治疗Interleukin-22减轻肝损伤和止血失调在急性肝衰竭大鼠模型

文摘

的治疗疗效interleukin-22 (il - 22生成)在大鼠肝损伤和血液学的障碍进行了研究模型引起的急性肝功能衰竭(ALF) D-galactosamine /脂多糖(D-GalN /有限合伙人)。以下参数研究:(1)存活率,(2)血清肝功能的酶(天冬氨酸转氨酶(AST)、丙氨酸转氨酶(ALT)和碱性磷酸酶(ALP)、总胆红素(TBILI)和总蛋白(铝青铜),(3)凝血试验(凝血酶原时间(PT)、活化部分血栓形成质时间(aPTT)和纤维蛋白原(FIB)水平),白细胞(白细胞),红细胞(红血球)和血小板计数,(4)肝肿瘤坏死因子的水平α(肿瘤坏死因子-α)和cyclooxygenase-2 (cox - 2)和(5)肝脏组织病理学。经过48小时的D-GalN /有限合伙人,老鼠表现出20%的死亡率,显著增加AST、ALT、高山,TBILI, PT和aPTT, TNF -αcox - 2、显著降低FIB,白细胞,红细胞表面。相比之下,与il - 22生成治疗预防D-GalN /有限合伙人的致命效果100%,有效地缓解所有的生化和血液学的阿尔夫治疗组中观察到的异常。此外,il - 22生成治疗肝肿瘤坏死因子的内容——下降α和cox - 2。组织病理学的研究结果也支持的王亚南il - 22生成。综上所述,治疗与il - 22生成可以代表一个有前途的治疗工具对肝损伤及其相关的止血干扰。

1。介绍

急性肝功能衰竭(ALF)和重型肝炎(FH)与多种病因毁灭性的肝脏疾病,凝固性障碍,预后不良,90%的总体死亡率(1]。到目前为止没有治疗这种疾病的有效治疗和它的高致命性并发症(2]。连贯,更有效的发展和高度选择性的治疗策略是最重要的医疗需要。

细胞因子il - 22生成是刚刚出现的具有独特的生物活性。各种来源的造血细胞类型产生il - 22生成时,如先天淋巴细胞,NK, NKT,T细胞(3]。il - 22生成时对其生物功能通过激活膜结合heterodimeric受体组成的复杂IL-22R1 IL-10R2,由上皮细胞表达主要包括肠道和肝细胞(4,5]。除了对传染性病原体的防御作用,大量研究证明了良好的组织保护体内注射或开过表达il - 22生成的属性。在这个概念,肝细胞大量表达IL-22R及其刺激通过il - 22生成促进肝细胞生长和生存5]。

王亚南的影响il - 22生成最近建议在各种各样的肝细胞损害6- - - - - -9]。例如,il - 22生成促进肝切除术后肝再生(7),防止酒精诱发肝毒性(急性8],改善肝纤维发生通过诱导肝星状细胞的衰老9],暗示治疗影响的细胞因子在肝移植或肝脏手术的病人。il - 22生成可以促进小鼠的肝干细胞/祖细胞的增殖和慢性乙型肝炎病毒感染患者10]。此外,肝纤维化的程度之间的负相关,il - 22生成浓度最近发现在慢性乙型肝炎病毒感染患者的肝组织(11]。

根据这些观测,应用外源性il - 22生成或诱导其内生产量可能代表一个创新的治疗选择在人类急性或慢性肝病患者5,11,12]。因此,本研究旨在探讨治疗功效和il - 22生成治疗对阿尔夫及其相关的止血和诱导大鼠的血液改变D-GalN /有限合伙人。

2。材料和方法

2.1。化学药品和试剂

重组鼠interleukin-22 (rIL-22)购买从研发系统(明尼阿波利斯,美国)。商业酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒的老鼠cox - 2大鼠肿瘤坏死因子-从研发系统和IBL购买国际(GmbH,汉堡,德国),分别。D-Galactosamine (D-GalN)和酚提取脂多糖大肠杆菌(有限合伙人)获得Sigma-Aldrich(圣路易斯,密苏里州,美国)。其他化学药品和试剂使用规定的部分应用程序。

2.2。动物和实验方法

所有实验协议被委员会批准的保健和使用嗯Al-Qura大学实验动物,并按照指南发表的实验动物保健和使用由美国国立卫生研究院(13]。

在这项研究中,30只成年雄性Wistar鼠称重同样g被随机分为3组:组我;控制老鼠没有接受任何治疗;第二组;D-GalN / LPS组大鼠在腹腔内(i.p)注射nonhighly致命剂量的D-GalN(400毫克/公斤体重)和有限合伙人(40μ克/公斤BW)溶解在1毫升无菌盐水如前所述[14];和第三组:D-GalN /有限合伙人+ rIL-22组的大鼠服用两剂rIL-22 (1μg / g BW /剂量,溶解在0.5毫升生理盐水;i.p)。在时刻0和6小时D-GalN /有限合伙人注射后,分别。

所有的动物观察48小时生存能力,和两只从第二组老鼠都死了。在实验结束时,所有动物组在乙醚麻醉的情况下牺牲,他们的血液标本收集和他们的肝脏收获考试为目标。

2.3。血液采样和分析

在严厉批评过程中,三个血液样本立即撤出每个老鼠的腔静脉和用于凝血、血液学、生化分析。第一个样品收集管,包含0.11柠檬酸钠抗凝(1:9 v: v)和用于等离子体准备筛选后凝血测试:凝血酶原时间(PT)、活化部分血栓形成质时间(aPTT)和纤维蛋白原浓度(FIB),通过使用戴德贝林试剂和遵循制造商的指令如前所述15]。第二个样品收集管中含有二钠盐的乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝剂和用于确定下列血液学参数:红细胞计数(RBC),白细胞计数(WBC)和血小板计数(PLT)。收集血液的最后部分是放置在一个简单的离心管没有任何抗凝剂和用于评估肝功能血清浓度的酶(天冬氨酸转氨酶(AST)、丙氨酸转氨酶(ALT)和碱性磷酸酶(ALP)、白蛋白(铝青铜)和总胆红素(TBILI)使用商用诊断包(Biomerieux SA、法国),根据制造商的指示。

2.4。肿瘤坏死因子- ELISA检测α和cox - 2浓度在肝脏

血液撤军后,肝脏被迅速收获,和每个孤立的部分肝脏在里帕均质裂解缓冲(1:6 w: v),然后在10000转离心10分钟在4°C。获得的上层清液用于测量肝内肿瘤坏死因子的浓度-和cox - 2蛋白利用ELISA包和一个自动化ELISA分析仪(人力、加压和Diagnostica MBH,德国)。所有样品都是在重复处理根据制造商的指示。

2.5。组织学分析

组织病理学调查,街区的孤立的肝脏缓冲福尔马林固定在10%,嵌入在石蜡,分为5μm-thickness切片,苏木精和伊红染色()),并用光学显微镜检查的盲评的存在肝脏损伤的标志。

2.6。统计分析

结果被表示为的意思标准差和统计分析进行了使用SPSS软件,版本16.0(美国SPSS Inc .,芝加哥,IL)。单向方差分析(方差分析)学生的紧随其后t以及用于分析的统计差异。此外,群体之间的统计学意义的存活率决心通过使用卡方测试。被认为代表了一个统计上的显著差异。

3所示。结果

3.1。王亚南il - 22生成疗法的效果

所有动物组监控通过D-GalN后48 h /注射LPS来确定他们的存活率。如表所示1,注射D-GalN(400毫克/公斤)+有限合伙人(40μ克/公斤)导致了20%的死亡率与严重肝脏损伤反映肝功能的血清水平显著增加酶(AST、ALT和高山)和TBILI、显著降低血清铝青铜。另一方面,管理后il - 22生成D-GalN /有限合伙人保持100%的老鼠生存能力和显著的保护肝脏,正如通过返回的血清AST、ALT、高山、TBILI,铝青铜几乎接近基线值(表的控制1)。组织病理学的研究结果也支持了生化观察。如图1,肝脏D-GalN / LPS组表现出高度的肝细胞坏死、凋亡、炎症细胞浸润;然而,老鼠注射D-GalN /有限合伙人和接受il - 22生成显示缺乏病理病灶和无法觉察的炎性细胞浸润。

3.2。凝血试验和血液学的发现

在人类患者凝血和血液异常是常见的急性肝损伤。在一致性,造成大鼠急性肝损伤D-GalN /有限合伙人显示显著改变凝血测试:PT、aPTT、FIB,说明影响内在、外在,凝固的共同通路。如图2,PT和aPTT值是延长2倍以上,和FIB值减少2倍48 h后注入D-GalN / LPS相对于控制的价值观。与控制值相比,D-GalN /有限合伙人显著降低血液白细胞的计数,红细胞表面,PLT(图2)。相比之下,治疗D-GalN / LPS-injected鼠il - 22生成有显著成功地逆转这些异常凝血试验和白细胞计数,红细胞表面,PLT(图2)。

3.3。肝肿瘤坏死因子水平α和cox - 2

有强有力的证据表明D-GalN / LPS-induced急性肝损伤和重型肝炎与肝浸润炎性免疫细胞与随后的丰富增加促炎介质包括TNF)的生产和cox - 2。确认这一事实,这两个分子的浓度测量在所有动物的肝脏组织48 h后形成D-GalN /有限合伙人。作为显示在图3、肝脏的正常对照组包含非常非常低或TNF -甚至检测不到的水平和cox - 2;然而,48 h后D-GalN /注射LPS有显著增加的肝内水平这两个促炎的分子。相比之下,与il - 22生成疗法是有效成功地抑制TNF - D-GalN / LPS刺激的影响和肝脏组织中cox - 2生产(图3)。

4所示。讨论

尽管巨大的进步在控制人类疾病,肝脏疾病的影响仍然是全球一个主要卫生问题。细菌内毒素(LPS)来源于肠道细菌是涉及一些急性和慢性炎症性肝脏疾病的发病机理(1,16]。在实验水平,有限合伙人/ D-GalN-induced肝损伤的动物模型的急性肝功能衰竭(ALF)和重型肝炎。在这个模型中D-GalN块基因转录在肝脏和LPS诱导急性cytokine-dependent肝脏炎症伴有巨大肝坏死、止血障碍,和死亡的动物17- - - - - -19]。当前的研究表明,治疗与il - 22生成完全阻止了死亡率和明显减轻肝损伤和恶化血细胞计数和凝固测试在阿尔夫诱导的大鼠模型D-GalN /有限合伙人。此外,它也显著抑制TNF -的生产cox - 2在大鼠的肝组织注射D-GalN /有限合伙人。连贯,il - 22生成可能是一个有前途的治疗代理可以逆转肝损伤和随后在急性肝炎患者凝血功能障碍。

il - 22生成是一个最近发现的细胞因子与关键的生物活性,其王亚南最近提出的各种影响肝细胞损害(6]。在这个概念,它被假定il - 22生成是肝细胞的生存因素诱发凋亡和促有丝分裂的基因表达在肝细胞(20.,21]。il - 22生成时被发现增强肝脏再生(7和保护肝脏免受脂肪肝22),以及对乙醇,伴刀豆球蛋白A -,四氯化碳和Fas ligand-induced肝损伤(8,20.,21]。此外,肝纤维化的程度之间的负相关,il - 22生成浓度最近观察到慢性乙型肝炎病毒感染患者的肝组织,并且假定il - 22生成也可以发挥antifibrotic作用在人类肝脏疾病(9- - - - - -12]。同意这些先前的发现,卓越的王亚南的影响il - 22生成对D-GalN / LPS-induced急性肝损伤大鼠明显在生化检测和组织病理学水平(表1和图1)。

肝脏合成凝血因子的主要器官和血液蛋白质。因此,在人类患者凝血和血液异常是常见的急性肝损伤(19]。与这一事实相一致,老鼠注射D-GalN /有限合伙人了严重的肝损伤,就是明证海拔的血清肝功能酶(AST、ALT和高山)总蛋白和总胆红素明显降低,由长期与凝血功能障碍相关反映PT和aPTT和减少纤维蛋白原水平。此外,有一个显著降低血液中白细胞,红细胞表面,血小板计数的老鼠收到D-GalN /有限合伙人。类似的发现的止血干扰D-GalN / LPS-induced阿尔夫也被Korish[之前报道19]。有趣的是,治疗后与il - 22生成D-GalN /注射LPS不仅扭转了肝脏功能,凝血异常测试而且数量的白细胞,血小板RBSc,几乎接近正常对照值(图2)。支持梁等。23]显示,注射il - 22生成到老鼠调节凝固的因素,包括纤维蛋白原水平和血小板数量、血液和细胞成分,如中性粒细胞和红细胞计数。在他们的研究中,老鼠接受il - 22生成增加血液中血小板和中性粒细胞计数,和一个增强纤维蛋白原记录在他们的肝脏(23]。总的来说,这些发现表明il - 22生成可以减轻肝损害和干扰血止血和细胞结构中观察到急性肝损伤如D-GalN / LPS模型。

有充足的证据表明TNF -中央致病作用α在各种肝病的发展模式,尤其是在死亡率、重型肝炎急性肝损伤,引起D-GalN /有限合伙人(17,18,24]。肿瘤坏死因子-人类造成致命的肝衰竭和脓毒性休克也被报道(25]。阻断TNF -合成或活动可以减弱LPS-induced肝损伤,这证实了TNF -的关键作用在sepsis-related肝毒性26,27]。有趣的是,当前研究的结果与这些事实,而老鼠注射D-GalN /有限合伙人和没有治疗表现出丰富的肿瘤坏死因子-释放在他们的肝脏组织,这种现象是明显抑制通过il - 222治疗(图3)。

在目前的研究中,D-GalN /有限合伙人显著诱导肝cox - 2生产,和治疗这些动物与il - 22生成有效的成功来抵消这种效应(图3)。支持,常和他的同事们证明直接与il - 22生成治疗受伤的心肌细胞中抑制cox - 2的生产(28]。cox - 2在炎症的发病机制有重要作用,合成的炎症介质(前列腺素类)发炎组织。有限合伙人可以刺激cox - 2的表达在不同的人类细胞包括肝细胞(29日),和肝内表达cox - 2在肝损伤诱导的有限合伙人(30.]。更有趣的是,评估的影响肝细胞cox - 2在D-GalN / LPS-induced肝损伤,汉族et al。31日)与目标产生转基因小鼠肝脏中cox - 2的表达,然后是动物注射D-GalN /有限合伙人。与野生型小鼠相比,死亡率,早些时候cox - 2转基因小鼠表现出更高的血清ALT和AST水平,更加突出肝组织损伤。此外,预处理的cox - 2转基因小鼠与选择性cox - 2抑制剂明显减毒D-GalN / LPS-induced肝损伤,表明肝细胞cox - 2及其下游信号通路加速LPS-induced肝损伤(31日]。

5。结论

目前的数据表明,治疗与il - 22生成一个强有力的保护作用对D-GalN / LPS-induced肝损伤,凝固,在大鼠血液学的干扰。的有利影响il - 22生成,至少部分是由于直接和/或间接抑制促炎因子,如肿瘤坏死因子-和cox - 2。这些发现也可以显示il - 22生成的潜在的治疗应用治疗急性肝损伤及其相关的凝血功能障碍。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

承认

作者欣然承认博士的帮助下,阿德尔El-Shemi加拉(部门实验室医学,UQU,沙特阿拉伯,药理学,Assiut University-Egypt)通过本研究的不同阶段。

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