使用一种新型完全集成中空纤维过滤装置进行重力分离处理的包装红细胞和血浆的质量、稳定性和安全性数据

摘要

背景．我们开发了一种完全封闭的全血分离系统，基于重力分离，不需要离心步骤。用这个新系统，我们比较了处理过的血液成分(PRC和血浆)与经典制剂的质量和稳定性。并对该中空纤维体系的成本效益进行了评价。研究设计与方法．采集15例定期献血者全血，采用U型中空纤维过滤装置进行成分制备。结果与15种全血离心制备的结果进行了比较。测定总血红蛋白、白细胞计数、血清总蛋白浓度、乳酸脱氢酶(LDH)和钾含量。在不同时间点对ATIII、vWF和fviii进行分析。结果．包装红细胞:直接分离后和42天存储后的数据符合欧洲委员会的指导方针。等离子体．所有血浆质量数据均符合欧洲委员会血浆质量保证指南，但低蛋白量(0.75因子)除外。结论．在这个新的封闭系统中进行临床全血分离是可行的，但血浆蛋白含量必须优化。

1.介绍

将全血分离成不同的血液成分是输血医学的标准程序。这种分离要么是在采集全血后使用可编程离心机和自动血液成分制备系统进行离心，要么是在采集血液(如细胞单采)期间进行。在这两种情况下，成功处理血液都需要广泛的基础设施(中央设施、昂贵的设备和训练有素的工作人员)。除了必要的设备，在全血分离的情况下，劳动密集型的人工过程是必要的，在细胞分离的情况下，仔细监督采集过程。我们研究了上述分离方法是否可以被封闭系统重力过滤代替。

有几次尝试用简单的重力过滤代替离心和附加的分离方法。Sekiguchi等人首次使用中空纤维系统将全血分离为prc和血浆。[1］．通过更换过滤系统，集成白细胞过滤器和使用存储介质进行延长存储，不同的作者能够证明，使用重力分离处理prc和血浆是可能的，其质量和稳定性数据与经典离心/单采方法处理的数据相当。然而，这些首次尝试的问题是过滤系统的低浓度能力，导致prc中的HCT低，血浆回收率降低。这种低浓度能力主要是由于通过线性过滤系统的流量相对较高[2- - - - - -5防止有效分离成血浆和细胞成分。

为了提高分离潜力，设计了一种新的中空纤维系统，中空纤维被包裹在一个马镫形状(U形)的塑料铸件中，用聚氨酯将其分离成等离子体(在毛细血管外)和红细胞(在纤维内)。中空纤维过滤器的细节如图所示1．这种初步的过滤设计被纳入血液分离装置，并由海姆[6， Stienstra等人[7， Hornsey等人[8］．他们的结论是，使用中空纤维技术进行全血分离是简单而直接的;然而，为了使该程序更容易融入日常使用，还需要进行一些小的改变。

(a)中空纤维过滤器(打开滤筒以便查看)

(b)中空纤维过滤器固定在合成滤芯内

图1

1(一) 1 (b) μ 1(一) 1 (b) μ μ μ μ 数据和更详细地展示中空纤维过滤器。每个中空纤维过滤器由600个毛细管膜制成，由厚度为100的聚醚砜制成m±25m.毛细血管呈u形(图）固定在合成滤芯内(图），并用氯化钠溶液润湿。毛细血管的孔径为0.5m±0.1毛细管的总长度为175.5 m，直径为300m±40m.过滤器上方固定的捐献袋的静水压力足以将红细胞压入红细胞袋。在分离过程中，等离子体穿过毛细管膜，在过滤筒中取样，并流向等离子体袋。由于细胞体积大，红细胞不能穿过细胞膜，在悬挂相同高度并预先装满100ml PAGGS-M添加剂溶液的红细胞袋中沿u型毛细血管流向上出口。

基于Hornsey的实践经验，我们对原中空纤维器件进行了改进，试图提高其性能。

在Hornsey等人评价的初步系统中，过滤系统和捐赠袋分离，中空纤维系统干燥。使用Pall白细胞滤过器清除白细胞。在分离前，必须用氯化钠小心地湿润中空纤维过滤器，并将献血袋密封在无菌的献血袋中。基于这个初步系统的经验，我们开发了一个完整的封装封闭系统，包含抗凝剂和添加剂溶液直接附在设备上，并带有用氯化钠预湿的过滤器。此外，我们用费森尤斯白细胞滤光器取代了帕尔白细胞滤光器。在本研究中，我们提供了用这种新的临床系统处理的prc和血浆的质量和稳定性数据。为了评估可能的成本效益，我们比较了两个系统的实际操作时间。

2.供体、材料和方法

2．1．捐助者

从德国汉堡Marienkrankenhaus输血医学系的定期献血者中随机选择了15名献血者。所有献血者都被告知临床试验和捐献血液的使用情况。所有参与的捐赠者均表示知情同意。

2．2.血液采集

所有献血均按照德国献血标准进行。在每个供体中测量以下参数:总血红蛋白(Hb)、白细胞计数、血清总蛋白浓度、乳酸脱氢酶(LDH)和钾。进一步分析凝血因子抗血红蛋白III (AT III)、血管性血友病因子(vWF)和凝血因子VIII (F VIII)的活性。我们在这些调查中使用的分析仪见表1．所有的测量都是根据所使用分析仪的制造商的建议进行的。


参数	分析仪

免费血红蛋白:	分析仪低血红蛋白，血色
血液学:	Cell-Dyn 4000和CellDyn 350, Abbott, USA
总蛋白、血清乳酸脱氢酶、血清钾:	AU 640/AU 2700，奥林巴斯
Von-Willebrand-Antigen:	Mini-VIDAS，生物梅里埃，巴黎，法国
纤维蛋白原,F八世:	BCT, Dade Behring，德国马尔堡
残余白细胞:	epic XL，库尔特，美国

经过仔细的消毒和成功的肘静脉穿刺，我们使用集成的中空纤维系统从每位供者身上收集了450毫升血液。在采血过程中，将捐献袋放置在标准的血液混合装置(NPBI Compomixer M2)上。采血后立即密封捐献袋的进血管。

2.3。血液分离

血液分离前，将捐献的全血在环境温度(约20℃)下静置2小时，以便吞噬游离细菌。封闭中空纤维分离系统的细节如图所示2．重力分离过程如下。首先是装有63毫升CPD(1000毫升CPD含有3.27克柠檬酸)的捐赠袋H₂O, 26.3克柠檬酸钠2 h₂O, 25.5 g葡萄糖H₂O和2.51 g NaH₂阿宝₄ H₂O)挂在主支架(b)的上钩上。然后将已包装好的红细胞(prc)袋(c)预先充满扩展储存介质(100 mL PAGGS-M) (1000 mL PAGGS-M含有9.400 g葡萄糖H₂O, 1.255 g NaH₂阿宝₄ H₂O, 1.432 g NaHPO₄ H₂O, 0.194 g腺嘌呤，0.408 g鸟苷，10.000 g甘露醇，4.210 g氯化钠)，分离过滤器(d)挂在中间附件上，两者完全在同一水平线上。在所有的夹钳和内联切断阀打开后，血液从捐献袋流过白细胞过滤器(e)，随后进入中空纤维系统。当白血球耗尽的血液缓慢地流过u形中空纤维的内部空间时，血浆通过多孔壁扩散，结果血液被分离成血浆和红细胞。血流量可以通过滚轮钳来调节，流速可以通过滴注室来调节。无细胞血浆流入血浆袋(f)，红细胞流入红细胞袋。大约40分钟后，分离完成。分离完成后，PRC袋和等离子袋被密封并与分离装置断开。所有血浆制剂均立即冷冻并储存在−30°C(血浆冰箱:UF 40-300S, Colora GmbH, Lorch，德国)。为了进行prc的质量控制测试，我们进行了自动血细胞计数和游离血红蛋白浓度的测量。溶血率按公式(100 - Hct)计算。免费HB / HB。处理后的15个prc在+4°C的普通血库冰箱(blood bank refrigerator BL-720, Philipp Kirsch GmbH, Offenburg, Germany)中存储42天。存储42天后，所有上述质量控制在prc中重复，并进行无菌控制。检测血浆总蛋白、乳酸脱氢酶(LDH)、钾、纤维蛋白原浓度及残余白细胞计数，进行质量控制。同时测定凝血因子AT III、vWF、fviii的活性。血浆按照标准方案在−30°C下冷冻。保存366天后，将冷冻血浆解冻，再次测定fviii活性。

2．4．成本效益

为了比较目前采用的重力血液分离方法与采用全血和离心的经典方法在成本效益上的差异，我们分析了两种方法(离心/分离)中每个工作步骤的操作时间n= 6;由重力分离n= 3).评价只考虑真实血液处理时间;两种方法的采血时间相同，因此没有考虑。

3.结果

3．1.捐赠者的参数

献血者血液参数结果见表2．


N= 15	Hb (g / dL)	白细胞(10^3./L)	总蛋白(g / L)	LDH (U / L)	K⁺(更易/ L)	AT III (% o. N.)	抗原(% o. N.)	F VIII (% o. N.)

平均数±标准差	13.8±1.1	5.2±1.5	70±4	176±42	4.1±0.2	104±11	86±24	98±28
范围	11.2 - -15.2	3.5 - -8.5	62 - 77	122 - 290	3.7 - -4.7	93 - 119	58 - 118	57 - 149

3．2．拥挤的红细胞

分离后直接加工的prc质量数据见表3.(a).储存42 d后游离Hb含量为1.2 g/L(范围:0.8 g/L±1.7 g/L)，平均裂解率为0.7%(范围:0.5% ~ 0.9%)3.(b))。所有价值观均符合欧洲委员会的指引[9]为prc的质量(表4）.直接分离后的中华人民共和国的HCT可由中华人民共和国的平均总容积(346 mL)和平均HCT(0.54)以及根据公式346 mL对添加sagm量的了解计算0.54/(346 mL - 100 mL) = 0.76。在初级袋中，用63ml CPDA稀释供者原始HCT为0.43的HCT为0.37(4500.43 /(450 + 63))。根据这些值计算出过滤器的浓度能力是76/37 = 2.05。

(一)制备后直接填充红细胞。


N= 15	卷(毫升)	Hb Concen-tration (g / dL)	Hb /单位(g)	Hct (%)	残余白细胞/单位(10⁶）	剩余的蛋白质/单位(g)	K⁺在上层清液(更易/ L)	K⁺/单位(更易与)	免费Hb (g / L)	上清LDH (U/L)

平均数±标准差	346±19	17.4±1.2	60±6	54±4	0.03±0.00	3.3±0.8	1.8±0.2	0.28±0.04	< 0.03	346±19
范围	326 - 402	14.3 - -19.0	47 - 73	43-59	0.03 - -0.04	2.0 - -4.9	1.4 - -2.0	0.21 - -0.32	< 0.03	25 - 73

(b)储存了42天的红细胞


N= 10	免费Hb (g / L)	溶解速率

平均数±标准差	1.21±0,33	0.69±0.16
范围	0.8 - -1.7	0.5 - -0.9


参数	要求	观察

血红蛋白im中华人民共和国	40 g /单位	47 - 75 g /单元
中华人民共和国残留白细胞	＜110⁶/单位	< 0.0510⁶/单位
	无渗漏	无渗漏
视觉检查	没有凝集	没有凝集
	颜色不变	颜色不变

3．3.等离子体

血浆制剂的质量数据见表5(a).与最初供者的血液相比，蛋白质含量减少了约0.75倍(见表)1）.抗血红蛋白III、血管性血友病因子和因子VIII的血浆活性与蛋白含量降低相关，约为0.8。血浆中残留白细胞计数处于低检出限(低于2000/单位)，血浆中无游离血红蛋白。贮藏1年后因子VIII活性为0.57，范围为0.35-0.975(b))。这相当于存储前活动的0.78(范围:0.69-0.88)。随机抽取血浆的血清电泳显示在参考值范围内蛋白质组分分布正常(表)6）.所有血浆质量数据均符合欧洲委员会血浆质量保证指南(见表)7)，但蛋白质含量较低。

(一)制备后直接等离子体。


N= 15	卷(毫升)	总蛋白浓度(g/L)	总蛋白/单位(g)	残余白细胞/单位(10⁶）	纤维蛋白原(mg / dL)	纤维蛋白原/单位(毫克)	AT III (% o. N.)	抗原(% o. N.)	F VIII (% o. N.)

平均数±标准差	234±12	51±4	12.0±1.2	0.02±0.00	191±41	450±109	82±9	82±27	82±27
范围	214 - 253	44-58	9.7 - -14.6	0.02 - -0.03	138 - 264	304 - 663	67 - 95	52 - 119	46 - 115

(b)血浆fviii保存366天。


N= 15	F VIII (% o. N.)	储存前的活动百分比

平均数±标准差	57±21	78±5
范围	35 - 97	69 - 88


	结果	参考价值

血清总蛋白	58 g / L	60 - 80 g / L

白蛋白	57％	55 - 67%
α1球蛋白	2.7%	2.1 - -3.7%
α2球蛋白	9.4%	8.0 - -14.0%
β球蛋白	10.8%	8.0 - -13.0%
γ	20.1%	9.0 - -20.0%


参数	要求	观察

血浆制剂的体积波动	−10%+10％	−7.8%+ 9.0%
血浆中残留的白细胞	＜110⁶/单位	< 0.0410⁶/单位
	无渗漏	无渗漏
视觉检查	没有凝集	没有凝集
	颜色不变	清澈，无云，琥珀色等离子体

3．4．成本效益

表中给出了两种全血处理方法不同步骤的分析比较8每一步所需的时间以分钟为单位。由该表可知，全血分离成prc和血浆，离心/分离法共70分钟，重力分离法共57分钟。离心过程和重力分离过程本身都是独立于技术人员的，在此期间技术人员可以执行其他任务。因此，我们假设使用经典方法需要技术人员50分钟，而使用重力分离方法只需要12分钟。


流程活动	离心分离	重力分离

把血袋送去实验室	2分钟	2分钟
白细胞耗尽的准备	4分钟
白细胞减少	15分钟
离心步骤(冷却)的制备	5分钟
离心分离	20分钟
血液分离器的制备	4分钟
全血分离为PRC和血浆	12分钟
文档	3分钟
贮存用PRC和等离子体的制备	5分钟
重力分离过滤系统的研制		4分钟
重力分离		45分钟
文档		3分钟
贮存用PRC和等离子体的制备		5分钟
总和	70分钟	57分钟
-离心分离,分别。重力分离时间(技师可以自由做其他事情)	20分钟	45分钟
加工需要时间技术员	50分钟	12分钟

4.讨论

我们的研究表明，使用重力驱动的完全封闭中空纤维系统，全血可以有效地分离成其成分。因此处理的prc和血浆的质量和稳定性与经典方法处理的血液成分的质量和稳定性具有可比性，并符合德国和欧洲血液成分的制备、使用和质量保证指南。然而，处理后的血浆蛋白浓度仍然过低。这种蛋白质损失的原因还不完全清楚。我们推测血浆蛋白与中空纤维(聚醚砜)毛细管膜的相互作用导致血浆蛋白的吸收。考虑到中空纤维的总自由长度为175.5 m，最小的吸收可以导致血浆蛋白的可测量的差异。第二种机制可能是由于与中空纤维的人造表面接触而激活凝血系统(血小板激活?)。同样，凝血系统的激活可能是最小的，但中空纤维系统的总表面可能会产生不同。我们计划在这些方面进行研究，通过化学改性中空纤维的表面，以抑制吸附或活化。中空纤维过滤血液分离装置在将全血转化为红细胞和血浆成分的过程中，无需离心或自动分离步骤。 A source of electrical power is not required and the closed system can be used anywhere, irrespective of environmental conditions. This means that an integral system for safe blood collection and processing is also within reach of under-resourced countries. However, other applications are focussed upon as well. Blood collections obtained at remote blood drives can be processed during the actual blood drive locally without the need for a speedy return to a central facility. The handling of the system is easy and handy in practice. The net working time for processing the blood components is lower compared to the centrifugation method, only requiring a small number of staff and no large, specialized machines. Only a heat melting clamp or clamping tongs for closing the tubes, a tubing roller and the usual cooling and freezing equipment are necessary for the production of the preparations from donor blood described above.

该系统已在不同国家(土耳其、南非和莫桑比克等)临床使用2年。据作者所知，没有观察到与分离系统相关的不良影响。

参考文献

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血液学的进步