协同效应的贫血和红细胞输血炎症和肺损伤

文摘

贫血和合成红细胞输血可能与不良有关长期临床结果。调查机制(s)负责,我们异形炎症生物标记和生物活性的循环水平lysophospholipid中介sphingosine-1-phosphate (S1P)控制和贫血小鼠有或没有LPS-induced系统性炎症。急性贫血或脂多糖(LPS)独自挑战引发了增加炎症标记物循环水平的il - 6和keratinocyte-derived趋化因子(处于受控/ KC)。此外,政府的有限合伙人贫血小鼠减少循环S1P水平和增强肺损伤和肺血管通透性。输血的年龄,但不新鲜,红细胞(红血球)恶化肺血管泄漏。在红细胞表面存储鼠标S1P水平下降明显。输血前加载存储与S1P小鼠红细胞表面部分减毒贫血有关急性肺血管泄漏。综上所述,我们的研究结果表明,贫血和系统性炎症可以改变S1P红细胞表面的缓冲能力,提出可能的缓解策略摘要与肺损伤在临床实践中。

1。介绍

血液或拥挤的红细胞通常用于患有贫血,尤其是在设置的创伤和疾病至关重要。虽然敏锐地挽救生命,输血可能触发事件导致,而不是预防,长期发病率和死亡率(1- - - - - -4]。患者急性呼吸窘迫和multiorgan失败,红细胞(RBC)输血能促进急性肺损伤,可能预测死亡率。输血不良反应的假设需要两个“点击率”——有关炎症或额外的诱发条件(s)的接受者,第二个涉及改变输血。后来,输血的年龄可能是重要的,作为在存储可能发生改变。

负责组织损伤的因素(s)的设置输血仍有待确定。中断一氧化氮可用性、脆弱性和受损的红细胞可变形性等离子体膜,和提出了代微粒子和生物活性脂质作为存储病变的根本原因。任何为治愈癌症指明两者结合可能产生系统性炎症、破坏内皮屏障的完整性,促进组织水肿和白细胞浸润在易感者(5]。最近的一项研究表明,红细胞输血的新鲜的负面影响抵消岁加拿大皇家银行系统性炎症(6),这意味着老的红血球失去了存储期间的保护性因素,虽然识别的因素仍然是未知的。

红细胞已被确认为一种重要的生物活性脂质中介缓冲,sphingosine-1-phosphate (S1P) [7),一个在活的有机体内监管机构的内皮渗透性和免疫细胞的功能。在老鼠中,消耗的等离子体S1P S1P合成基因失活的酶(鞘氨醇激酶1和2)引发深刻的肺血管泄漏,可逆转通过恢复循环S1P通过红细胞输血。在人类中,血细胞比容(Hct)预测等离子S1P的水平。然而,我们以前报道,贫血的人血浆S1P水平不均匀恢复红细胞输血。相反,红细胞的年龄单位输血的时候倾向于消极与红细胞输血的能力来补充血浆S1P [8]。在存储过程中,S1P人类红细胞含量明显下降,可能由于酶促降解[8]。由于循环S1P红细胞作为缓冲,年龄较低的红细胞S1P内容可能无法恢复血浆S1P水平和可能实际上把S1P从等离子体,进而导致内皮通透性增加,毛细血管渗漏,炎性细胞的浸润。然而,尽管S1P似乎反向与加拿大皇家银行单位的时代,无论是作为新鲜红血球的保护性因素(6是未知的。

在这项研究中,我们建立了影响两岁新鲜和红细胞输血的系统性炎症和肺通透性贫血结合在一个模型低级炎症小鼠的挑战。我们调查了血液和血浆S1P水平是否与病理生理的变化,评估S1P-loaded红细胞的能力减弱组织损伤。我们的发现可能是临床上重要的,可能代表未来,小说血管屏障功能障碍的治疗策略。

2。材料和方法

2.1。动物

雄性老鼠(C57BL / 6 j)年龄在8到10周从杰克逊实验室购买(巴尔港,我)。老鼠能适应至少一个星期前我们的程序和用于实验协议,以他们的重量≈25克。老鼠啮齿动物食物厂家(5058)随意和标准保持在14小时/ 10小时昼夜光周期。所有程序都是机构的动物保健和使用委员会的批准。

2.2。急性贫血模型

C57BL / 6 j小鼠被放血了贫血(0.02毫升/ gm)协议后Sadahira et al。9),然后立即得到同等体积的无菌生理盐水通过腹腔内注射维持等离子体体积。区分贫血和血管创伤放血,选择老鼠抽血但受到轻微失血(0.002毫升/ gm)表示。24至48小时后最初的失血,额外的血液被收集成EDTA-coated管全血细胞计数(cbc)分析、执行与ABC兽医血液学分析仪、血液和血浆S1P,和血浆炎症生物标记。血浆细胞因子量化使用鼠标多路复用分析工具包(mpxmcyto - 70 K;微孔、Billerica MA)根据制造商的96孔板检测协议。珠荧光检测使用BioRad Bio-Plex 200悬浮阵列读者(BioRad实验室、大力神、CA)和分析使用Bio-Plex Manager 4.0软件(BioRad实验室)。Sphingosine-1P LC / MS / MS测定的样品(50μL)的血浆、全血、红细胞表面包装后的脂质提取甲醇/ CHCL₃/盐酸使用C17-LPA作为复苏与离线标定标准,或通过稳定同位素稀释使用d7 S1P作为内部标准。

2.3。加拿大皇家银行隔离和存储

红细胞表面包装准备修改的协议由美国血库协会建立。从isoflurane-anesthetized小鼠血液收集到无菌管含有柠檬酸无菌磷酸葡萄糖溶液(CPD: Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州)的比率6部分血液:1 CPD一部分。血液是离心机在室温下5000 g 8分钟,富含血小板血浆和淡黄色的外套被移除。红细胞颗粒在无菌resuspended磷酸缓冲溶液(PBS;百特医疗公司,迪尔菲尔德,IL)。红血球被隔离在一个热压处理过的microcellulose列(Sigma-Aldrich)协议后,布鲁斯et al。10]删除> 99%的白细胞。洗脱液的离心去除残留的血浆和血小板。红细胞颗粒是存储在无菌5(作秀的成分,萨默塞特郡NJ)在4°C的比例5部分红细胞:1份5直到输血。红细胞表面立即输血前,在无菌resuspended PBS Hct 50%。当日新鲜红血球被接种小鼠的准备;岁的加拿大皇家银行存储在4°C > 14天前输血。

加载与S1P红细胞表面,细胞被离心洗Tyrode缓冲区包含0.3%苯磺酸去除5。红血球Tyrodes中含0.3% BSA在37°C孵化与0.5毫米C17-S1P或S1P 60分钟,洗两次离心,在无菌PBS resuspended 50% Hct,立即接种小鼠。

2.4。红细胞输血

最初的血液采集24小时后,老鼠与异氟烷麻醉和随机分配到实验团体。一组收到0.3毫升新鲜红细胞在PBS Hct(50%),第二次收到0.3毫升的年龄红细胞在PBS Hct(50%),和对照组收到0.3毫升无菌PBS。通过颈静脉静脉注射进行29-gauge针。输血前红细胞表面被加热到室温。

2.5。有限合伙人的挑战

小鼠腹腔注射2毫克/公斤脂多糖(LPS),肠炎沙门氏菌),在无菌0.9%生理盐水或同等体积的0.9%生理盐水作为控制在24小时后失血。

2.6。肺血管通透性

老鼠与吸入异氟烷麻醉。一百年μl 1%伊文思蓝染料(EBD)在PBS注入右颈静脉。十五分钟后,小鼠安乐死和灌注通过右心室与PBS以恒定速率达到25毫米汞柱压力。肺部解剖,称重,沉浸在一夜之间1毫升4%甲酰胺。记录解决方案的OD在620 nm和规范化肺重量。在一些实验中,EBD的完整的肺被荧光测量使用量化奥德赛红外激光扫描仪(LI-COR,林肯,NE)和归一化肺重量。

2.7。统计数据

所有的结果都表示为的意思SD。分析的结果是学生t以及或方差分析(方差分析)。统计分析是使用Sigma-STAT执行软件版本3.5 (Systat软件公司,芝加哥,IL)。一个概率值小于0.05被认为是显著的。

3所示。结果

3.1。失血的影响在循环炎症和生物活性标记

我们异形血管创伤和失血的影响在老鼠循环炎症生物标记。在24和48小时后主要失血(0.02毫升/通用体重),对应于一个≈Hct(图绝对下降20%1(一)),炎症标志物il - 6(图的循环水平1 (b))和处于受控/ KC(图1 (c))显著增加()。等离子体水平的干扰素;MCP-1咆哮,TNF失血后,il - 10或MIP-2持平(见补充图1在网上补充材料http://dx.doi.org/10.1155/2012/924042)。失血的影响对血浆il - 6与体积成正比的血液收集(补充图2),和一个8.6倍降低血浆il - 6后观察组血容量的一半(0.01毫升/通用体重)。此外,血浆il - 6检测不到48小时后收集的血液体积小(0.002毫升/通用或0.05毫升),表明血管创伤放血本身没有引起检测炎症反应。红细胞作为储层细胞和细胞外S1P,内皮屏障稳定剂(7]。在人类,贫血是伴随着等离子S1P下降。在这里,我们发现,小鼠血浆S1P水平没有下降在24至48小时后失血(图1 (d))。相反,放血后,单位红细胞S1P总量增加,导致更高的全血S1P(补充图3)水平。主要失血就没有改变肺内皮通透性(图1 (e))。

3.2。输血后失血对循环的影响炎症标记物和S1P

我们下决定是否恢复Hct的红细胞输血后24小时内失血会影响循环炎症生物标记或内皮渗透性。政府的新鲜(当天输血隔离)或年龄(储存>输血前14天)红细胞改善Hct(图2(一个))。输血的岁但不新鲜红细胞、血浆il - 6和处于受控/ KC水平增加(数据2 (b)和2 (c))、白细胞(WBC)计数减少(图2 (d)),适度提升肺内皮通透性(图2 (f))。政府的新鲜红细胞后,全血的S1P水平略有增加,而他们拒绝政府岁后红细胞(图2 (e))。理解微分的原因新鲜和衰老红细胞对等离子体的影响S1P的水平,我们测量在RBC S1P内容存储和观察随时间稳步下降(补充图4),这样的S1P内容红细胞存储30天< 25%的新发现孤立的细胞。同样,dihdro-S1P (DHS1P)小鼠红细胞的含量也在存储(补充图4)有所下降。这些研究结果表明,红细胞表面的至少两个主要来源是1血S1P老鼠和输血红血球的S1P内容影响血液S1P的水平。

3.3。炎症挑战后失血的影响

贫血和输血的不良后果可能体现在设置的炎症。因此,我们试图了解急性炎症在贫血的设置影响系统响应。管理一个低剂量LPS的挑战(2毫克/公斤)动物失血后24小时与Hct低于观察小鼠注射生理盐水(图3(一个))。有限合伙人仅提升预期系统性炎症反应,表现为升高血浆il - 6水平(图3 (b))和处于受控/ KC(图3 (c))。在小鼠炎症反应是放大前失血(数字3 (b)和3 (c))。LPS-induced血小板减少症发生在控制和贫血小鼠和导致减少在全血血小板聚集(表1)。有限合伙人注入后,血浆和红细胞S1P水平略,但不明显,低于观察到基线(图3 (d))。肺泄漏在有限合伙人4小时后注入更大的老鼠之前持续失血相比控制老鼠(数字3 (e)和3 (f))。

接下来,我们确定红细胞输血减毒LPS-mediated内皮屏障功能障碍贫血小鼠。而不是防止LPS-mediated肺渗透率、新鲜红细胞输血后给有限合伙人略微提高肺血管漏(数字4(一)和4 (b))。输血的不良影响肺血管完整性放大时岁红血球(储存> 14天)使用(数据4(一)和4 (b))。

根据先前的报道S1P的角色在维持血管通透性和红细胞输血的能力恢复等离子S1P在老鼠中,我们试图确定输血的副作用可以通过加载克服细胞S1P之前输血。提供人类红血球堆积体内S1P [11]。同样,S1P迅速与孤立的小鼠红细胞(补充图5 (a))。符合观察红细胞释放S1P的白蛋白或脂蛋白,输血的S1P-loaded红细胞受体小鼠血浆S1P水平增加(补充图5 (b))。加载新鲜或年龄与S1P红细胞输血前降低肺渗透在有限合伙人的设置,虽然结果没有达到统计学意义(数字4(一)和4 (b))。

4所示。讨论

在这项研究中,我们调查了红细胞输血的后果在贫血的设置或系统性炎症小鼠的挑战。大多数之前的临床前模型没有检查设置贫血输血,输血的后果在后台也没有贫血和炎症。在我们的模型中,仅执行输血后失血,或结合炎症挑战,模拟两个“点击率”导致输血不良反应观察到接受者。急性,posthemorrhagic贫血被撤回模仿在老鼠身上≈20%的血容量计算(9),和系统性炎症被注射LPS引起(2毫克/公斤)。我们观察到,贫血和有限合伙人管理导致较高的等离子体水平的炎症标志物il - 6和处于受控/ KC比独自挑战。比容改进同样与新鲜或年龄红血球贫血小鼠输血,但血浆il - 6和处于受控/ KC更高的红细胞表面经过输血的年龄。

因为糟糕的协会临床结果后输血年龄可能部分与微扰的肺内皮屏障功能,我们也调查了肺渗透在我们的模型中。贫血和输血的新鲜红细胞贫血小鼠肺改变磁导率作为评估EBD的溢出,而输血的红细胞表面老化导致轻度肺血管泄漏。有限合伙人政府贫血小鼠导致肺血管通透性增强nonanemic老鼠相比,表明这是一个合理的模型来提供机械的洞察事件可能发生在接受输血的病人乏力,导致急性肺损伤。

改变生物活性脂质水平或行动已经被提议作为导致红细胞存储病变。血红细胞S1P的主要载体,一个endothelial-barrier稳定剂的血液。在人类中,等离子体S1P密切与Hct表明RBC-associated S1P与等离子S1P接近平衡。在老鼠身上我们没有找到一个类似的关系,这是符合其他的观察12]。事实上,观察高等RBC-associated失血后S1P水平表明,老鼠有一个更健壮的体内平衡机制来补充循环S1P当Hct下降。Hla和他的同事们已经表明,内皮细胞可能导致小鼠血液中S1P含量的主要因素(12]。他们的观察,和自己一起,支持一个模型RBC-S1P与内皮平衡(或其他)S1P的来源,在设置失血,RBC-associated S1P迅速补充这些来源。

我们最近证明S1P水平下降明显在人类红血球在存储由于酶促降解。在这篇文章中,我们观察到类似的下滑鼠RBC-S1P水平在存储和降低血液中S1P输血后衰老的红细胞表面。岁S1P承载能力的降低红细胞可能解释我们以前的观测,在人类红细胞输血变量影响恢复血浆S1P和红细胞存储之间的负相关的趋势持续时间和posttransfusion增加等离子体S1P [8]。

Sphingosine-1-Phosphat有一个强有力的和独特的barrier-protective属性在培养内皮细胞(13,14和微血管完好无损15]。在这些系统中,管理S1P逆转血管通透性和炎症引起的肺损伤有限合伙人(16,17和缺血再灌注损伤18),虽然毒性发生在高浓度的S1P [19]。期间的损失RBC-associated S1P存储部分可以解释观察年龄在红血球贫血小鼠是有限合伙人导致增加肺渗透率相比,老鼠身上刚孤立的红血球。探索这种可能性,我们测试的能力S1P-loaded红细胞表面,防止肺血管输血后泄漏。我们发现小鼠红细胞表面积累外生S1P和输血S1P-loaded新鲜或红细胞岁提高等离子S1P水平、防止输血的barrier-destabilizing影响观察贫血和设定的有限合伙人的挑战。的确切机制目前还不清楚,但可能包括改善微循环的激活水平的S1P维持肺endothelial-barrier完整性。

5。结论

总之,损失与存储相关的S1P红细胞表面可能导致血液摘要与肺血管漏在急性贫血的设置和系统性炎症。输血的外生S1P-loaded红细胞表面可以在一定程度上减弱急性肺血管泄漏。我们的发现可能会有重要的临床影响为摘要与新颖的治疗策略预测和防止受伤。

缩写

BSA:	牛血清白蛋白
加拿大广播公司:	完整的血细胞计数
CPD:	柠檬酸磷酸葡萄糖溶液
处于/ KC:	Keratinocyte-derived趋化因子
DHS1P:	Dihdro-sphingosine-1-phosphate
EBD:	伊文思蓝染料
Hct:	血细胞比容
il - 6:	白介素- 6
有限合伙人:	脂多糖
PBS:	磷酸缓冲盐
OD:	光密度
加拿大皇家银行:	红细胞
S1P:	Sphingosine-1-phosphate。

支持

这项研究受到了药物的研究者发起格兰特公司(史密斯),和赠款HL078663(史密斯),GM050388 (a·j·莫里斯),5 p20rr021954 (m . Sunkara a·j·莫里斯,s·s·史密斯),和T32HL091812 NIH(美国斯莱姆)。答:Salous和m . Panchatcharam)是由美国心脏协会的支持。本文的结果与资源支持工作和/或使用在列克星敦VA医学中心的设施。

利益冲突

作者没有一线潜在的利益冲突与提交的工作报告。美国美国史密斯已收到研究者发起的研究/拨款支持勃林格殷格翰集团无关的研究超过50000美元。

承认

作者感谢苏珊快速优秀的编辑援助。

补充材料

引用

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