协会厦门I多态性与血红蛋白E单倍型对纯合子血红蛋白E产后球蛋白基因表达的影响

摘要

背景和目标．探讨的作用独联体-调控序列β人类第11染色体的珠蛋白基因簇γ与Hb E等位基因相关的珠蛋白基因表达，我们分析了基线血液学数据和Hb F值β纯合子血红蛋白E中的珠蛋白单倍型。患者和方法．对80例经分子确认为纯合子的Hb E进行分析β球蛋白单和厦门I多态性使用PCR-RFLPs。74例具有完整实验室资料的个体被进一步研究进行关联分析。结果．八个不同的β发现珠蛋白单倍型与Hb E等位基因有关;三种主要的单倍型分别为(a) (III)、(b) (V)和(c) (IV)，占Hb E染色体的94%。发现一个新的单倍型(Th-1)，很可能是从主要的单倍型转化而来的。大多数个体的Hb F < 5%;只有10.8%的纯合子Hb E具有高Hb F(平均10.5%，范围5.8-14.3%)。在一个特定的单倍型或厦门I在这些高Hb F个体中，通过碱性变性测量。结论。的cis-regulationγ在较温和的条件下，如纯合子血红蛋白E，珠蛋白不平衡程度较低，珠蛋白基因表达可能不明显。

1.介绍

除产生异常变异外，血红蛋白E (HbE)、密码子26 (Glu→Lys)中的G→A置换β球蛋白基因(β^E)也能产生β⁺HbE-mRNA功能下降导致的地中海贫血，继发于可变剪接机制[1]．然而，在纯合子血红蛋白E(血红蛋白EE)的临床表型是相当无症状和非常轻微的贫血。相反，HbE/β地中海贫血具有更多样化的临床表型，从输血依赖到非常轻微的疾病[2- - - - - -5]．尽管，了解Hb E/患者的临床表型多样性β地中海贫血长期以来一直是多个研究的主题，目前，这种所谓的单基因疾病的基因型-表型相关性尚不清楚。

产后的变化γ这些患者的珠蛋白表达和HbF的产生被认为是导致Hb E/临床异质性的主要遗传因素之一β通过减少血红蛋白失衡和改善无效的红细胞生成来治疗地中海贫血。通过红细胞的发育γ珠蛋白的表达受珠蛋白间相互作用的调控独联体-在β球蛋白集群和反式-作用因子如BCL-11A、cMYB和TOX [1，6- - - - - -8]．最重要的遗传因素独联体与高HbF相关厦门多态性位于−158上游^Gγ球蛋白基因(9]．在最近的一项研究中，使用了更精细的SNP分析βHbE中的珠蛋白基因簇β地中海贫血病表明，在其他地方没有其他与地中海贫血病有可比性联系的变体厦门I位点和T等位基因(厦门我，+)几乎总是在独联体HbE等位基因[10]．进一步探讨独联体在血红蛋白E疾病中，我们分析了7个已知的单核苷酸多态性在50 kb内β珠蛋白基因簇构建Hb e -链β珠蛋白单倍型与厦门我多态。的β血红蛋白E的珠蛋白单倍型以前在泰国和东南亚地区已被描述，但它们主要用于识别发现有血红蛋白E的不同种族群体的起源、传播和人类学[11- - - - - -13]．然而，目前还没有研究将这些发现与产后Hb f的产生联系起来。最近，我们广泛分析了多达76名患有Hb E的泰国人[14]，发现数例在稳定期Hb F水平显著高，其中数例在随访期间Hb F持续高。因此，这些个体提供了一种不同的模式来探索个体的作用β球蛋白单和厦门我(代表独联体-调控序列)的倾向γ球蛋白表达。此外，在我们的泰国人群中，Hb E等位基因和持续产生Hb F之间的关联分析可能有助于证实这些发现，并将其应用于更有临床意义的综合征，如Hb E/β地中海贫血。

2.材料和方法

经知情同意后，从80例纯合子HbE患者的血液中获得乙二胺四乙酸(EDTA)。他们是父母、兄弟姐妹和不相关的个体，他们在Siriraj医院医学院儿科进行了小细胞贫血检测，这是正在进行的研究E型肝炎自然史和基因型表型相关性的泰国项目的一部分。这项研究得到了Mahidol大学当地伦理委员会的批准。完整的血液学和血红蛋白研究已使用标准技术进行，如前所述[14]．通过醋酸纤维素电泳计算Hb E和Hb F %进行定量，Hb F随后通过碱性变性法确定[15]．

2．1．pcr -限制性片段长度多态性(RFLP)对纯合子Hb E的分子诊断

采用标准苯酚/氯仿法提取基因组DNA。在分子水平上证实了所有病例的纯合子Hb E基因型。PCR扩增出一个427 bp的片段，其中包含两个片段MnlI酶切位点，一个在5 '端作为内控酶切位点(135 bp)，另一个连接CD26 (171 bp和62 bp)。随后，我们对PCR产物进行了消化Mnl我使用制造商推荐的条件(New England Biolabs, Beverly, MA);Hb E突变(G→A)消除了这种情况Mnl因此，I位点的酶切显示为233bp和135bp(内部控制)(如图所示1）.此分子测试的进一步细节已在其他地方描述[14]．

2．2.β珠蛋白基因单倍型和框架的PCR-RFLPs

利用引物在上述最佳条件下进行PCR扩增[16]．基于pcr的RFLPs覆盖7个酶切位点，跨越50 kbβ-珠蛋白基因簇扩增ε，^Gγ，^一个γ, 5 'φβ, 3 'φβ, 5 'β, 3 'β随后被消化欣dII,欣dIII,欣dIII,欣dII,欣dII,艾娃二世,欣，分别识别其内部和周围的核苷酸替换β珠蛋白基因簇[16]．根据所有这些限制位点的存在(+)或不存在(-)指定单倍型和框架;两个PCR-RFLP位点艾娃II的内含子2β珠蛋白基因和BamHI位于3 '到β用珠蛋白基因鉴定骨架。此外,厦门用同样的技术对I多态性位点进行基因分型。单倍型分析采用Phase-Standard-analysis version 2.1.2进行[17，18构建Hb e -连锁单倍型。频率低(<0.5%)的单倍型被排除在进一步的分析之外。

2．3.统计分析

采用SPSS统计软件包Version 10.0 (SPSS Inc.， 2000)进行数据分析。配对和未配对t-检验用于确定组间的差异。P值(P)小于0.05被认为有统计学意义。

3.结果

从80例纯合子Hb E个体中，我们成功地对77例(154条Hb E染色体，表)的8个多态性位点进行了基因分型1）.这些个体主要来自曼谷和泰国中部平原。八个不同的β与HbE等位基因相关的珠蛋白单倍型已经由两个新的(−−−+−)和(+ +−+ + +−)构建。基于Orkin等人的三种主要单倍型[19型(60.4%)、型(24.0%)、型(9.7%)占HbE等位基因的绝大多数，且与HbE相关厦门I +，−，+。因此只有71.43%的HbE等位基因与T等位基因(或+基因型)相关厦门I.仅基于Antonarakis等人的框架2(+−)和3(−+)[13，而与()或(+ +)模式未被观察到。这是所有八项的总结β珠蛋白单倍型见表1．

74个人有完整的血液学和血红蛋白数据与分子结果，包括Hb E基因型及其相关β珠蛋白单倍型是进一步关联分析的对象。这些患者的详细血液学和临床资料以前已作过描述[14]．总之，大多数纯合子血红蛋白E病例的血红蛋白(Hb)和红细胞压积(Hct)水平交界，平均红细胞体积(MCV 58±5.2 fL)明显较低。基线血红蛋白水平男性最高(12.6±1 g/dL)，其次是女性(11.4±1 g/dL)和儿童(10.6±0.8 g/dL)。这些患者均无肝脾肿大，无需输血[14]．在研究开始时，12个个体在稳定阶段被鉴定为超过5%的高Hb F。在我们的随访中，4例15岁以下儿童的Hb F水平下降或消失。这一发现表明，在一些纯合子血红蛋白E的儿童个体中，Hb F水平的增加可能是由于出生后持续产生的γ珠蛋白的表达在他们童年后期逐渐下降[6]．而在成人病例中，他们的Hb F水平仍然保持高水平，排除了暂时性造血应激可能影响的表达γ球蛋白基因。这8个纯合子Hb E(10.8%)的个体有高水平的Hb F(平均10.5%，范围5.8-14.3%)，而其余的Hb F低于5%。74个纯合子Hb E中稳定阶段Hb F百分比的分布如图所示2．然而，通过碱性Hb F测量，女性个体的平均Hb F似乎明显高于男性(、表2）.这一发现与以往在普通人群中发现的女性Hb F较高的研究结果一致，导致对Xp22.2上的x连锁基因等数量性状位点(QTL)的表达进行了全面的研究γ球蛋白基因(21- - - - - -23]．然而，性别差异的主要成因机制尚不清楚。有趣的是，这些高Hb F的纯合子Hb E病例的血液学数据与那些低Hb F或无Hb F病例没有区别(数据未显示)。

有趣的是，两者之间并没有显著的联系β球蛋白单和厦门与其他8个高Hb F个体相比，这8个个体的I多态性。此外，我们也没能找出其中的任何联系β在所有74例病例中，通过碱性变性测定珠蛋白单倍型和基线Hb F水平(数据未显示)。即使在纯合子Hb E中碱F水平增加厦门I(+ +)与(+ -)相比在同一性别中统计上是不显著的(表2）.

4.讨论

据我们所知，本研究在此提供了最广泛的分析β迄今为止与Hb E等位基因相关联的珠蛋白单倍型。由于本研究中使用了更多的纯合子Hb E个体，我们发现泰国与Hb E相关的单倍型可能比之前认为的更加异质性。研究发现至少8种不同的单倍型，包括2种新单倍型;然而，在这些病例中，大多数(94.3%)Hb E等位基因与三个主要的单倍型相关;(a) (III)， (b) (V)，和(c) (IV)，与之前在我们人口中的研究一致，并支持该地区Hb E的多个起源假说[11- - - - - -13]．在曼谷，由于大量来自泰国不同地区的移民，它是整个国家的大熔炉，要追溯和追踪他们的原始地区并不简单。因此，我们在泰国发现这种异质性并不奇怪，包括两个新的单倍型:Th1;(−−+−)和阿拉伯-印度语;(+ + + + + +)。后者是相同的β^年代以前研究报告的单倍型[20.，24]．然而，这两个新的单倍型分别与b (V)和a (III)两个常见的单倍型非常相似。只有特定的限制位点ε-后II位点不同，提示这两种新的单倍型可能来自等位基因间转换而非独立起源[25]．此外，我们的研究也证实了之前的结构β在其他的纯合条件有限的研究中，主要从Hb E杂合子中使用单倍型分析[11，12]．

在本研究中，我们进一步探讨了β球蛋白单体型(暗示独联体-调控序列)和Hb F产生的易感性。我们发现一些纯合子Hb E和高水平Hb F的个体，其中其他外部因素，如并发感染，造血应激和红细胞生成不能解释。这些个体可能为进一步研究分子调控机制提供一种新颖的、不那么复杂的自然模型γ它们的珠蛋白表达都是相同的β珠蛋白基因缺陷(Hb E)及其相关β珠蛋白单倍型易于构建。然而，我们没有成功地确定任何正相关，甚至与厦门I多态性提示在这些纯合子Hb E个体中发现的Hb F的产生可能主要受反式-作用机制包括HBS1L和BCL11A [6，26]．相反，人与人之间的紧密联系是广泛的β血红蛋白单倍型与Hb E/的临床严重程度β在泰国患者中发现了地中海贫血患者，这与可能的功能性SNP之间的联系有关，厦门I，以及增加Hb F产生的倾向[10]．与Hb E/相比，我们的纯合子血红蛋白E个体中发现的红细胞生成应激和/或珠蛋白失衡水平可能明显较低β地中海贫血，这可能不足以触发出生后的转换γ血红蛋白表达为Hb E/β地中海贫血症。有趣的是，我们的研究表明，在我们的研究人群中，Hb E等位基因与T(+)和C(-)等位基因有关厦门I位点提示了在泰国人群中Hb E等位基因的高度异质性，并强调了对未来单倍型和SNPs测定的重要考虑，这与Hb F相关的表型和临床严重程度有关。

综上所述，Hb F的产生与厦门我和β珠蛋白单倍型作为标记物不能用纯合子Hb E条件确定。然而，这可能表明，在本研究中使用的模型的局限性作为影响独联体-调控元件可能不够强，不足以检测到在轻微的造血应激条件下，如纯合子Hb E。

利益冲突

作者声明没有利益冲突。

作者的贡献

V. Viprakasit是主要研究者，主要负责本研究的设计和分析。S. Ekwattanakit和Y. Monteerarat进行了所有的分子研究，并参与了数据的解释;S. Ekwattanakit也进行了统计分析和论文草稿。K. Tachavanich和S. Riolueang进行了血液学分析并收集了所有患者的数据。所有作者阅读并批准了论文的最终版本。

资金来源

本文由泰国皇家金禧博士计划资助。发给S. Ekwattanakit和V. Viprakasit。SE还得到了泰国曼谷Mahidol大学医学院Siriraj医院免疫学系(博士项目)的资助。Y. Monteerarat是由Mahidol大学医学学者计划支持的。这项工作得到了泰国研究基金和BIOTEC、国家科学和技术发展局(NASDA)和泰国国立研究大学(NRU)的资助，通过Mahidol大学，泰国V. Viprakasit。

致谢

作者想要感谢所有参与这项研究的纯合子Hb E个体。作者感谢Worrawut Chinchang和Waraporn Glomglao出色的技术援助。

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