HLA-DRB1中检测不到RhD特异性抗体人RhD阳性红细胞刺激小鼠

摘要

通过缺乏rHD免疫的小鼠模型，通过缺乏小鼠模型阻碍了在预防胎儿和新生儿的溶血性疾病中对RHD抗原的免疫反应的能力受到阻碍。然而，转基因小鼠表达人类HLA DRB1的能力用纯化的RhD来应对免疫，这使得这个问题再次被讨论。在这项工作中，我们旨在诱导抗RhD抗体通过管理人RhD⁺转人类HLA DRB1基因的小鼠红细胞以及几种标准的近交系和远系实验室菌株，包括C57BL/6、DBA1/J、CFW(SW)、CD1(ICR)和NSA(CF-1)。DRB1.另外用推测的细胞外免疫原性RhD多肽免疫小鼠。DRB1.用RhD免疫小鼠⁺红细胞产生红细胞反应性抗体反应。流式细胞术无法检测到RhD特异性抗体。尽管如此,DRB1小鼠能够识别Rh的免疫原性序列，因为注射Rh多肽诱导的抗体与RhD序列反应，这与能够识别RhD的B细胞库的存在一致。我们得出结论HLA DRB1转基因小鼠可能对RhD内的免疫原性序列有应答能力，但对表达RhD的人红细胞的免疫应答尚未直接观察到。

1.介绍

RhD抗原是临床上重要的人类血型，在胎儿和新生儿溶血性疾病(HDFN)以及一些自身免疫性溶血性贫血病例中可能是主要靶点。RhD(抗d)抗体用于预防HDFN已有多年。由于缺乏研究这种抗原的小鼠模型，在预防HDFN中操纵和研究对RhD抗原的免疫反应的能力受到了阻碍。尽管从未正式发表，但人们普遍认为，标准实验室小鼠对RhD抗原不会产生免疫反应[1］.然而，最近有能力创造出表达功能性人类HLA抗原的转基因小鼠，这使得这个问题在小鼠模型中得以重新探讨。

Aberdeen组已成功地诱导了在表达人HLA-DRB1的人源化小鼠中对溶解的RHD蛋白的免疫反应等位基因(1］.人类HLA II类DR已被发现是人类t辅助细胞特异性RhD蛋白的主要限制因素[2和HLA-DRB1对于RhD阳性红细胞产生抗RhD抗体的RhD阴性献血者，等位基因明显过多[3.］.特别是HLA DRB1的表达转基因小鼠对纯化RhD蛋白免疫反应的能力[1］.

除了能够刺激免疫应答之外，还显示出源自RHD蛋白序列的T细胞表位，以诱导对HLA-DRB1中的RHD抗原的口服耐受性小鼠模型。虽然对纯化的RhD蛋白的免疫反应是有趣的，但产生一种免疫反应的能力，以自然表达RhD在红细胞表面是需要向前推进相关的小鼠模型。迄今为止，在表达HLA-DRB1的小鼠红细胞表面表达了对RhD的免疫应答尚未被解决。

在这项工作中，我们旨在通过在表达HLA DRB1的小鼠中使用表达RhD的人红细胞来诱导抗RhD抗体应答[4.］.值得一提的是，HLA DRB1这里使用的小鼠品系与Hall和他的合作者在2005年使用的不同。具体来说，就是HLA DRB1我们研究中使用的小鼠缺乏功能鼠MHC II类的表达，迫使通过HLA DRB1进行免疫应答的限制元素[4.］.此外，常规的近交系和非近交系小鼠品系也被人rhd阳性的红细胞挑战，以正式评估标准品系小鼠是否能产生抗rhd特异性抗体应答。

结果表明，HLA DRB1转基因小鼠在各种条件下受到RhD阳性红细胞的攻击，尽管对红细胞产生了免疫反应，但流式细胞术未检测到RhD抗体。然而，多肽研究的结果与能够识别三个免疫原性序列中的每一个的B细胞库一致。我们得出结论HLA DRB1转基因小鼠对RhD序列有应答能力，但对表达RhD的人红细胞的特异性免疫应答尚未直接观察到。

2.材料和方法

2．1．老鼠

HLA-DRB1表达人HLA-DRB1的转基因小鼠Chella David博士(Mayo Medical School, Rochester, MN, USA)提供无内源性II类分子的等位基因[4.］.DRB1上唯一的功能II类分子抗原提呈细胞是人类的II类分子。C57BL/6和DBA1/J小鼠株购自美国杰克逊实验室(Bar Harbor, ME)。美国)。远缘小鼠品系CFW(SW)和CD1(ICR)购自Charles River (Montreal, QC, Canada)，而NSA(CF-1)购自Harlan Sprague Dawley Inc. (Indianapolis, IN, USA)。所有的小鼠实验都得到了圣迈克尔医院动物护理委员会的批准，小鼠被安置在圣迈克尔医院研究中心。

2．2．用人红细胞免疫小鼠

全血和全白细胞减少红细胞从加拿大血液服务网络应用发展中心(NetCAD)获得，这项工作得到了加拿大血液服务研究伦理委员会的批准。免疫前，从单位中提取的红细胞在pH 7.2的磷酸盐缓冲盐水(PBS)中洗涤三次，并用番石榴EasyCyte Mini System细胞分析仪(Guava Technologies, Hayward, CA, USA)计数。小鼠每次注射10微克^8.人RhD阳性红细胞(DRB1 、C57BL / 6DBA1 / JCFW (SW)CD1 (ICR)，NSA（CF-1）)．DRB1.小鼠加用10^8.CpG ODN佐剂(Magic Mouse佐剂，Creative Diagnostics, NY, USA)存在的人RhD阳性红细胞()，或两剂10剂^8.人RhD阳性红细胞的治疗间隔21天，无佐剂()．未处理的小鼠作为阴性对照()．在第一次或第二次攻击后的第7天，所有的小鼠都被放血取血清。

２．３．RhD肽段设计与免疫

根据人类RhD序列(登录号L08429)设计和筛选肽段。使用免疫表位数据库(IEDB)分析资源的抗体表位预测工具预测假定的线性表位(http://tools.immuneepitope.org/tools/bcell/iedb_input)．四种肽，理论上与人类RhD蛋白的细胞外区域相对应，并且在序列上与小鼠RhD不同[5.]被选取(表1,图1)．多肽由多肽国际公司合成并冷冻干燥(路易斯维尔，肯塔基，美国)。肽1 ~ 3在1 M碳酸氢铵中成功溶解。不幸的是，肽4不能溶解在高达10%的有机溶剂中，因此没有被使用。肽1到3成功与锁眼坚守岗位的血蓝蛋白(KLH) (Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国)使用半胱氨酸添加糖和Sulfo-SMCC (4 - (N-Maleimidomethyl) 3-sulfo-N-hydroxysuccinimide cyclohexane-1-carboxylic酸酯钠盐)(Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国)用作交联。含半胱氨酸的多肽与KLH的偶联效率是通过半胱氨酸测定法测定的，该半胱氨酸测定法使用的是5,5 ' -二硫代二硝基苯甲酸(DTNB或Ellman试剂)，在pH 8.0时与巯基反应，产生一个在412 nm处最大吸收的发色团。然后通过半胱氨酸标准曲线(Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA)测量检测混合物中初始和残留半胱氨酸肽的浓度来计算偶联效率。DRB1.分别用三种剂量的50只小鼠进行免疫μg肽1,2或3与KLH偶联并在弗氏佐剂中乳化(第一剂为完全弗氏佐剂，第二和第三剂为不完全弗氏佐剂)(Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA)，间隔14天给药(每个肽2只小鼠)。小鼠在指定时间经隐静脉采血，收集血清检测抗肽、抗klh、抗人红细胞抗体。

２.４.RhD多肽抗体应答分析

为了检测针对合成肽本身的抗体，在ELISA板(Cat # 07-200-35, Thermo Fisher Scientific Inc.， MA, USA)上涂10μg/mL的相应肽。4°C孵育过夜后，用0.05% Tween 20在PBS中洗涤，并用2% (wt/vol)牛血清白蛋白(BSA) (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA)在PBS中在22°C中封闭2小时。洗涤后加入血清样本(终点稀释剂)，在22℃下孵育1.5小时。然后洗涤平板，用碱性磷酸酶F(ab’)孵育。₂片段山羊抗小鼠IgG, Fcγ片段特异性(Jackson Immunoresearch Laboratories, IN, USA)。在22°C孵育1小时后，再次用0.001 mol/L MgCl洗涤1 mg/mL对硝基苯基磷酸盐(Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA)₂，加入9.7%二乙醇胺，pH为9.6。15 ~ 30分钟后，用ELISA仪在405 nm处读取板。抗体滴度定义为血清稀释度最高且呈阳性值。

2．5．红细胞特异性抗体应答分析

通过流式细胞术检测使用rhD阳性和RHD阴性RBC的抗体攻击人RHD阳性RBC的小鼠的血清[6.］.用PBS、pH 7.2和2 × 10洗涤红细胞3次^6.细胞孵育20 μL血清稀释至1/100，在22°C处理1小时，然后2.5μg / ml goat f（ab'）₂抗小鼠IgG (FITC偶联)，然后用番石榴EasyCyte Mini系统细胞分析仪进行分析。为了选择性检测RhD特异性抗体，首先将血清与RhD阴性RBC吸附，然后评估与RhD阳性RBC的结合情况。将RhD阴性RBC与血清在22℃振荡条件下孵育1小时，进行血清吸附。然后离心管，收集含有血清稀释剂的上清液。第二个吸附循环也在4°C进行。吸附血清稀释物对人RhD阳性RBC的评价如上所示。人多克隆抗d血清(WINRHO, Cangene bioPharma Inc.， MD, USA)作为阳性对照。

3.结果

３．１．选择的标准小鼠对人RhD阳性红细胞免疫的反应

尽管人们认为标准的实验室小鼠对RhD抗原不会产生免疫反应[1，目前还没有公布的数据表明，当小鼠受到人类红细胞的攻击时，RhD抗原的免疫反应如何。为了解决这个问题，一些最常用的近交系和非近交系(瑞士和非瑞士血统)小鼠品系被人RhD阳性的红细胞攻击，并通过流式细胞术评估与人RBC反应的抗体以及RhD特异性抗体。除SFW(SW)外，所有小鼠品系均检测[C57BL/6 (), DBA / 1 j ()、CD1(ICR)和NSA(CF-1)]检测出高水平的IgG抗体与人RhD阳性RBC反应(图2(一个))．然而，当血清首先吸附有RHD阴性RBCs时，未检测到对人RHD阳性RBC的反应性（图2 (b)），表明不能检测到显着水平的RHD特异性抗体。

SFW(SW)小鼠对人红细胞的抗体应答特别低。一种可能的解释是该菌株的启动子区缺失H2-Ea(它编码MHC II E类的α链αβ异源二聚体)，它强烈地有助于设置CD4+和CD8+淋巴细胞的比例[7.］.

３．２．免疫接种HLA-DRB1人类RhD阳性红细胞转基因小鼠

考虑到HLA DRB1的表达转基因小鼠对纯化RhD蛋白免疫反应的能力[1，检测HLA DRB1通过用人RhD阳性红细胞挑战这些小鼠来获得免疫应答。小鼠接受一到两次剂量为10的刺激^8.人RhD阳性RBC间隔21天，或CpG ODN佐剂存在下相同数量的细胞。HLA-DRB1小鼠在攻毒后产生了与人红细胞反应的抗体，两次免疫或使用佐剂增加了抗体反应的幅度(图)3(一个))．然而，当这些小鼠产生的血清被RhD阴性的红细胞吸附时，无法检测到RhD特异性抗体(图)3 (b))．

３．３．免疫接种HLA-DRB1具有对应于人rHD序列的合成肽的转基因小鼠

因为没有证据表明HLA-DRB1当小鼠能够在红细胞表面对RhD抗原做出特异性的体液免疫反应时，我们用推测的RhD免疫区域的多肽进行了实验，以评估这些小鼠是否具有与人类RhD反应的合适的B细胞库。根据RhD蛋白在红细胞膜上的预测结构(图1)，我们合成了四种多肽，其中含有推测的细胞外免疫区域的RhD。值得注意的是，肽1在Rh基因位点(RHD和RHCE)之间是相同的，而肽2和肽3在RHD和RHCE之间分别显示了82%和67%的序列同源性。HLA-DRB1然后用三种与KLH结合的肽1、2或3刺激转基因小鼠。第四个肽在缓冲液中不溶于KLH偶联，未进行评估。

在HLA-DRB1中成功地产生了抗多肽抗体从免疫后28和35天收集的小鼠;如ELISA检测到的，使用免疫肽作为抗原（图4.)．

4.讨论

我们的研究提供了证据，证明选择的近交系和非近交系实验室小鼠对自然表达的人类RhD不产生特异性抗体反应。当我们挑战标准的近亲繁殖(和）与人RHD阳性RBC的外击小鼠，小鼠响应于人RBC，但除了使用多个RBC暴露或加入佐剂以增强免疫应答，不能从任何测试的小鼠菌株观察到对人RBC的抗体。还评估了不同的培养温度（数据未显示）。据我们所知，这是第一次出现的研究表明，所选择的常规小鼠注射有人RBC，不会通过流式细胞术检测到的RHD蛋白特异性特异性的抗体。

对小鼠的人RHD蛋白的免疫原性的重要考虑是与小鼠RH蛋白的序列同源性的程度。在小鼠中，Rh蛋白质通过染色体4上的单个RH基因编码，并且仅对人蛋白表现出60％的序列同一性[8.，但这并不能解释人体对Rh蛋白缺乏反应。例如，人类RhD和RhCE是同源蛋白，序列同源性超过90%，暴露于RhD仍然可以在d阴性个体(RhC阳性)中产生有效的免疫反应[9.-11.］.

一个可能的解释是，标准小鼠没有适当的B或T细胞库来对RhD蛋白做出反应。然而，以前已经证明小鼠可以转基因HLA DRB1用RHD纯化的蛋白质响应免疫[1，证明至少这些小鼠(能够表达人类HLA-DRB1)和小鼠MHC类II)具有特异性的RhD表位的B细胞。相反，当我们挑战只表达人类HLA-DRB1的小鼠时对于完整的人RhD阳性红细胞，尽管这些小鼠成功地产生了与人RhD反应的抗体，但没有观察到针对RhD的特异性抗体。自然表达的人类RhD蛋白可能不是小鼠产生应答的显性抗原。B细胞或T细胞的淋巴细胞反应通常局限于蛋白质抗原上的一小部分潜在决定因素。因此，当小鼠被表达多种外源蛋白的人红细胞攻击时，RhD蛋白可以表现为一种隐抗原。也可能是抗体对RhD蛋白的反应很低，而流式细胞术检测不够灵敏。虽然流式细胞术有测量红细胞自然表达抗原抗体的优势，但它需要每个细胞至少100个分子结合才能被检测到[12.］.

确认小鼠是否只表达HLA DRB1作为一种潜在的限制因素，B细胞有适当的曲目，以响应人类RhD序列，这些小鼠与RhD合成肽挑战。在免疫HLA DRB1后，成功诱导了抗肽特异性抗体应答小鼠的RhD合成肽。这些结果与DRB1一致具有B和T细胞的小鼠能够识别Rh免疫原性肽并有助于证明DRB1等位基因理论上可以是RhD蛋白免疫反应的限制性因子[1］.

虽然抗D预防已被用于预防临床医学中的HDFN超过四十年，但行动机制仍然不清楚。缺乏抗D免疫小鼠模型限制了HDFN至RHD抗原的研究以及抗D的保护机制。然而，天然表达的人RHD被证明是小鼠免疫原性的，结果仍然需要相关的小鼠模型。

更好地了解小鼠RhD的抗原特性将有助于设计未来研究Rh免疫应答的实验。我们在这里已经证明既没有选择野生型也没有DRB1转基因小鼠响应于用人RHD阳性RBC免疫，产生显着水平的抗RHD特异性抗体，尽管这些小鼠具有反应所需的B细胞再胃。抗原优势对RHD免疫的贡献可能是克服的障碍，并且是一个值得详细解决的下一步。

利益冲突

作者声明本文的发表不存在利益冲突。

致谢

作者感谢Chella David博士(Mayo Clinic, Rochester, MN, USA)提供DRB1转基因小鼠。他们还感谢加拿大血液服务网络应用发展中心(NetCAD)的工作人员和血液研究捐赠志愿者提供红细胞单位。所有作者都对实验的设计、数据的分析以及论文的写作和评论做出了重要贡献。这项工作得到了加拿大血液服务、加拿大健康研究机构向Alan H. Lazarus申请提案项目的资助。Lidice Bernardo获得了加拿大血液服务中心的博士后奖学金。本文所表达的观点并不代表加拿大联邦政府的观点。

参考文献

1. A. M. Hall, L. S. Cairns, D. M. Altmann, R. N. Barker, and S. J. Urbaniak，“hla转基因小鼠对RhD血型蛋白的免疫反应和耐受性”，血液，卷。105，没有。5，pp。2175-2179,2005。视图:出版商的网站|谷歌学者
2. L.-M.Stott，R. N. Barker和S. J. Urbaniak，“绵羊D细胞表位上的恒河D蛋白质”，血液，第96卷，第2期13，页4011-4019,2000。视图:谷歌学者
3. S. J. Urbaniak，“偶发对人红细胞抗原，”肝病杂志，第83卷，增刊1,293-297页，2002。视图:出版商的网站|谷歌学者
4. M. kare, A. Mangalam, M. Rodriguez，和C. S. David，“在HLA II类转基因小鼠中髓磷脂少突胶质细胞糖蛋白诱导的实验性自身免疫性脑脊髓炎的HLA DR和DQ相互作用，”中国神经杂志杂志第169卷第1期1-2，页1-12,2005。视图:出版商的网站|谷歌学者
5. C. L. van Kim, I. Mouro, B. Cherif-Zahar等，“人类血型RhD多肽的分子克隆和初级结构”，美国国家科学院的诉讼程序，第89卷，第89期。22，第10925-10929页，1992。视图:出版商的网站|谷歌学者
6. J. Freedman和A. H. Lazarus，“流式细胞术在输血医学中的应用”，输血医学评论，卷。9，不。2，pp。87-109，1995。视图:出版商的网站|谷歌学者
7. B. Yalcin，J. Nicod，A.Bhomra等，“基因组 - 范围协会研究中的商业上可用的脱鼠”，公共科学图书馆遗传学，第6卷，第2期9、文章ID e1001085, 2010。视图:出版商的网站|谷歌学者
8. Liu Z.， Huang c.h.，“小鼠Rhl1和Rhag基因的序列、组织、表达和染色体定位”，生化遗传学，第37卷，第2期3-4，页119-138,1999。视图:出版商的网站|谷歌学者
9. C. M. Westhoff，“Rh抗原复合物的结构和功能”，研讨会在血液学，卷。44，不。1，第42-50,2007。视图:出版商的网站|谷歌学者
10. S. Simsek，C.A.Dejong，H.T.T.Cuijpers等，“源自rh多肽编码的网状细胞MRNA的cDNA的序列分析，以及E / E和C / C多态性的示范，”肝病杂志，第67卷，第5期2，页203-209,1994。视图:出版商的网站|谷歌学者
11. RH的分子遗传学及其临床应用输液倩碧和生物学，第13卷，第2期1-2页，4-12,2006。视图:谷歌学者
12. “高灵敏度免疫荧光/流式细胞术:细胞因子受体和其他低丰度膜分子的检测”当前的细胞检测协议，第6章:第三单元，2004年。视图:出版商的网站|谷歌学者
13. M. a . Arce, E. S. Thompson, S. Wagner, K. E. Coyne, B. a . Ferdman, D. M. Lublin，“从RhD阳性而非阴性个体中存在的RhD cDNA的分子克隆”，血液，第82卷，第2期2，第651-655页，1993。视图:谷歌学者

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