文献骨髓和外周血涂片FISH诊断慢性粒细胞白血病适用性的初步研究

摘要

背景。FISH是一种能够快速检测遗传异常的分子细胞遗传学技术。加纳和其他邻国还没有现成的设施可以对新鲜/湿样本进行分子诊断和监测肿瘤疾病。本研究旨在证明间期FISH可成功应用于甲醇固定骨髓和外周血涂片运输到设备更完善的CML分子诊断设备。方法。对诊断时获得的22张甲醇固定骨髓(BM)和3张外周血(PB)涂片进行间期FISH检查。骨髓涂片包括20例CML和2例形态学诊断的CML;3张PB涂片来自3例CML患者诊断时。6个案例都知道bcr - ablRQ-PCR诊断融合结果。还检索了诊断时的全血细胞计数报告。结果。19例(95%)CML骨髓涂片显示bcr - abl易位。两者之间有显著的相关性bcr - ablRQ-PCR诊断时检测到的转录本和FISH回顾性诊断时从老年BM涂片检测到的转录本(；）．结论。存档的甲醇固定骨髓和外周血涂片可用于检测bcr - ablCML诊断的转录本。

1.背景

荧光原位杂交(FISH)是一种敏感的分子细胞遗传学技术，能够快速检测病理样本中的染色体异常，从而进行准确诊断，检测亚显微镜缺失，风险分层，检测微小残留疾病，评估对治疗的响应。与传统的细胞遗传学技术需要中期细胞核(分裂细胞)不同，FISH可以应用于不分裂的间期细胞核;因此，可以使用未培养的细胞[1，2］.这使得它在大多数领域的肿瘤性疾病如慢性髓系白血病(CML)的研究中成为一个有用的工具。使用合适的DNA FISH探针集可以在间期核中检测到各种染色体异常[3.］.

广泛的标本，如外周血和骨髓标本，用于中期细胞的制备;来自归档骨髓和血液涂片的未培养间期细胞、石蜡包埋的组织切片或来自石蜡块的分解细胞、冷冻组织、来自淋巴结抽吸的细胞或实体肿瘤的细胞都可以用于分析[3.- - - - - -6］.以前的研究已经证明，间期FISH作为一种有价值和可靠的回顾性研究当代方法，特别是在没有新鲜样本的情况下，尤其是在需要额外的调查信息来确定潜在的分子转化用于诊断和研究目的时[4］.

目前，加纳的医学实验室实践与其他西非国家一样，更多地侧重于艾滋病毒/艾滋病、疟疾和结核病等常见传染病的诊断，因为这些疾病负担沉重，并伴随着相关的社会和经济挑战[7］.由于社会和经济限制，加纳的公共实验室资金不足，难以开发和应用目前的分子诊断技术;因此，实验室医生很大程度上依赖形态学来诊断恶性肿瘤，使用各种染色剂。分子技术如FISH、实时定量聚合酶链反应(RQ-PCR)和流式细胞术通常不能用于常规临床应用。然而，世界卫生组织最近对肿瘤，特别是造血和淋巴肿瘤的分类要求发现染色体异常，以准确诊断和处理[8］.

慢性髓系白血病是一种血液学恶性肿瘤，与Abelson白血病病毒基因(ABL)和断点簇区基因(BCR)在22号染色体上形成bcr - abl融合基因。的乘积bcr - abl基因(bcr-abl蛋白)是一种组成性活性酪氨酸激酶，它是CML发病机制的关键[9］.检测和监控bcr - abl转录本对于CML诊断和评估患者对酪氨酸激酶抑制剂(如伊马替尼)治疗的反应至关重要[10］.t(9;22)染色体异常在95%以上的病例中发生。间期FISH在确认易位存在方面很有用[2］.在加纳，慢性粒细胞白血病占所有成人白血病病例的12.8%，但在进行这项研究时，还没有用于分子诊断和监测微小残留疾病的标准化方法[11］.在资源有限的国家，当由于缺乏资源而无法进行这些诊断程序时，就会出现诊断真空;新鲜的样本必须以高昂的成本运到资源更丰富的国家进行分析。因此，本研究试图确定将存档的甲醇固定骨髓和外周血涂片运送到资源丰富的国家用于CML分子诊断的有效性。

2.方法

这项研究是回顾性的。加纳大学医学院伦理和议定书审查委员会获得了伦理方面的批准。从加纳Korle-Bu教学医院血液学实验室提取了22(22)张甲醇固定骨髓(BM)和3张外周血(PB)涂片。将单层膜的完全风干且标记良好的BM和PB涂片浸入无水甲醇中1分钟并风干。每个患者的甲醇固定涂片(约4-6个涂片)用“无纺布器械包装纸”包裹，贴上患者唯一的识别号码，便于检索。然后把它装进一个盒子里，在实验室的室温下储存。骨髓涂片包括2007年2月至2011年1月间诊断的20例CML和2例CML;3张PB涂片来自3例CML患者诊断时;玻片已储存10至48个月。相应的全血计数(FBC)报告在诊断时也被检索。 Initial diagnosis for these patients was made on the basis of clinical findings and morphological examination of Leishman stained peripheral blood and bone marrow aspirate smears. Six of the CML cases had knownbcr - abl在加纳境外使用RQ-PCR进行诊断时的融合结果(使用新鲜外周血)。采用Fisher精确检验来确定两者之间的相关性bcr - abl诊断时RQ-PCR检测的转录本和诊断时FISH检测的老年涂片的转录本。统计显著性设为．在对照组细胞上进行中期FISH;此外，从外周血对照中制备直接血液涂片用于间期FISH分析。

2．1．对照细胞的组织培养

商业上准备bcr - abl原细胞危象(BV173)融合阳性细胞系和外周血bcr - abl对照组为转录阴性志愿者。在RPMI 1640培养基中进行组织培养[12］.

2．2．涂片和脱落细胞的预处理

直接涂片经甲醇浸泡1分钟预处理，2倍标准柠檬酸盐(2x SSC)室温下孵育5分钟，在0.05 mg/mL胃蛋白酶/10 mmol/HCl中37℃消化5 - 10分钟。然后在2个SSC中孵育5分钟，用双蒸馏水冲洗，在相差显微镜下观察，以确保足够的红细胞溶解。如果红细胞仍然存在，则重复额外的胃蛋白酶治疗。此时，如前所述，选择所需的细胞块数量最少的杂交区域[4］.使用冰乙酸:甲醇固定剂(1:3比例)裂解红细胞，用于年龄小于3周的直接外周血对照涂片以及两份BM和一份PB涂片。然后涂片在1%甲醛中固定，用1倍磷酸盐缓冲盐水(PBS)冲洗，并在70%、80%和无水乙醇中脱水[4］.

２．３．鱼

使用Vysis进行FISH大规模集成电路BCR / ABL双色，双融合易位DNA探针(Downers Grove, IL，美国)。探针经标准程序验证。杂交和甲基化后的洗涤条件遵循制造商的协议。最后用DAPI II对细胞进行反染色。

杂交细胞通过Zeiss Axio荧光显微镜检测，使用Vysis滤光片组:DAPI/Spectrum Orange双带通和DAPI/Spectrum Green双带通，使用Axio Imager Z2 Vision 4.0软件进行图像采集。每张玻片共分析了100个间期细胞核。正信号的截止值为1% [13］.细胞缺乏bcr - abl易位显示两个红色(R)信号，对应于ABL探头，和两个绿色(G)信号，对应BCR调查。因此，正常细胞具有2R2G信号模式。平衡的细胞bcr - abl易位显示红色和绿色信号的两个融合(F)以及一个绿色和一个红色信号。因此，一个典型的正信号模式bcr - abl融合显示2 f1r1g。积极性的程度bcr - abl每一张幻灯片的成绩单都按百分比评分。

3.结果

３．１．外周血特征诊断

CML病例女性5例，男性15例，诊断时中位年龄36岁(范围:20-67岁)。所有受试者均出现显著的白细胞增多，范围在20.7 ~ 636.8 × 10⁹/L和贫血，见表1．贫血，定义为血红蛋白水平低于12 g/dL [14，在所有研究对象中都被观察到。血小板计数正常(150 ~ 450 × 10)⁹8例(40%)受试者，低(小于150 × 10⁹(10%)，高(大于450 × 10⁹/L)。

３．２．相间的鱼

对20例CML和2例CML患者进行间期FISH分析。在20例CML骨髓切片中，19例(95%)确诊为CMLbcr - abl易位。百分比是指得分±标准差bcr - abl诊断时涂片呈阳性(范围:70.0 - -98.0%)。两名CMML受试者为bcr - abl负的。获得的主要得分信号模式bcr - abl阳性涂片分为3组:1 ()显示经典的2F1R1G(图1(d));组2 ()显示1个融合，1个红色，2个绿色(1F1R2G)表示融合ABL删除;组3 ()显示一个融合，两个红色，一个绿色的1F2R1G(图1(e))表示BCR删除。两者之间有显著的相关性bcr - abl使用新鲜外周血的RQ-PCR检测诊断时的转录本，以及使用FISH回顾性检测诊断时来自老年骨髓涂片的转录本(；通过fisher精确测试)。两份铅涂片显示bcr - abl主要评分信号为经典的2F1R1G，伴2F1R(图1(f))在其中一个PB涂片上作为次要评分信号，在其相应的BM涂片上也可以看到类似的信号。第三次PB涂片阴性(图1(c))(相应的BM涂片也是bcr - abl负面的)。

4.讨论

随着一些肿瘤疾病分子标志物的发现，准确评估这些恶性肿瘤的遗传特征是决定预后和临床管理的标志，特别是在靶向分子治疗方面[4］.当无法获得新鲜的病理样本或由于缺乏资源而无法进行诊断时，识别和关联这些单个肿瘤特征的需求就成为一项挑战。在资源有限的国家，这些样本可能必须运往资源更丰富的国家进行分析。血液学领域通常所依赖的新鲜外周血样本或骨髓标本，由于样本降解往往存在运输困难。

以往的研究表明，在检测和定量方面有很好的一致性bcr - abl从培养的骨髓抽吸液和外周血间期细胞中获得的转位结果[1］.本研究旨在确定间相FISH作为一种可靠、可重复和定量的分子诊断技术在甲醇固定存档骨髓和外周血涂片上的有效性，这些涂片保存在室温下，可以运输到设备更好的实验室，无需担心样品降解。

获得的数据显示，大多数(89%)的受试者显示经典bcr - abl双融合(2F1R1G)模式诊断。约11%的人显示了1F1R2G所提示的异常信号模式ABL缺失和1F2R1G提示BCR删除。据报道，这种缺失在10-15%的患者中存在，并可能导致晚期CML患者预后不良[15，16］.两者之间有显著的相关性bcr - abl6例CML患者在开始治疗前使用新鲜外周血样本进行RQ-PCR诊断时检测到的转录本水平，以及使用间期FISH诊断时相应的存档骨髓涂片。这意味着老化的甲醇固定骨髓涂片标本与新鲜血液标本一样可靠，用于诊断时白血病负担的量化。因此，甲醇固定骨髓和外周血涂片可方便地应用FISH技术诊断CML。这项研究表明bcr - abl利用老化的骨髓和外周血涂片，FISH可以检测到转录本。

间期FISH技术直接应用于血液学实验室提取的甲醇固定骨髓和外周血涂片(室温保存)，无需组织培养。这使得这项技术快速、简单，而且成本更低，因为不需要文化和其他物流。

然而，用冰醋酸/甲醇固定剂处理单层切片的薄膜(涂片)进行红细胞裂解的结果较好，虽然部分红细胞没有裂解，但所有白细胞仍保持完整。此外，必须监测胃蛋白酶消化步骤，因为过度消化会导致载玻片上所有细胞的损失。

5.结论

结果证实，骨髓和外周血涂片可以成功地用于检测和定量bcr - abl以诊断CML。的bcr - abl可靠地检测到融合。这对在加纳以及非洲大陆的主要转诊医院设立区域卓越诊断中心具有重大影响。因为它可能不是可行的在不久的将来建立装备精良的医疗实验室在所有地区医院,样本在加纳的其他地区,甚至周边国家可以收集、固定、和发送到这些中心,分子诊断将结果通过互联网传递迅速。这将大大改进对非洲大陆许多恶性疾病治疗反应的诊断、治疗和监测。我们建议用更大的样本量进行进一步的研究，以确定甲醇固定骨髓和外周涂片在室温下降解前可以保存多长时间。

缩写

CML:	慢性髓样白血病
CMML:	慢性myelomonocytic白血病
鱼:	荧光原位杂交
RQ-PCR:	实时定量聚合酶链反应
BCR:	断点簇区基因
ABL:	艾贝尔森白血病病毒基因。

利益冲突

两位作者宣称他们没有相互竞争的利益。

作者的贡献

Ivy Ekem, Edeghonghon E. Olayemi, Alice Charwudzi和Olufunmilayo Olopade策划了这项研究。Alice Charwudzi、Mariann M. Coyle、Amma Anima Benneh和Emmanuel Allote Allotey进行了初步研究和初步文献综述。Alice Charwudzi、Olufunmilayo Olopade和Mariann M. Coyle实施了这项研究。Olufunmilayo Olopade和Alice Charwudzi提供了资金支持。所有作者都评论了这篇论文。所有作者阅读并批准了最终论文。所有的作者都对这部著作做出了同样的贡献。

致谢

作者非常感谢日内瓦国际癌症控制联盟提供的培训经费，感谢Olopade教授实验室的工作人员提供的资金支持和培训，感谢已故的Janet Rowley教授的实验室提供的BV173细胞株，以及细胞遗传学实验室的支持。芝加哥大学的所有学生特别感谢Korle-Bu教学医院血液科所有人员eow Aidoo先生储存了使用的涂片，Christopher Nyimba先生协助取出涂片。

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