在活的有机体内化学筛选造血和血液疾病的调节器

文摘

在活的有机体内化学筛选是一种广泛适用的方法不仅对解剖基因通路调节造血和血液疾病,同时也寻找关键部件的途径可能是药物调节。高通量化学筛选和灵巧的检测在斑马鱼胚胎、幼虫blood-cell-related表型是可行的。最近的两项研究利用表型化学屏幕在斑马鱼已经确定了几个化合物促进造血干细胞形成与逆转白血病造血表型的致癌基因,分别。这些研究说明在斑马鱼和有效的药物发现过程揭示小说生物作用的前列腺素E2在造血和白血病干细胞。此外,化合物中发现斑马鱼屏幕已经成为有前途的治疗候选人对白血病和包含在临床试验期间加强造血干细胞造血细胞移植。

1。介绍

斑马鱼已经有效地作为脊椎动物模型用于研究血液细胞发育和功能(评论[1- - - - - -5])。这是一个有利的模式,因为胚胎的光学清晰,和他们的前女友子宫内发展使简单和在开发过程中实时检测造血细胞。各种各样的工具和试剂已经发达了在活的有机体内标签和成像的血细胞和调查血液细胞功能(这些方法和协议的评审,看到6- - - - - -10])。此外,瞬时和稳定遗传操作可以联系造血基因功能(11- - - - - -16]。添加到这个阿森纳斑马鱼的研究工具在活的有机体内化学筛选[17- - - - - -20.]。通过公开斑马鱼胚胎化学库,生物活性化合物影响任何复杂的发育和生理过程可能被识别。此外,在活的有机体内化学筛选可用于揭示化学药剂,修改疾病表型的动物。产生一种独特的生物效应的化合物可以作为宝贵的探测识别生物学途径的关键组件,和化合物能够扭转疾病表型在活的有机体内可能有治疗潜力或阐明一种有效的治疗目标。这种创新的方法创造了一个独特的效用斑马鱼模型在化学生物学和导致其在药物发现的新兴角色(额外的评论[21- - - - - -24])。

2。基因与他们的功能:在活的有机体内化学屏幕与遗传屏幕

遗传和在活的有机体内化学屏幕可以用来解剖基因通路调节特定的生物过程。然而,一个在活的有机体内化学屏幕提供了时间控制的优势,传统的遗传屏幕不。在屏幕基因、基因功能从概念的影响。因此,在早期胚胎发育基因的作用可以使描述的角色在稍后阶段。另一方面,化学屏幕,化合物影响基因的功能可以在特定的时间点和固定期限选择的调查员,这样它的角色在不同的发展阶段可以清楚地确定。此外,在屏幕基因,蛋白质家族的角色有时可能掩盖了其家庭成员的功能冗余。然而,化学调节器可能表现出类似的活动对蛋白质家族中多个成员和,因此,揭示他们的在活的有机体内累积的角色。应该注意的是,一些化合物可能影响多个细胞蛋白质,因此他们的目标效果应该仔细核实使用额外的化学药剂以及遗传操作。综上所述,在活的有机体内化学屏幕可以补充传统的遗传方法和发现造血基因的遗传屏幕无法识别。

3所示。药物发现:在活的有机体内Phenotype-Based化学筛选和靶向性的方法

目前,最常见的方法识别潜在疗法是评论的目标导向的方法(见[25,26])。这种方法依赖于先天的理解疾病机制的了解一个特定的细胞成分有针对性。此后,铅化合物可能获得使用在体外或细胞化验,以确定绑定或目标活动的调制。通常,这些领导将再次使用这些分析进一步优化前的评估在活的有机体内疗效和毒性。目标采用这种方法往往是酶激酶可能等小分子绑定口袋(druggability更多讨论目标,看到评论(26,27])。蛋白质,没有一个明显的口袋里,如转录因子,通常通过招募其他代数余子式,无药可治有时被称为目标。

靶向性化学屏幕表现在体外或在培养细胞通常是非常有效的和样品能够通过成千上万的化合物。即便如此,许多候选药物识别失败,因为贫穷在活的有机体内效力,无法忍受副作用,或无法证明其临床有效性(评论[28,29日])。相比之下,化学屏幕中执行整个有机体可能识别工作药物具有更高的成功率在活的有机体内效力和毒性评估同时在主屏幕(30.]。此外,通过设计这些屏幕直接识别化合物已经证明了他们的扭转疾病表型的有效性在活的有机体内。而不是研究一个目标在目标导向的方法,在活的有机体内筛选能够询问任何一个生物系统可能存在的潜在的治疗靶点调节疾病表型,包括目标non-cell-autonomous的方式行动。在很多情况下,疾病的病理机制并不完全理解,所以缺乏规律的方法。在活的有机体内化学筛选,相反,可以执行前一个有效分子的目标是识别。

虽然在活的有机体内筛查发现有效的药物的可能性有了好的候选人,找出他们的行动模式可以是一个挑战。大量的工作通常需要识别候选化合物的分子目标。然而,由于一些重要的分析工具,包括质谱研究的发展,蛋白质组学、基因组学、代谢组学、表现的分析和化学信息学以及小说在活的有机体内标记方法,目标识别的效率和成功率近年来显著提高(31日- - - - - -34]。此外,在活的有机体内化学组成的屏幕有时会使用化学库执行已知的生物活性化合物,这样信号通路介导疾病表型可以很快发现一次化学抑制表型的识别。

4所示。非常高效。在活的有机体内化学筛选斑马鱼

一些可以用于生物模型在活的有机体内化学筛选果蝇,秀丽隐杆线虫和胚胎/斑马鱼(鲐鱼类)(审查[35])。这些模型都有大规模筛选所需的可伸缩性。其中,斑马鱼是唯一的脊椎动物模型,因此具有最接近生理与人类的相似之处。

斑马鱼的特点,使高效在活的有机体内化学筛选多个。第一个是他们的繁殖能力。一双斑马鱼可以每周生产100 - 200的胚胎,所以即使一个中型水族馆几百条鱼可以产生每周数以千计数以万计的胚胎筛选。第二,斑马鱼胚胎很小。一般3 - 5个胚胎可以排列在一个包含100 - 200的96孔板μL鱼的水。此外,大多数cell-permeable小分子(辛醇:水分区值,或零度以上)可以穿透即使在斑马鱼胚胎绒毛膜[36]。因此,化合物可以直接添加进周围的水的胚胎。对屏幕进行10 - 96 -孔板μM浓度,只有1 - 2毫克的每个化合物需要筛选。此外,斑马鱼发展迅速,受精后胚胎/幼虫在1 - 5天(dpf)已经拥有各种功能的生理系统。短期发展时间显著凝结实验所需的时间。图1显示一个模式在活的有机体内化学筛选斑马鱼。

的化验工作在活的有机体内筛选将取决于感兴趣的表型。例如,转基因线表达荧光蛋白的细胞类型特异的启动子的控制下可以用来追踪特定细胞类型的生产或位置。因此,斑马鱼pu.1,gata1,mpo,lyzC,csf1r,rag2,lck,CD41,或sci记者线等可用于识别化学调节器的骨髓细胞,红细胞、中性粒细胞、巨噬细胞、T细胞,thrombocytes,或hemangioblasts分别37- - - - - -45]。包埋疣状和RNA原位杂交也可以用来检测细胞增殖、细胞分化标记物的表达。甚至是一个广泛的生理输出和响应可能用作筛选读数,如chemical-induced小肠结肠炎,创伤性炎症,host-pathogen互动,激光血栓形成(46- - - - - -52]。这些化验可能处理自动化液体处理机器或可以使用自动成像系统记录和分析使用定制的软件(51,53- - - - - -56]。因此,在斑马鱼进行化学筛选确定调节器具有巨大应用潜力的造血和血液疾病。

5。考虑筛选设计,评估,和翻译给人类

5.1。检查设计

就像在任何其他类型的化学屏幕,点击获得的质量在斑马鱼屏幕可以直接影响筛选设计。例如,如果一个屏幕是基于减少信号的记者分析,它可能是容易识别假阳性等有毒化合物。在这种情况下,一个快速的视觉扫描胚胎/幼虫的生存能力进行记者之前的分析可以帮助排除那些非特异性。此外,由于适当的胚胎发育取决于精确的执行多个顺序流程,化合物添加在不同的时间将有机会影响不同发展步骤。因此,化学处理的时间和持续时间也可能影响检测结果。如果屏幕上利用转基因线,应该包含额外的验证步骤检查是否达到化合物可能会影响启动子用于推动转基因或转基因本身的稳定性。例如,在一个屏幕,我们的表现,我们已经确定了几个热门抑制热休克的发起人用于驾驶致癌基因的表达而不是致癌基因的活动(20.]。只要有可能,积极控制应该用于验证斑马鱼模型具有相似的分子机械和药理反应人类一样(如果筛查的目的是药物发现)对生物过程进行调查。这事先确认的可能性将促进贴切地翻译结果从斑马鱼屏幕到人类的条件。

此外,重要的是要进行试点屏幕使用100300种化合物和未经处理的胚胎筛检板之一/幼虫评估筛查方法的鲁棒性和潜在的变量,包括自然变化的程度在不同的离合器胚胎/幼虫。飞行员屏幕也可能提供信息关于潜在的命中率。一方面,在活的有机体内筛选方法可能为确定化合物广泛撒网,引出phenotype-of-interest通过各种机制。另一方面,如果命中率高于1 - 2%,研究人员可能希望将二级筛查策略或考虑不同筛选方法为了限制打击那些可能潜在感兴趣的研究者。例如,我们以前后立即显示白血病致癌基因的表达AML1-ETO,gata1表达式是废除,而髓过氧物酶(mpo在稍后的时间点()表达式是增加57]。我们进行了化学抑制屏幕和识别各种化合物,可以恢复gata1表达式在AML1-ETO [20.]。我们也验证了治疗潜在的一些点击确认在这个屏幕上,和这些结果稍后将详细讨论。可以想象,一个化学抑制屏幕也可以逆转的基础上进行mpoupregulation斑马鱼模型相同。后者筛查策略不仅可以确定化合物直接对抗AML1-ETO还额外的影响化合物抑制的积累细胞通过AML1-ETO-unrelated机制。筛选设计的选择受到每个调查员的自由裁量权。

5.2。评估和翻译给人类

力量、有效性和特异性的确认从斑马鱼屏幕已经获得证明在活的有机体内。因此,这些热门的高概率的有效在活的有机体内系统。造血和其他nonhematopoietic这些候选化合物的影响应该在斑马鱼胚胎、幼虫进一步评估。候选化合物对细胞分化的影响,扩散,或者生存可以评估使用包埋RNA原位杂交,包埋疣状或与lineage-specific细胞学染料如苏丹黑染色中性粒细胞和o-dianisidine血红蛋白。这些在活的有机体内可能影响评估轻快地使用胚胎/斑马鱼。例如,我们发现AML1-ETO可以重组造血细胞命运的决定,将红色的细胞命运引起细胞的命运。我们还发现,nimesulide AML1-ETO化学抑制器,可以在斑马鱼扭转这些影响。AML1-ETO已表现出抑制红细胞分化在哺乳动物细胞中,我们已经证实nimesulide也可以反向AML1-ETO在培养细胞的影响20.]。候选化合物在白细胞或血小板功能的影响也可以评估在胚胎/斑马鱼使用中性粒细胞趋化性的损伤模型,吞噬的细菌感染模型,或激光凝固试验(47,58,59]。此外,lineage-specific造血细胞可以从控制和隔离compound-treated胚胎/幼虫各种荧光记者行前面提到的通过流式细胞术转录分析分析。有趣的是,nonhematopoietic效果有时可能会提供仪器信息的候选化合物的作用机制。例如,一个候选化合物会导致发育表型相似的其他基因突变或其他化学物质造成的表型与已知的生物活性,表明候选化合物通过类似的途径,因为这些其他调节行为。候选化合物的影响也可以评估在成年斑马鱼使用标准造血化验改编自小鼠模型,包括辐照其次是造血细胞移植和辐照复苏化验,以及白血病细胞异种移植和限制稀释移植(37,60- - - - - -64年]。斑马鱼提供调查员此时的灵活性来验证这些化合物在哺乳动物系统的影响。虽然之间的保护程度,斑马鱼和哺乳动物造血和许多造血细胞谱系的功能高,体液保护监管机构和适应性免疫系统目前不太清楚。然而,在这些地区快速发展的预期。对于那些生物过程已经证明是高度保守的,可译性的筛选击中斑马鱼和人类将可能会高。

6。斑马鱼造血和血液疾病在斑马鱼模型

6.1。造血作用

斑马鱼具有相似的一组血血统的哺乳动物(11,14,63年,65年- - - - - -71年]。基因参与血细胞发展斑马鱼和哺乳动物之间也是高度保守的72年,73年]。因此,它是一个合适的模型为研究基因通路调节造血和血液疾病。

与哺乳动物一样,斑马鱼胚胎发育期间,第一次表现出一种原始造血和后产生几个中间细胞类型,最终导致明确的造血作用(更详细的评论看74年,75年])。在原始造血作用,开始约11小时后受精(高通滤波器),斑马鱼胚胎产生骨髓细胞和红细胞在两个结构上不同的地方。髓细胞,表达的转录因子pu.1前侧板,形成中胚层(ALM),而红色的祖细胞表达gata1转录因子在侧板后形成中胚层(PLM)。它已经表明,血液造血细胞的命运在这两个群岛是由这两个基因的表达。虽然击倒pu.1在ALM诱导红细胞生成,击倒gata1促进骨髓形成在PLM (76年,77年]。这些结果表明,原始造血作用在斑马鱼胚胎产生bi-potent造血祖细胞。因此,这两个同步指定血液数量可能有助于识别重要的基因调节骨髓和红细胞细胞命运的决心。在本文后面的部分中,我们将讨论一项研究,利用这些细胞来揭示一些AML1-ETO致癌效应导致的急性髓系白血病(20.,57]。

在斑马鱼,多功能造血干细胞(hsc)起源于hemogenic主动脉内皮,这相当于aorta-gonad-mesonephros (AGM)在哺乳动物中78年]。使用在活的有机体内lineage-tracing实验,它已经表明,这些新出现的肝星状细胞将随后在瞬态造血组织被称为尾造血组织(本),这可能是与另一个哺乳动物胚胎造血网站在胎儿肝脏79年- - - - - -81年]。最后,从这些地区将迁移到肝星状细胞和种子两肾(相当于在哺乳动物骨髓)和胸腺,最后造血器官保持通过成年79年- - - - - -81年]。在哺乳动物中,斑马鱼肝星状细胞表达runx1和cmyb,runx1缺乏废除的造血作用在鱼78年,82年- - - - - -84年]。几个主要的信号通路调节HSC形成和体内平衡在小鼠模型也影响斑马鱼的HSC的形成,如刺猬(Hh)通路和Notch-Runx通路(78年,85年]。最近,一个在活的有机体内化学筛选斑马鱼已经确定prostaglandin-E2的重要作用——(PGE2) Wnt信号通路在肝星状细胞形成的19,86年),稍后将详细讨论。这些发现表明,斑马鱼和哺乳动物利用类似的基因回路调节HSC的形成。

6.2。血液疾病模型

由于从容检查血液细胞表型在斑马鱼胚胎,大量的血液突变体被孤立在三个大规模的遗传屏幕(11,14,87年,88年]。许多这些血突变体缺陷红细胞的成熟或铁运输,及其相关的表型和人类同源基因突变已定义89年- - - - - -91年]。转基因技术方法也被用于创建各种血液疾病模型在斑马鱼中,其中绝大多数是血液癌症模型(20.,38,57,92年- - - - - -96年]。在这些研究中,人类致癌基因的异位表达导致斑马鱼表型想起人类白血病的特点。此外,研究人员现在可以使用工程执行有效的靶向基因中断斑马鱼锌指核酸酶(ZFNs)和转录activator-like效应(故事)核酸酶(13,16,97年- - - - - -One hundred.]。在未来,这些血液疾病模型可以用于化学抑制屏幕。大量的研究工具在斑马鱼模型结合在活的有机体内化学筛选将被证明是有用的在提供新颖的见解和潜在治疗血液疾病的分子机制。

7所示。在活的有机体内造血干细胞(HSC)的识别化学调节器

化合物,可以增强HSC的形成和功能可能发挥疗效的患者造血细胞移植。北等人进行了化学屏幕识别小分子调节HSC在斑马鱼胚胎形成19]。在这项研究中,胚胎暴露11至36高通滤波器2357化合物从三个已知的生物活性化合物的化学库。正如上面提到的,肝星状细胞是cmyb⁺和runx1⁺和两个转录因子为HSC发展是不可或缺的。通过检查cmyb和runx1使用RNA表达原位杂交,作者发现35个化合物增加HSC数量减少和另一个47岁的化合物。根据已知的生物活性,他们发现10前列腺素类生物合成这些化合物的影响。环前列腺素,前列腺素类,包括前列腺素和血栓素,脂质介质,在炎症和其他生理反应扮演重要的角色。环氧合酶(cox),包括COX-1和cox - 2(也称为前列腺素G / H合酶1和2),花生四烯酸转化为前列腺素H2,然后可以由额外的酶代谢成其他前列腺素类(101年]。有趣的是,作者发现,虽然接触COX抑制剂塞来昔布和苏灵大等降低cmyb/runx1表达hemogenic主动脉,接触亚油酸、花生四烯酸的前体,增强它。之前它已经表明,前列腺素E2 (PGE2)是主要的前列腺素类在斑马鱼胚胎生产(102年]。因此,北等人证实HSC形成的前列腺素途径的参与孵化斑马鱼胚胎与PGE2或选择性COX-1和cox - 2抑制剂,以及遗传击倒的ptgs1和ptgs2分别编码COX-1和cox - 2蛋白。随后,作者调查的表达模式ptgs1和ptgs2,发现两种基因调节的明确的造血作用。而在肝星状细胞基因表达,ptgs1也是相邻内皮细胞中表达。这些结果强烈表明COX-1和cox - 2通过函数在肝星状细胞和促进HSC形成他们的利基。此外,Goessling等人表明,PGE2促进HSC激活Wnt /形成β连环蛋白信号通路(86年]。

在他们的屏幕上,北et al。也发现22个化合物可能通过调节HSC形成他们对血流量的影响,如化合物的影响α- - -β肾上腺素能受体,^{2 +}或Na⁺/ K⁺渠道、一氧化氮(NO)合成或血管紧张素通路(103年]。他们表明,血液流动产生积极的影响cmyb/runx1表达,这表明内皮的血流动力学的力量可能是一个出现的肝星状细胞的诱导因素。此外,作者发现没有捐赠者可以刺激HSC即使在形成沉默的心突变体,不表现出血液流动。使用马赛克移植实验,他们发现没有积极调节HSC通过细胞自动信号。

8。验证HSC化学调节器及其临床潜力

造血细胞移植(HCT)经常用于血液恶性肿瘤的治疗。肝星状细胞不仅自我更新,还会导致血液血统,可以重新填充整个造血系统。患者接受HCT需要接受myeloablation和治疗与免疫抑制剂同时预防移植排斥反应。至关重要的是,移植肝星状细胞在骨髓中有效地灌输。各种方法旨在提高在体外和在活的有机体内扩张的干细胞/祖细胞和他们的导航效率骨髓正在深入调查(104年- - - - - -107年]。肝星状细胞的化学调节器被北等人在斑马鱼代表另一个新的治疗机会。

北等人发现体外暴露小鼠骨髓(WBM)或纯林^{- - - - - -}Sca1⁺c - kit⁺(LSK)细胞dimethyl-prostaglandin E2 (dmPGE2),长期PGE2的导数,大大增加了祖细胞数量以脾移植后菌落在12天(CFU-S12)的老鼠。稀释使用限制竞争的重新分析,他们发现dmPGE2-treated WBM导致4 -肝星状细胞和增加2.3倍的接受者比未经处理的细胞在12和24周,分别在移植后(19]。定义的作用机制PGE2, Hoggatt et al。显示那体外接触PGE2促进HSC归航效率、增殖和生存在移植(108年]。

临床、HCT的来源包括骨髓动员外周血干细胞(MPBSCs),或人类脐带血(hCB)。在美国大约有20%的hct进行使用hCB [109年]。然而,复苏后hCB移植通常需要很长时间,因有限体积的来源。因此,Goessling等人继续表明dmPGE2可以增强hCB造血集落形成在体外及其在xeno-transplantation移植(110年]。有趣的是,作者发现hCB样品处理dmPGE2展出基因表达模式的肝星状细胞从血管利基(110年]。因为hCB既包含肝星状细胞和内皮细胞,作者假定dmPGE2可能促进HSC hemogenic内皮细胞形成,类似于在发展中斑马鱼胚胎的场景。另外,巴特勒等人表明,内皮细胞可以提供信号保留HSC multipotency [111年]。最后,Goessling等人提供证据证明临床前安全方案的非人类灵长类动物自体移植(110年]。因此,从最初发现使用一个在活的有机体内化学筛选斑马鱼,PGE2现在进入第一阶段的临床试验。

9。在活的有机体内急性髓系白血病(AML)的识别化学抑制

9.1。AML1-ETO AML和t (8; 21)

我们的实验室已经进行了一次在活的有机体内化学屏幕识别化合物能够扭转人类造血表型白血病致癌基因(20.]。AML1-ETO是一个融合基因产生的t(8; 21)(温度系数;如)染色体易位,是最常见的一个在AML易位产品。特别是,AML1-ETO表达占40%的AML工厂(French-American-British) M2亚型112年]。这些病人可表现为过多的细胞引起爆炸。

AML-1,也称为Runx-1是两个亚基形成heterodimeric转录因子称为核心绑定因素(CBF)。造血作用的CBF扮演着许多重要的角色通过调节造血基因表达(审查[113年])。已经表明,AML1-ETO施加显性负影响CBF功能;然而,最近的研究也表明,它产生的其他功能效应占致肿瘤性(114年]。表达AML1-ETO增强HSC扩张在体外和在活的有机体内并促进骨髓形成,同时阻止骨髓成熟(115年- - - - - -119年]。尽管深入研究基因调控由AML-ETO,到目前为止还没有有效的治疗目标验证在活的有机体内。因此,我们假定一个phenotype-based nonbiased方法等在活的有机体内化学筛选可能发现潜在的治疗和识别关键AML-ETO下游效应器。

9.2。斑马鱼模型AML1-ETO白血病

转基因斑马鱼行Tg (hsp:AML1-ETO)成立,使人类AML1-ETO heat-inducible表达式(57]。发现的表达在斑马鱼胚胎AML1-ETO导致造血细胞的积累后血岛(57,120年]。造血细胞的细胞学分析转基因胚胎的孤立显示丰富的未成熟的细胞很少见到在控制样本。此外,基因组表达分析发现了各种重要的相似之处的造血细胞转基因斑马鱼和人类t(8; 21)白血病细胞(57]。之前它已经表明AML1-ETO抑制红细胞分化人类多功能造血细胞(121年]。在斑马鱼模型中,发现AML1-ETO的差别导致了对这些gata1和upregulationpu.1在多功能造血祖细胞,这表明红细胞转换成髓细胞的命运。此外,积累造血细胞强烈表达了髓过氧物酶(mpo)基因,引起细胞命运的象征。一项研究表明,AML1-ETO会使c / ebpα,导致一块成熟的粒细胞AML细胞在人类t (8; 21) (122年]。在斑马鱼模型中,我们还观察到一个戏剧性的减少c / ebpα表达式,表明只有两天在斑马鱼胚胎表达后,AML1-ETO诱导引起爆炸的积累细胞类似于临床特征的人类AML t (8; 21)。

9.3。AML-ETO的化学筛选斑马鱼模型

图书馆2000生物活性化合物筛选使用Tg (hsp:AML1-ETO斑马鱼模型(20.]。筛选化合物添加到胚胎在12日至16日高通滤波器,其次是1小时的热处理诱导AML1-ETO表达式。15个化合物被恢复gata1以RNA表达的转基因胚胎原位杂化。我们发现的一些化合物影响斑马鱼的热休克反应,防止AML1-ETO表达式。此外,我们发现了一个组蛋白脱乙酰酶(HDAC)抑制剂钠丙戊酸钠的化学抑制AML1-ETO的效果。HDAC是一个已知的转录辅阻遏物的一部分与埃托奥AML1-ETO蛋白(123年]。它已经表明,招聘HDAC对AE至关重要的功能,这一个HDAC抑制剂trichostatin (TSA)诱导分化和凋亡t (8; 21) AML细胞株(124年]。我们先前已经表明,TSA也逆转了Tg的造血表型(hsp:AML1-ETO斑马鱼)(57];因此,丙戊酸钠钠的发现验证了生物相关性的化学屏幕上执行AML1-ETO斑马鱼模型。

nimesulide,有趣的是,选择性cox - 2抑制剂,还确定了这个屏幕(20.]。随后,我们表明,与吲哚美辛治疗(非选择性COX抑制剂),ns - 398(选择性COX - 2抑制剂)和nimesulide不仅恢复gata1表达式也抑制表达增加mpo在转基因胚胎。此外,我们证明了这些药物对目标的影响是,因为他们可以通过补充下游代谢物PGE2。因此,造血分化AML1-ETO引起的缺陷在活的有机体内可以通过抑制COX获救的酶。

10。验证AML化学抑制及其临床潜力

因为COX抑制剂得分打在我们的屏幕,我们调查了考克斯基因编码蛋白质,发现ptgs2但不是ptgs1表达显著调节造血细胞的Tg (hsp:AML1-ETO斑马鱼)(20.]。这一发现的时候,很少了解的潜在贡献考克斯在AML白血病生成酶,虽然超表达COX - 2在各种类型的报道上皮肿瘤,包括结直肠癌、乳腺癌(125年,126年]。此外,PGE2已被证明能够促进结肠癌细胞生长通过一个β-catenin-dependent信号通路(127年,128年]。在斑马鱼中,我们发现AML1-ETO诱导ptgs2但不是ptgs1表达在人类骨髓白血病K562细胞株(20.]。AML1-ETO诱导的活动β连环蛋白的记者,在这些细胞,抑制红细胞分化和两个效果可以废除ns - 398。随后,我们发现的遗传击倒β连环蛋白获救AML1-ETO在斑马鱼胚胎的影响20.]。因此,通过cox - 2 / AML1-ETO影响造血分化β连环蛋白通路在斑马鱼和人类白血病细胞。

出版以来,这些发现,我们还得到了强有力的证据表明AML1-ETO信号通过cox - 2 /β连环蛋白途径在小鼠骨髓细胞(Zhang et al .,未发表的结果)。我们发现COX抑制剂能有效抑制体外造血干/祖细胞表达AML1-ETO系列金属堆焊以及AML1-ETO-mediated在各种肿瘤发生在活的有机体内小鼠模型(Zhang et al .,未发表的结果)。最近的两项研究也探讨了考克斯酶和角色β连环蛋白在白血病干细胞表达其他白血病致癌基因(129年,130年]。在一个研究中,王等人表明MLL-AF9融合癌蛋白或coexpression Hoxa9和Meis1a可以诱导ptgs1表达和β连环蛋白激活。此外,抑制COX活动使用消炎痛减毒引起的白血病发展MLL-AF9或coexpression Hoxa9和Meis1a致癌基因(129年]。在其他研究中,Steinert等人发现,非选择性COX抑制剂苏灵大预防β连环蛋白被激活和减少在活的有机体内肝星状细胞表达PML / RAR的增长或PLZF / RARα致癌基因(130年]。

总的来说,这些结果表明,抑制COX酶使用非甾体类抗炎药(非甾体抗炎药)可以抑制致癌作用和β连环蛋白激活在AML白血病干细胞。有趣的是,案例研究也表明逆非甾体抗炎药的使用和AML发病率之间的关系(131年,132年]。尽管PGE2可以诱导β连环蛋白表达和增强HSC的某些方面的功能正如上面所讨论的,它已经表明,损失β连环蛋白并不影响正常的造血作用在成年老鼠133年- - - - - -136年]。目前,一个主要障碍AML患者获得长期生存的复发。尽管化疗能有效诱导缓解在大多数患者中,超过50%的患者体验后一年内复发缓解(137年,138年]。总之,这些结果表明,非甾体抗炎药可能损害白血病干细胞功能,因此他们应该探索在预防AML复发的临床疗效。

11。最后考虑斑马鱼的药物发现

在本文中,我们提出了两个具体研究造血作用,适当的例证斑马鱼胚胎的总效用和表型在活的有机体内化学筛选发现潜在的新疗法。在这些情况下,使用一个在活的有机体内筛选平台允许化合物的识别可能noncell自治的方式,如血流动力学行为力量,绕过了众所周知的技术困难参与培养造血或白血病干细胞,也无药可治规避赋予的障碍目标或未知疾病机制。这两个研究发现新颖的生物机制以及临床治疗使用强有力的候选人。重要的是要注意,斑马鱼模型的最有利的特性出现在它的胚胎和幼虫阶段。因此,一种疾病表型在调查中要体现在这些阶段为了最有效地利用化学筛选。以来众多信号通路作用在斑马鱼在早期发展也可能扮演了一个重要的角色在成年人和保持体内平衡可能中断或重新激活在疾病进展,代孕胚胎表型常常可以非常有用的识别潜在疾病的调节器。例如,化合物抑制t细胞发育在斑马鱼胚胎可能证明有效的抑制效应对t细胞白血病(18]。总的来说,药物发现在斑马鱼受益于高通量化学筛选的可行性,更接近生理相似比无脊椎动物对人类的筛选策略,并且能够创建复杂的疾病模型不可以实现的在体外。造血表型检测的可能性更大范围的使用创新化验承诺对斑马鱼的角色越来越在未来的药物发现过程。

利益冲突

作者声明没有竞争的经济利益。

确认

作者感谢Taneli Helenius,卡罗琳·伯恩斯,兰德尔·彼得森有用的评论在纸上。资助这项工作是由美国国家卫生研究院提供赠款R01 CA140188 (J.-R。j .叶),K01 AG031300 (J.-R。j .叶)和马萨诸塞州总医院(J.-R Claflin于杰出学者奖。j .叶)。

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