD154培养基中，PPBL B细胞的同型切换能力在第5天和第14天的IgM/IgG比值之间存在差异。第5天，PPBL B细胞的IgM/IgG比值在6到205之间变化，而在培养结束时(第14天)，IgM/IgG比值几乎或完全逆转，有利于IgG(0,4到3,5)(图)5）.这些观察结果与报道的正常CD27的同型切换能力一致⁺IgD⁺IgM⁺人类B细胞[35］.

4.讨论

X连锁高IgM综合征充分说明了功能性CD40分子在B细胞发育、增殖和免疫球蛋白生成中的重要性，该综合征是B淋巴细胞上的CD40与其配体CD154（由活化T细胞呈现）之间不充分相互作用的结果[36，37].这种缺陷会影响活化CD4之间的相互作用⁺T细胞和所有其他表达CD40的细胞类型，即B细胞、树突状细胞、单核细胞/巨噬细胞、血小板以及活化的内皮细胞和上皮细胞。这种遗传性疾病的特征是类开关重组缺陷，导致血清IgM水平正常或升高，并伴有IgG、IgA和IgG缺乏此外，受影响个体的淋巴器官缺乏生发中心，无法发育出对T依赖性抗原有反应的记忆B细胞[38］.与这种疾病相关的特征部分令人想起那些在持续多克隆B淋巴细胞增殖患者中观察到的特征。事实上，PPBL患者血清IgM升高，多克隆B细胞增殖。因此，我们问自己，这两种疾病之间是否存在类似的病理生理学，特别是CD40-CD154信号通路的缺陷。尽管许多超igm综合征病例与影响CD154并阻止其与其受体相互作用的遗传异常有关[39- - - - - -41]描述了患者的子集，其中描述了疾病的疾病，而是源于CD40诱导的B细胞活化途径的缺陷[42，43］.当从这类超igm综合征患者中分离的B淋巴细胞被刺激时体外在cd40依赖的细胞培养系统中，在完整配体的存在下，它们仍然无法增殖和进行免疫球蛋白同型转换。同样,我们已经表明,B淋巴细胞分离PPBL病人没有回应信号通过扩张CD40当交互CD40 - CD154的水平很高,表明CD40信号通路可能的缺陷,尽管正常表情,测序,CD40的酪氨酸磷酸化28］.后来证实PPBL B细胞本质上是含有CD27的记忆B细胞⁺IgM⁺IgD⁺免疫型[11.，21］.外围CD19⁺CD27⁺来自正常个体的记忆B细胞随后被报道对高水平CD40刺激无反应[29］.然而，最近已经表明，在IL-2，IL-4和IL-10存在下，降低CD40-CD154相互作用的强度导致正常记忆CD19的增殖，膨胀和免疫球蛋白分泌⁺CD27⁺IgM⁺B细胞(30.］.因此，我们在低相互作用CD40-CD154培养基中进行了PPBL B细胞的培养物，得到了CD19的增殖⁺CD27⁺IgM⁺比用高CD154相互作用介质观察到的6至20倍的B细胞。我们证明这些淋巴细胞能够增殖体外在精确和优化的培养条件下，即在IL-2、4和10存在的情况下，CD40和CD154（3个细胞表达25个B淋巴细胞的CD154配体）之间的相互作用水平较低。我们现在可以确认PPBL患者在CD40诱导的信号通路中没有表现出任何缺陷。

我们进行了以下有趣的观察:CD19⁺免疫球蛋白⁺PPBL患者细胞群在培养开始时占全球细胞群的比例不到5%，在第14天增加了25%以上。同时，我们观察到CD19的出现⁺CD27^-细胞数量和表面IgD的消失与正常对照组相同。这种IgD的下调传统上是在B细胞亚群在生发中心激活后观察到的[44]通常与免疫球蛋白的进一步分泌相关。同样，当在适当条件下培养时，来自PPBL患者的B细胞显示出高度的IgM比例^-IgD^-B细胞和IgG的出现⁺B细胞和高免疫球蛋白分泌。通过从培养的对照组和患者B细胞中给药免疫球蛋白分泌，我们观察到低相互作用培养系统中的免疫球蛋白分泌率比高相互作用CD40-CD154培养基中的免疫球蛋白分泌率高得多。这些结果在对照组中是预期的，因为我们已经知道低水平的i交互作用培养基促进记忆B细胞的分化和分泌，而高交互作用培养基优先刺激正常B细胞的增殖[30.］.在低水平CD40-CD154相互作用培养基中，我们观察到PPBL B细胞的IgG和IgM分泌率远高于健康对照B细胞。我们认为这是由于相对于对照组，PPBL患者中大量富含igm的B淋巴细胞亚群所致。也有可能PPBL B细胞能够比对照细胞更快地分化。

高比例的IgM⁺IgD⁺PPBL患者的B细胞群和IgM水平升高提示正常完成同型转换有困难。第14天免疫球蛋白同型分析显示IgG高于IgM。这些结果有力地证明了……的能力体外PPBL B细胞的同型转换。我们还观察到IgG优先分泌发生在低水平CD40-CD154的培养基中，从而增强体外同型转换假说。

5.结论

综上所述，我们在整个研究中发现PPBL B细胞在CD40- cd154培养系统中，在适当的条件下可以增殖，增殖还会导致IgM和IgG的分泌，这些都表明CD40信号通路充足。此外，这份报告提供了第一个证据体外CD19的免疫球蛋白同型转换⁺CD27⁺IgM⁺同时也表明这种能力可能受损体内［45］.这些结果还表明了相同的CD19⁺CD27⁺IgM⁺B细胞并不像我们最初认为的那样异常，因此，正如最近提出的那样，PPBL可能是由微环境的去调节引起的[46]或者来自不同B细胞激活途径的缺陷，导致广泛增殖。

利益冲突

所有作者都没有利益冲突。

作者的贡献

Emmanuelle Dugas Bourdages进行研究、分析数据并撰写论文。Sonia Néron设计研究、分析数据并撰写论文。Annie Roy进行研究。AndréDarveau设计研究、分析数据并撰写论文。Robert Delage设计研究、分析数据并撰写论文。

致谢

这项工作是由加拿大白血病和淋巴瘤协会的emmanuel Dugas-Bourdages资助的。作者非常感谢Pierre F. Leblond博士和Phillipe Richer博士对论文编辑的帮助。

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