内源性逆转录病毒的基因组扩增斑马鱼t细胞恶性肿瘤

文摘

基因组不稳定性在肿瘤形成中起着至关重要的作用。不良基因突变可以禁用一些收购和其他不当激活。此外,染色体重组可以放大、删除甚至融合基因,改变他们的功能和导致恶性表型。使用阵列比较基因组杂交(aCGH)技术检测数值差异不同的DNA样本,我们检查了从斑马鱼基因组(鲐鱼类三)t细胞白血病癌变。在所有恶性肿瘤测试,我们发现斑马鱼内源性逆转录病毒的反复出现的放大。ZFERV,这种逆转录病毒首次发现是由于高表达的前病毒的成绩单在胸腺组织的幼虫和成虫的鱼。我们确认ZFERV放大DNA的定量PCR分析野生鱼组织和正常和恶性d .鱼类T细胞。我们也量化ZFERV RNA表达,发现正常和肿瘤T细胞产生逆转录病毒编码的记录,但大多数癌症显示转录显著增加。总的来说,这些数据暗示ZFERV放大和转录可能与t细胞白血病生成。根据这些数据和ZFERV的系统发育关系gammaretroviridae murine-leukemia-related病毒类的病毒,我们认为ZFERV可能通过插入突变致癌机制。

1。介绍

斑马鱼是一种新兴的动物模型研究淋巴细胞癌症。具有里程碑意义的2003年第一次描述了,转基因小鼠Myc(mMyc)misexpression可以诱导D。鱼类t细胞急性淋巴细胞白血病(t) [1]。从最初的报告,描述了几个其他斑马鱼模型,利用转基因哺乳动物TEL-AML1(人类),NOTCH1(人类),MYC(小鼠和人类),AKT2(小鼠)以类似的方式2- - - - - -5]。此外,我们使用一个表型突变屏幕创建三个进一步斑马鱼模型与遗传t倾向(6]。除了一个上面所提到的八行容易t,不是B-cell-lineage癌症。像人类所有,d .鱼类所有经常出现在或扩散到胸腺,形成肿瘤。因此,这七个斑马鱼行实际上更准确的模型两个相关淋巴细胞恶性肿瘤,t, t细胞淋巴细胞淋巴瘤(T-LBL)。事实上,mMyc斑马鱼甚至被用来研究分子之间的过渡变化,伴随T-LBL和t [7]。

因为所有的分子起源和T-LBL并不完全理解,这些斑马鱼模型提供机会来调查这些疾病的遗传基础的肿瘤形成。此外,他们也便于调查旨在揭示特性与t和T-LBL相关进展。例如,在上述研究中,冯BCL2等人证明了变化,S1P1,和ICAM1表达与自噬,细胞间粘附,和血管内入侵,从而管理T-LBL t转换(7]。同样,古铁雷斯等人使用转基因斑马鱼t研究MYC-driven癌症的依赖Pten和一种蛋白激酶疾病进展(持久性5]。

虽然这两个研究利用d .鱼类模型来调查疑似重要候选基因疾病进展,斑马鱼t细胞癌症也可以作为候选基因发现的一种手段。在自己的工作中,我们利用串行allo-transplantationd .鱼类t作为实验模型方法临床侵略性的肿瘤(8]。类似的策略一直受雇于其他组,使用连续allo-grafted小鼠t细胞淋巴瘤或xeno-transplanted人类免疫缺陷小鼠t成(9,10]。在我们的研究中,我们进行了aCGH寻求获得基因组变化连续通道d .鱼类人类t t和耐火材料/复发。几个候选基因达到这一标准,包括C7orf60(斑马鱼同系物动作:153606年),一个基因的扩增与加速t进展在鱼类和劣质的结果在人类所有患者(8]。

虽然我们的研究集中在获得拷贝数畸变(CNAs)共享的斑马鱼和人类所有,我们还发现了其他基因的扩增和删除只在看到d .鱼类癌症。其中,两个重复拷贝数获得被观察到在每个样本,和进一步的调查我们发现,这两个地区与相同的内源性逆转录病毒(ERV)。这些基因整合前病毒预计2 - 4在斑马鱼基因组中整合网站(11),其倍性和基因组动物个体之间的位置可能不同,复杂的调查。在本文中,我们使用两个独立的方法表明,该multicopy ERV经历进一步放大在正常和肿瘤斑马鱼T细胞,从而创造新的和潜在的致癌集成。一些癌症显示ZFERV拷贝数很高,远远高于在T淋巴细胞。我们还演示逆转录病毒编码的rna的表达正常和癌变d .鱼类T细胞,大多数恶性肿瘤显示显著升高前病毒的转录相对于正常T细胞。ERV我们的研究结果,进一步描述,将基本了解这生物活性逆转录病毒影响正常和恶性斑马鱼T淋巴细胞生物学。

2。材料和方法

2.1。斑马鱼线和护理

成年的鱼五d .鱼类行分析:正常伟嘉的压力lck::EGFP鱼(12),ENU表示突变线绿巨人,怪物史莱克,奥斯卡(hlk,srk,otg;所有伟嘉背景)[6),而rag2::MYC-ER×lck::EGFP鱼(珠母贝×伟嘉混合)[5]。鱼被安置使用标准条件(28.5°C, 14小时。光/ 10人力资源。黑暗的昼夜周期)在犹他大学的殖民地的斑马鱼核心设施。在荧光显微镜下检查,鱼类和0.02%三卡因麻醉显示(MS222)和安乐死与解剖前冰水。动物被处理根据国家卫生研究院的指导原则,在一个批准的协议(IACUC # 08 - 08005)由犹他大学动物保健和使用委员会。

2.2。解剖和Fluorescence-Activated细胞排序(流式细胞仪)

斑马鱼thymi和绿色荧光蛋白⁺肿瘤的解剖,制备单细胞悬浮体和流式细胞仪进行如前所述6]。BD FACSVantage和FACSAria II SORP (Becton Dickson)仪器被用于流式细胞仪。GFP强度和边- GFP和向前散射控制参数⁺淋巴细胞集合。

2.3。核酸方法进行了净化

提取基因组DNA, aCGH qPCR FACS-purified GFP⁺T细胞和匹配的尾翼组织使用DNeasy血液和组织工具包(试剂盒)如前所述8]。从FACS-purified提取的总RNA中存在化验是T淋巴细胞和T细胞癌症与试剂盒(英杰公司)或RNeasy Mini-Kit(试剂盒)根据制造商的指示。RNA样本处理RNase-Free DNase(试剂盒)存在之前根据制造商的指示。

2.4。阵列比较基因组杂交(aCGH)

基因组DNA与BioPrime贴上标签工具包(表达载体),纯化,量化,杂化Zv6-based斑马鱼基因阵列(罗氏)此前报道8]。数组使用G2565CA微阵列分析SureScan高分辨率扫描仪系统使用安捷伦科技(安捷伦)和归一化特征提取软件。人类基因组进行分析使用等级分割算法和Nexus拷贝数5.0软件(BioDiscovery)。aCGH方法的详细描述和拷贝数分析执行中可用的补充部分报告Rudner et al。8]。

2.5。定量聚合酶链反应(qPCR)

一个LightCycler CFX96 (Bio-Rad)是用于qPCR化验。短暂,智商SYBR绿色Supermix (Bio-Rad)被用来放大来自各种组织类型的基因组DNA。合并胸腺细胞DNA(限制样本)spectrophotometrically量化,然后稀释1:100年qPCR使用。尾翼的DNA组织和GFP⁺肿瘤细胞浓度稀释至相同,2μ每个DNA用于L反应总卷25μL,根据制造商的指示和其他组件。所有的反应都是一式三份。SYBR绿色信号被用来推导相对ZFERV拷贝数的估计。因为真正ZFERV拷贝数是未知的,值是任意标准化为1复制/单倍体基因组。因此,ZFERV相对拷贝数等于3表明三倍ZFERV副本/基因组(例如,如果生殖系/单倍体基因组拷贝数= 3副本,ZFERV相对拷贝数= 3表示9册/单倍体基因组)。所有qPCR结果与波尔和env被归一化elf2a,出现在1复制/d .鱼类单倍体基因组。引物和反应条件如下:向前波尔底漆:CGC-CCC-ACA-CAT-CAC-ATA反向波尔底漆:CAA-CCA-TCA-CAG-AAC-AGA向前env底漆:ATG-TTT-GGG-GAA-TGG-AAG-G反向env底漆:TTT-GAT-AAG-GAG-GTG-GGT-TTT向前elf2a底漆:TGG-AGG-TGG-AGG-TGA-GAA-CT反向elf2a底漆:GAG-TGG-TTG-TGT-AAG-CAT-TTC-G变性:95°C×3分钟40个周期:95°C×10秒59°C×40秒融化曲线analysis-55°C - 95°C。

2.6。定量逆转录聚合酶链反应(存在)

总RNA (200 ng /样本)从FACS-purified正常和恶性T细胞与iScript化验一步法rt - pcr工具包SYBR绿色(Bio-Rad)使用上述设备。反应是一式三份。结果与波尔和env被归一化elf2a在并行存在化验。2表达褶皱变化计算^−ΔΔCt方法。引物和反应条件如下:向前波尔底漆:CAG-CAC-AAA-CGA-AAA-TGG-TCT反向波尔底漆:TGG-CTC-CTC-AGT-GTC-TCC-TT向前env底漆:AGA-GGG-AAA-GGA-TGG-GAT-GT反向env底漆:TGT-TGG-ATG-TGG-TCT-GGT-CT向前elf2a底漆:ATG-AGA-CAA-TGG-GGA-GAG-CA反向elf2a底漆:GGA-TGC-GGC-TGG-AGT-TTC变性:95°C×5分钟40个周期:95°C×10秒52°C×10秒72°C×30秒融化曲线analysis-55°C - 95°C。

2.7。统计分析

学生的以及被用来比较不同基因组相对拷贝数或褶皱RNA表达的变化。值被认为是重要的。

3所示。结果与讨论

我们之前执行一个ENU-mutagenesis表型屏幕设计识别异常t细胞表型。我们的屏幕上发现了三个d .鱼类行(srk,hlk,otg)倾向于t细胞恶性肿瘤,特别是t和T-LBL [6]。调查non-germline获得基因变化发生在这些癌症,我们使用aCGH比较DNA肿瘤和正常组织的个体鱼的这些行。这些实验显示几个同源基因通常放大或删除在斑马鱼和人类t [8]。

在这些研究中,> 98%d .鱼类与不良基因获得CNAs也可识别的人类。然而,两个异源基因区域独特的斑马鱼也特别有趣。这些位点表明斑马鱼8/8 t细胞癌症基因组拷贝数增长相对良性的组织的DNA来自同一动物(图1)。值得注意的是,从所有三行(3/3 T-ALLssrk,3/3hlk,2/2otg)表现出这两个地区的拷贝数增加,建立这些基因组扩增获得一致的特性在t细胞癌症起源于不同的遗传背景。我们的aCGH实验用罗氏微阵列平台由Zv6基因组组装。我们后来发现探针显示放大信号被错误地分配到不同的地区在染色体7和14日(杂交数据图中描述1)。然而,细看这些探测器实际上来自一个大约11 kb,轨迹。有趣的是,这个区域对应于一个基因整合逆转录病毒元素被称为ZFERV沈和斯坦纳,命名为这样的因为它是第一个,到目前为止只描述斑马鱼内源性逆转录病毒(11]。

在仔细观察六aCGH探针序列局部这些两条染色体,我们意识到他们实际上的形式分布于整个ZFERV基因组(图2)。集体,我们与这6个探针杂交结果提供令人信服的证据表明,整个ZFERV轨迹在斑马鱼的基因组进行体细胞放大t细胞癌症。因为我们内部aCGH数据归一化通过比较每个癌症的DNA配对罹尾翼DNA相同的鱼,我们的结果不受可能ZFERV拷贝数变异(CNV)之间可能存在不同的动物。然而,由于歧义有关初始(即。,germline) ZFERV copy number in individual fish, it is impossible to deduce the absolute number of copies gained by each cancer. Instead, our findings are limited to the conclusion that ZFERV has been amplified, relative to the original number of ZFERV copies, in 8/8 T cell malignancies tested. Moreover, because “normal” ZFERV copy number and genomic locations may vary between fish or between strains, thus far, determining absolute ZFERV copy number prior to oncogenesis has been challenging.

加强这一问题的复杂性,以往d .鱼类基因组构建显示ZFERV在多个地点在每个装配,并在几个不同的连杆组(LG 1、5、7、14、15、16、17日和22日)。本质上很难准确地映射像ZFERV multicopy位点,这是更费力的序列组成。ZFERV港口几个冗余序列跟踪,包括5′和3′末端长重复(公升)和一个517个基点重复区域(RR)包含9个连续重复元素(参见图2)。当加上潜在可变性造成毒株特异性ZFERV集成,这也许是可预测的,ZFERV没有得到明确的染色体图(s)的位置。因此,当前实际上抑制ZFERV NCBI斑马鱼基因组序列和管理他们不会出现在Zv9组装。

在原来的报告描述ZFERV,沈和斯坦纳进行研究解决这些问题的一些关于拷贝数和基因定位:证明ZFERV融入d .鱼类生殖系,他们几个图宾根(Tu)鱼的精子DNA测试和验证集成网站常见的基因(11]。此外,利用南方滴涂基因组DNA,他们发现2 - 4 ZFERV乐队组合env调查,这意味着每单倍体基因组(最多四个逆转录病毒复制11]。然而,并不是所有你鱼显示相同的杂交模式。这可能是由于限制酶位点多态性在你紧张但也可能表明,不同的鱼,即使相同的应变,可以拥有不同的ZFERV拷贝数和集成网站。此外,当南方LTR-based探针进行杂交过程,8 - 10乐队。最多的不是这些实体)是由不同的共享你鱼(11]。与之前结果一样,这一发现可能是由于在ZFERV拷贝数变异和基因位置不同的鱼。必须考虑的另一个解释是,同源公升逆转录病毒和/或其他相关完整ZFERV前病毒的基因组(≥1 LTR,但没有env)将产生一个类似的实验结果。

尽管这些不确定性,我们的aCGH数据仍然令人信服的证据的不良ZFERV放大d .鱼类t细胞癌症。没有我们的aCGH探针对应LTR序列,和5/6来自逆转录病毒呕吐,波尔,或env基因(图2)。此外,即使重复元素被用于杂交过程,我们的方法比较肿瘤罹DNA从同一动物设计规范化CNV差异不同的鱼。因此,我们得出这样的结论:斑马鱼t细胞恶性肿瘤获得non-germline ZFERV副本在受精后,但无论放大之前,导致肿瘤形成尚不清楚。

因为ZFERV转录发生在正常斑马鱼T细胞(11),我们很好奇是否正常d .鱼类T淋巴细胞也可能ZFERV副本收益。以确定逆转录病毒放大也发生在nonleukemic T细胞,我们调查了ZFERV正常斑马鱼T淋巴细胞。模仿我们aCGH比较,我们开发了定量PCR (qPCR)化验两ZFERV基因组区域。使用和收益被aCGH癌症的DNA,我们验证了这些化验检测ZFERV拷贝数增加的能力(数据没有显示)。接下来,我们使用这些qPCRs扩增子的波尔和env区域(位置如图2)检测基因组DNA从野生型尾翼组织和FACS-purified T细胞(WT)成年斑马鱼。胸腺细胞来自WT伟嘉d .鱼类携带一个lck::EGFP转基因(12]。由于斑马鱼lck启动子是T细胞特定的,从这条线是GFP T淋巴细胞⁺。但是,与鱼T或T-LBL,成人(> 6个月大的时候)WT鱼T细胞明显减少(大约5×10⁴绿色荧光蛋白⁺胸腺细胞/鱼;我们的未发表的观察)。因此,我们从几个WT鱼汇集胸腺组织流式细胞仪方法进行了净化。然后我们分析扩增子从ZFERV地区独立检测拷贝数的差异。

尾翼dna单独或以小组进行测试,以确定是否有明显的生殖系CNV伟嘉应变鱼(图的差异3,通道1 - 6和8 - 10)。看到这些数据,qPCR波尔(图3(a))env(图3(b))显示小偏差不同伟嘉鱼的鳍DNA之间,这意味着CNV在这些病毒亲缘动物最小(车道7和11)。因为拷贝数很均匀,这进一步表明,ZFERV放大不发生在鳍的组织。因此,我们得出这样的结论:在鳍ZFERV地位组织可能代表真正的生殖系拷贝数,这个水平是相对稳定的个体之间的鱼。

相比之下,这些相同的WT鱼的正常T细胞集中显示重要ZFERV收益相对于垂直翼DNA(图3道12日,13)。平均而言,伟嘉T细胞有2 - 3重尽可能多的ZFERV副本匹配尾部DNA(比较巷11到14)。由于生殖系拷贝数是未知的,我们无法推断ZFERV副本的实数在这些T细胞。尽管如此,如果之前数据显示2 - 4份/单倍体基因组是准确的(11),这些结果表明正常T细胞可能平均12份单倍体基因组,或24份/二倍体T细胞。如果正确的,这将计算16个新的ZFERV集成,平均在每个T细胞。

因为我们使用T淋巴细胞汇集来自几个伟嘉鱼在这些研究中,我们不能明确得出结论是否所有动物的T细胞孔ZFERV放大的证据。可能只有一个或几个鱼ZFERV收益,从这些鱼扭曲与DNA平均上升。然而,即使在一个鱼,T淋巴细胞构成nonclonal人口。这是接轨——或许甚至可能ZFERV拷贝数变化在细胞间的基础上。ZFERV放大可能发生在T细胞本身;或者,他们可能会早些时候发生在造血干细胞/ T细胞祖细胞分化谱系。我们没有测试前兆群体,这些是无法获得的d .鱼类由于缺乏抗体的细胞表面受体。无论其精确的时机,我们得出这样的结论:胸腺细胞获得额外的基因组ZFERV副本在受精后,就像那些发现在我们aCGH分析斑马鱼t细胞癌症。

值得注意的是,有先例证明ZFERV活跃在斑马鱼T细胞。这种逆转录病毒最初发现从胸腺cDNA文库,成年之后d .鱼类胸腺已减去对为期两天的postfertilization (dpf)幼虫鱼,尚未开发T淋巴细胞(11]。本研究确定了43只与成人胸腺cDNA克隆。其中,21个克隆还显示thymus-specific 7-dpf染色原位杂交过程(ISH)。测序后,沈和斯坦纳认为的21个克隆来自各种领域ZFERV基因组(11]。所以,不仅是ZFERV转录7-dpf和成人胸腺细胞,这些细胞的表达明显高于其他组织通过这两个方法。随后伊什实验4-dpf 5-dpf,三月大的幼鱼,以及北部的RNA印迹成年鱼胸腺细胞,证实这些发现(11]。这些先前的研究和自己的新发现表明,ZFERV高度转录的幼虫和成虫d .鱼类胸腺细胞,ZFERV放大发生在斑马鱼的基因组正常和恶性T细胞。

进一步扩大我们对这些现象的理解,我们下一个比较ZFERV放大癌变胸腺细胞和肿瘤T细胞WT T细胞。这些实验中,我们使用qPCR化验对比ZFERV拷贝数在另外两个t细胞恶性倾向,hlk和MYC-ER。这些线都是容易T-LBL T,允许ZFERV量化中,“癌变前的”T淋巴细胞,和恶性T细胞。所有MYC转基因鱼肥厚性thymi,这可能反映了t细胞异常增殖和生理学。相比之下,hlk鱼携带一位身份不明的突变,显示正常thymi,和癌症易感性的分子基础是未知的。t或T-LBL折磨大约35%的hlk比如一年(6),反映要求额外的突变促进恶性转变[8]。相比之下,WTlck::EGFP鱼很少开发t细胞癌症(< 0.1%,未发表的观察),有正常的t细胞发育和生理12]。因此,使用这些样品我们可以调查是否正常,不正常,肿瘤T细胞都表现出相似的程度的ZFERV放大。

在早期的实验中,我们检查了尾翼从个体鱼确定ZFERV生殖系的变化。尾巴从单hlk和MYC-ER鱼(数据4和5道3 - 8)展示了动物之间的拷贝数一致。此外,这两个hlk和MYC-ER反面有ZFERV CNV类似WT伟嘉线(比较巷1到其他白人酒吧人物4和5)。基于这些结果,相同的波尔和env地区,我们得出这样的结论:所有三行有大约相当于ZFERV生殖系的副本。在汇集癌变前的T细胞(即。胸腺细胞,hlk和MYC-ER鱼缺乏肿瘤或其他non-thymic GFP),相对于垂直翼DNA基因组ZFERV再次升高相同的鱼(数字4和5,比较灰色酒吧道白色条车道3 - 8 - 11)。总的来说,大致意思是t细胞ZFERV拷贝数三倍以上生殖系在WT,高4倍hlk,5倍增加MYC-ER(两个数字比较巷9到12)。WT以来,hlk,MYC-ER胸腺细胞显示大约相当于收益,我们推断基因整合也不是明显增强T淋巴细胞的癌变基因型。因此,虽然逆转录扩增显然是一个共同特征d .鱼类T细胞,癌症易感性可能并不直接来源于增加易感性ZFERV集成,因为这些事件显然经常发生在正常T细胞。然而,它似乎是合理的,癌症诱发突变和ZFERV拷贝数涨幅可能合作促进T细胞的恶性转化,当放大均匀出现在每一个T aCGH样品检查。

调查实际如何比较WT T细胞和癌变肿瘤hlk和MYC-ER行,我们也从这些相同遗传背景分析恶性肿瘤。我们进行了波尔和envqPCRs 3hlk和5MYC-ER鱼,每一个都有大型胸腺肿瘤和/或广泛的GFP⁺疾病extra-thymic地区数据4和5)。尾部DNA从这些8鱼都有类似的生殖系ZFERV内容之前测试尾翼样本(比较车道在图13 - 154及线路图5其他白色的酒吧在这两个人物)。就像hlkT淋巴细胞,hlk癌症ZFERV放大(图4道16)。然而,在涨幅大小相似hlk癌变前的T细胞(比较巷12和19)。在MYC-ER癌症,ZFERV收益也发现(图5道在18到22岁的)。就像在hlk良性和恶性MYC-ERT细胞并没有显示出明显的拷贝数差异(比较巷12 - 23)。

我们还测试了2 qPCR其他恶性肿瘤。在一个发票上lck::EGFP鱼,我们注意到一个大GFP⁺胸腺肿瘤。在我们的经验中,t细胞的自发发生癌症WT鱼是极其罕见的,所以我们用这个机会调查是否ZFERV放大陪这个事件。尾部DNA表示这种动物ZFERV正常生殖系(图的内容6比较巷1和9),这条鱼的恶性T细胞显示大约5.5倍高拷贝数(巷10)。这种程度的放大大约是两倍的正常伟嘉T细胞,更典型的副本在相似MYC-ERT细胞和癌症(比较巷10车道4、6和8)。然而,因为这个结果只反映了一个肿瘤,没有可以得出一般结论逆转录扩增的罕见癌症WT鱼。最后,在一个额外的hlk癌症,我们发现ZFERV相当高的水平,显示25到30倍放大上面生殖系(车道11和12)。这种程度的拷贝数增加十倍高于其他9 T-ALLs我们通过qPCR检查,测试或8 aCGH之前。尽管如此,这个罕见的场景显然表明ZFERV可以寄生于斑马鱼基因组以引人注目的方式,这种癌症可能港口多达50 - 100新收购的逆转录病毒复制。

综上所述,我们得出这样的结论:几乎所有MYC-driven,hlk- - - - - -,srk- - - - - -,otg全身,甚至自发斑马鱼t细胞癌症有ZFERV放大。然而,由于几乎所有良性皮肤癌,恶性T细胞表现出相似的基因水平,ZFERV放大的绝对数量似乎没有一个重要的致癌因素。这并不奇怪,因为它可能是该网站而不是集成的数量是至关重要的因素。追求这个前提,可以确定新的位点ZFERV集成到癌症基因组,假设这些可能撒谎附近或在原癌基因或抑癌。我们启动了这样的研究,他们目前正在进步。作为一个兼职,我们选择调查ZFERV-derived rna转录。我们推断,集成到转录宽容基因组网站可能伴随着ZFERV RNA表达增加,这可能预示着“活跃”前病毒的复制。虽然这些插入可能不表示地点致癌基因或肿瘤抑制住,它可以作为代理ZFERV子基因组整体效能。如果是这样,这个预测癌症ZFERV转录会高于正常T细胞和癌变前的T淋巴细胞。

进行这些研究,我们开发了定量逆转录-聚合酶链反应ZFERV(存在)波尔和env基因(扩增子位置如图2)。至于qPCR,我们使用池正常T细胞从WT伟嘉鱼作为我们的参考。回忆,即使正常T淋巴细胞高表达ZFERV成绩单(11),所以这些rna已经充足的细胞作为我们的标准。结果波尔和env两个集合t细胞之间是高度可再生的不同组的样本WT鱼,这个值是任意指定一个表达式1水平(图7通道1和2)。相比之下,混合癌前期T细胞hlk鱼展出约6倍和7倍提高波尔和env分别转录(巷3,白色的酒吧)。同样,汇集癌变前的T细胞MYC-ER鱼也有更高的ZFERV成绩单(巷9;波尔:增加9倍,env:增长了2.5倍)。因此,尽管ZFERV基因组扩增没有令人印象深刻的WT与癌变之间差异的T细胞(3 - 5倍;图6),表达逆转录病毒的成绩单是在T细胞癌变基因型。

我们还研究了两行(t细胞癌症;4hlk6MYC-ER)。在hlk恶性肿瘤,所有4癌症(车道4 - 7,灰条)显示增加波尔和env相比正常T细胞。一个癌症(hlk所有4;巷4)癌变前的hlkT细胞的转录。同样的肿瘤也被qPCR测试,显示罹可比ZFERV放大hlkT细胞(见图4,车道12和16)。所以,在这种情况下,拷贝数反映ZFERV表达式。其他三个hlk癌症(图7道5 - 7)更大波尔和env转录比hlk癌变前的T细胞,至少2倍增加记录。其中一个(hlk所有7;巷5)水平明显更高,此方案波尔upregulation和7倍高env比罹hlkT细胞(巷3)。hlk所有7样品也分析了qPCR,表现出高收益(图副本6巷12),提供相关的基因拷贝数的第二个例子ZFERV转录活动。总的来说,意味着转录是5倍大波尔和三倍高env在hlk癌症比癌前期T淋巴细胞(比较巷3和8),虽然hlk所有7癌症有所扭曲了这个结果。尽管,每hlk癌症显示upregulation≥4倍的记录相对于WT胸腺细胞,证明高ZFERV表达与恶性肿瘤。

类似的结果也获得6MYC-ER癌症(车道10 - 15,灰色酒吧)。虽然在个别癌症,转录水平不同的意思波尔表达式2倍增加env高出三倍相比,所有六个恶性肿瘤MYC-ER癌变前的T细胞(比较巷9和16)。的表达波尔和env同样的肿瘤通常遵循了同样的趋势。然而,某些癌症有不整合这两个基因的转录。尽管有这些差异,MYC-ER癌症平均18 - 7倍高波尔和env分别比正常T细胞从WT鱼,进一步暗示ZFERV斑马鱼T细胞肿瘤形成。

尽管ZFERV拷贝数和转录活动在我们评估的两种癌症相关基因表达数据,差异波尔和env在相同的肿瘤需要另一种解释。不像ZFERV呕吐- - - - - -波尔,这被认为是作为单个RNA转录,波尔和env来自不同的成绩单(11]。因此,这些基因可能是不同的监管。此外,其他因素可能会影响整体ZFERV转录。如前所述,某些集成网站可能促进逆转录病毒活动。此外,癌症与高拷贝数可能会有相称的RNA水平,和我们的有限的数据支持。另一个潜在的因素调节转录属于正常的模式ZFERV T淋巴细胞的表达。而众所周知,d .鱼类T细胞通常使ZFERV RNA ([11),这项工作),现在还不知道如果一切T-lineage细胞,或者说只要ZFERV一些T淋巴细胞发育阶段活跃。因为所有可以表现出分化逮捕在多个成熟阶段(13,14),有可能个别癌症不同逮捕点也会展示不同的ZFERV转录模式。不幸的是,缺乏抗体试剂能够识别斑马鱼T细胞表面标记目前限制测试这一假说。

尽管有这些限制,我们的研究结果表明,基因扩增和转录ZFERV可能影响正常d .鱼类t细胞生物学和肿瘤形成。特别是,我们的研究结果支持这一概念,新的逆转录病毒集成可能是病理分子水平。在脊椎动物基因组稳定综合逆转录病毒元素是常见,有近10%的人类基因组组成的erv或其衍生品15]。然而,大多数erv惰性是由于权责发生制的点突变和部分删除。ZFERV显然是典型,其基因保留不突变子。此外,这些基因转录的d .鱼类T细胞里面所验证,Northern和存在((11]本文)。丰富的ZFERV RNA在T淋巴细胞或许并不令人意外,ZFERV的LTR是最有效的启动子转录调控序列在几个化验鲤鱼(鲤属carpio)上皮细胞系,包括经常使用的巨细胞病毒启动子(16]。

相反,ZFERV明显的t细胞特异性可能是更有趣的发现。沈和斯坦纳确定假定的淋巴转录因子的结合位点伊卡洛斯和Tcf3 ZFERV LTR (E47),而且对其他因素(安全系数/小君,C / EBP,统计,NF -κB等)更一般的活化剂的转录11]。事实上,测序ZFERV-derived成绩单的EST项目从其他组织类型表明non-T-cells可能转录ZFERV也(11]。这一发现是否反映了其他细胞,低级ZFERV转录或低级这些组织中t细胞污染,还不清楚。在这两种情况下,完整的非典型持久性ZFERV羊痘疮,及其在斑马鱼T细胞转录活动,提出了一个问题:是否ZFERV蛋白质可能服务功能的目的。选择压力通常会禁用一个潜在的基因毒性逆转录病毒突变。相反,我们假设ZFERV事实上可能为一些重要的生物作用,占其矛盾维护积极逆转录病毒在斑马鱼基因组中。

ZFERV明显缺席的基因组鲐属(11]意味着进入斑马鱼相当最近在进化过程中,但ZFERV序列已确定从几个不同的菌株,表明其集成是普遍的物种。现在还不知道是否存在于所有ZFERVd .鱼类,据我们所知,这个问题还没有被调查。到目前为止,相对于最接近ZFERV是一个外生鱼的逆转录病毒,井下安全阀。奇怪的是,这种病毒与膀胱平滑肌肉瘤在大西洋鲑鱼,游泳和我们的研究结果与ZFERV一样,这些肿瘤显示高拷贝数前病毒的井下安全阀集成(17]。

除了其密切的关系井下安全阀,ZFERV还股票序列保护和相似的小鼠白血病病毒的基因组结构与gammaretroviridae (MLV)类11,17]。MLV-related逆转录病毒已知被插入突变致癌(18),和决定因素,管理他们的首选集成网站已经严格的科学审查的对象(19- - - - - -21]。虽然明显ZFERV同系物在人类尚未确定,其他MLV-related序列中发现人类细胞系。然而,似乎这些逆转录病毒序列可能是被人类细胞在异种移植小鼠被动接收试剂污染通过小鼠DNA(或结果22,23]。此外,长人类14号染色体上羊痘疮熊高同源性ZFERVenv,和上游序列包含短呕吐- - - - - -波尔元素(24]。所以,ZFERV-related逆转录病毒也显然集成在人类基因组中。将所有这些详细的数据,它变得似是而非的ZFERV integrations-like井下安全阀和MLV-may不仅在斑马鱼致癌,但也可能为人类生物学相关性。

4所示。结论

近十年前,沈和斯坦纳发现斑马鱼内源性逆转录病毒,ZFERV,基于其高转录活动幼虫和成虫d .鱼类胸腺细胞(11]。他们的工作表明,在斑马鱼基因组ZFERV存在的多个副本,从那时起,ZFERV驻留的位点仍然没有明确指定。这些困难可能是归因于这样一个事实:这个multicopy轨迹可能不同拷贝数和基因定位在不同的鱼。在这样的背景下,我们发现ZFERV拷贝数是每进一步增加d .鱼类我们从4个不同基因检查线路t细胞的恶性肿瘤。

有点令人吃惊的是,我们的结果表明,ZFERV放大不是恶性T细胞所特有的。相反,拷贝数也收益发生在WT T淋巴细胞d .鱼类相同的细胞,ZFERV转录是首次发现。此外,ZFERV拷贝数之间似乎是相当一致的正常,癌变前的,恶性T细胞(图6道4 - 8),尽管个人癌症偶尔会表现出更高水平的ZFERV基因组。可能个人正常T细胞也有类似的变化ZFERV拷贝数,但这没有实验解决。

与基因组的扩增,看到ZFERV转录发生在正常,癌前病变和肿瘤的T细胞。我们的研究结果表明,ZFERV rna的表达是更高的癌症样品,但我们不承认从一个癌症下一致的趋势。尽管如此,这些共性之间的正常和恶性T淋巴细胞暗示ZFERV激活和放大可能是正常斑马鱼T细胞生物学特性,无病理结果。ZFERV丰富的转录,显然功能开放,和能力进行基因组扩增都提到其致癌潜力。加上突变等hlk,srk,otg带来恶性倾向,ZFERV可能有助于促进t细胞转化。鉴于最近的系统发育的亲属ZFERV是一个外生鱼的逆转录病毒与sarcomagenesis和MLV-class通过基因组整合引起白血病的逆转录病毒,人们很容易推测ZFERV可能导致细胞不灭的类似的机制。

当然,ZFERV集成关键基因网站可以改变属性。例如,集成在一个肿瘤抑制基因可能使它不能产生正常的蛋白质产品,从而去除函数。相反,集成到原癌基因的启动子或增强子区域可能增加他们的转录。自ZFERV似乎是专门和高度表达的胸腺细胞,这种情况可能类似于原癌基因易位的t细胞受体位点,是描述在t [25,26]。然而,证明这个假设需要识别不良收购ZFERV集成在这些基因组的网站。在这一点上,ZFERV的可能性放大可能导致t细胞瘤形成仍然是一个悬而未决的问题,需要进一步研究解决果断。

确认

感谢作者的贡献,Lynnie Rudner博士,亚历山德拉Keefe,和内森•米克尔,医学博士,他也参加了这个项目。他们感谢Alejandro古铁雷斯,医学博士托马斯,a .看,医学博士,分享MYC- - - - - -呃斑马鱼线中使用其中的一些研究。金布尔j·弗雷泽NICHD奖是由尤尼斯•肯尼迪•施莱佛K08-HD053350和CHRC犹他大学。尼古拉斯s Trede是NIAID奖R21-AI079784和猎人癌症基金会的支持。洪博培癌症研究所支持的核心设施NCI P30-CA042014也促成了这项工作。

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