自身免疫性疾病

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体积2022年| 文章的ID1343805| https://doi.org/10.1155/2022/1343805

干扰的抗核抗体(ANA)在间接免疫荧光试验(IIFA)的细胞核周围的Antineutrophil细胞质抗体(pANCA)解释

Sangeeta Deka ,¹ Deepjyoti Kalita ,¹ Udaykumar Sasi瑞卡 ,¹ Putul Mahanta ,² Diksha王妃 ,¹ Ravi Shankar ,¹ 克里希纳Anusha拉吉 ,¹ Mithilesh Kumar Jha ,¹ Gaurav Badoni ,¹ Manisha保罗 ,¹ Shailesh Kumar Gupta ,¹ 和Shailender Negi ¹et al。

学术编辑器: 赛义德穆罕默

收到了 2022年3月16日

修改后的 2022年9月02

接受 2022年9月14日

发表 2022年10月26日

文摘

背景。间接免疫荧光试验(IIFA)基于antineutrophil胞质抗体(ANCA)测试是普遍采用的测试诊断自身免疫性血管炎。抗核抗体(ANA)会产生一个错误的解释perinuclear-ANCA (pANCA) ethanol-fixed粒细胞基质。分析干扰可能经常发生在设置ethanol-fixed基质单独使用。这里,我们打算调查这个安娜干涉pANCA解释。方法。在本回顾性研究中,我们研究了anti-MPO-negative但ANA-positive pANCA(基于IIFA)样本。我们也相关免疫印迹结果(数据)和检查之间的关系等级的污点积极性(ANA)的浓度的指标和频率pANCA解释。数据被适当的统计分析技术(卡方和kappa统计数据)。结果。大约19.2%的安娜污点(ENA-blot)阳性样本显示pANCA ethanol-fixed衬底正面的模式,而这种积极性ENA-blot底片是6.5%。积极ANA-IIFA样本中,约有14.7%产生pANCA模式(乙醇固定基质)。的,核同质模式产生样本给pANCA频率最高,也就是说,在31.5%斑点(11.1%)紧随其后,DFS(10.3%),与着丝粒(6.7%)。核同质的协会模式在统计学上意义重大。结论。ANA-positive结果可能干扰解释pANCA ANA-IIFA和ENA-blot阳性样本的观察。ANA-IIFA模式如核同质可能强烈关联这个pANCA解释。这有助于更有效地执行ANCA测试实验室,排除安娜干涉ANCA筛选。

1。介绍

Antineutrophil细胞质抗体(ANCAs)是至关重要的诊断和发病机制的条件称为ANCA-associated血管炎(1,2]。ANCA-associated血管炎是一种罕见的疾病与坏死性炎症相关的小型/中型血管有无肉芽肿形成在受影响的器官2,3]。主要症状包括肉芽肿病polyangiitis (GPA),微观polyangiitis (MPA)和嗜酸性GPA (2]。

ANCAs通常可以在这样的条件下(2,3]。在间接immunofluorescence-based化验(IIFA),两种模式的ANCAs observed-cANCA(细胞质ANCA)和pANCA (perinuclear-ANCA),代表两个不同的抗原特异性,也就是说,蛋白酶3 (PR3)和髓过氧化酶(MPO),分别为(4,5]。指导ANCA检测小血管的血管炎倡导者ELISA-based anti-MPO-anti-PR3抗原抗体检测的免疫测定初步筛选/评价疑似病例(6]。ANCA-IIFA保留确认边缘/低高的积极或消极的情况下临床怀疑。(6)但是,共识声明指出ANCA-IIFA是基于这样一种观念,这是敏感性和较小的特异性高于特定antibody-assays [6,7]。因此,IIFA-based测试(兼职或确认)的需求非常高,并且他们通常执行测试。

IIFA-based ANCA检测测试并非没有挑战。抗体抗原的存在弹性蛋白酶、组织蛋白酶Gazurocidin,乳铁蛋白、溶菌酶和杀菌/ permeability-increasing因素能产生pANCA(或非典型pANCA)模式(8,9]。抗核抗体(ANA)的存在可能是一个原因pANCA积极性没有anti-MPO [10- - - - - -13]。这是观察到ethanol-fixed中性粒细胞虽然可以通过使用一个额外的排除formalin-fixed衬底(14,15]。双底物(乙醇固定HEp-2和中性粒细胞衬底)可以帮助排除干扰(15]。但是,这些额外的基质带来额外的支出,主要用于筛查在资源缺乏。因此,一个务实的方法来削减成本可能是安娜的使用测试pANCA积极但anti-MPO负面(或如果anti-MPO测试不可用)样本排除干扰(16]。

我们开始这项研究来分析人口的干扰水平的安娜积极性(IIFA和免疫印迹)pANCA-positive样本(ethanol-fixed中性粒细胞)。

2。方法

包括在这项研究中,我们认为这些样品发送给安娜(IIFA)和ANCA(由IIFA和ELISA)。样品被认为是那些收到测试来自不同部门的安娜和ANCA(内科、儿科、眼科、风湿病、产科和妇科,ENT,皮肤病,等等,)我们的三级护理教学医院以连续的方式。数据从2017年1月至2021年12月获得回顾性分析。在我们的实验室,血液在普通瓶血清分离处理,从而获得血清保存在−20⁰C之前测试。

ANA-IIFA积极性是我们分析的起点,紧随其后的是ANCA检测(IIFA和ELISA)的结果。

在我们的实验室检测ANCA:血清受到IIFA-based ANCA检测(Euroimmun IIFT:粒细胞马赛克13日,吕贝克,德国,目录# fa1201 - 1005 - 13)和单一的三明治第三代elisa anti-PR3 (anti-PR3-hn-hr-ELISA(免疫球蛋白),Euroimmun,吕贝克,德国,目录# ea1201 - 9601 - 2 g)和anti-MPO(反MPO-ELISA-IgG Euroimmun,吕贝克,德国,目录# ea1211 - 9601 g)检测ANCA的存在。(1]。

的IIFA-based ANCA诊断工具包使用ethanol-fixed巴菲外套人类中性粒细胞(连同其他formalin-fixed嗜中性的基质,而基质又创造存活其中HEp-2-neutrophil固定在乙醇)。病人血清在1/10比例稀释,添加到衬底井,然后孵化。在含血清ANCA (IgG、IgM IgA)附加到抗原固定中性粒细胞(1]。FITC标记(绿色)允许反人类的抗体反应,荧光显微镜下观察。定期颗粒荧光分布于整个胞浆的粒细胞(除了核)是指出cANCA(细胞质模式)。

相比之下,一个平滑的荧光缠绕在粒细胞的细胞核被记录为pANCA(细胞核周围的模式)。ELISA试剂盒有试剂井涂以纯化重组PR3的混合物和本地PR3 (anti-PR3-hn-hrELISA免疫球蛋白)以及purified-MPO (anti-MPO-ELISA免疫球蛋白)抗原在两个各自的包(1]。Prediluted样本添加到井中。经过一段时间的潜伏期,enzyme-labeled反人类的免疫球蛋白(酶共轭)补充说,催化颜色反应来检测结合抗体。增加了显色底物来确定酶活性的程度通过测量色度谱。的截止测试(PR3和MPO) 20相对单位(俄文)/毫升(1]。

安娜的测试:Euroimmun IIFA-based工具包(IIFT马赛克:HEp-20-10 /肝(猴子)测试系统,Euroimmun,吕贝克,德国,目录# fa1512 - 1010 - 1)是用于安娜检测。1:100稀释比例血清(30μl)应用于生物芯片的基板按设备的要求。短暂孵化后在室温下,PBS-Tween应用和fluorescein-labeled反人类的球蛋白涌入每个领域的反应。幻灯片是进一步孵化和荧光显微镜下观察。模式,如核同质斑点、着丝粒和有丝分裂积极(主轴/中心体)都被记录下来。几个样品由免疫印迹分析进一步发现测试都记下了。这个测试是使用Euroimmun ENA免疫污点地带(Euroline安娜剖面3 + DFS70(免疫球蛋白),Euroimmun,吕贝克,德国,目录# DL 1590 - 6401 - 30 g)。这个工具包可榨出的核抗原目标像nRNP / Sm, Sm, SSA, Ro-52、单边带、sci - 70, PM-Scl, PCNA, Jo-1, CENP-B, dsDNA, DFS70,核小体,组蛋白,核糖体protein-P,抗线粒体抗体(AMA-M2),和控制。污点地带反应的强度进行了分析使用图像分析软件提供的设备制造商(EUROLineScan版本,3.4.30 Euroimmun,吕贝克,德国)。分级协议(积极目标)中提到的工具插入之后。评分就像从+ + + + + + +和+ + +±带颜色的强度(相应减少样本中的抗体)减少。 Euroline scan software calculates this grade from the intensity of band colour in positive immunoblot images. In case of multiple target positivity, highest graded positive target was recorded for analytical work.

生成的数据使用SPSS统计分析v.23.0 (IBM、纽约、美国)。McNemar检验法卡方测试用于检查不同的子组结果协会(pANCA积极性)。评估协议(ANA-IIFA和ENA-blot)两个主要测试,我们比较这两种方法使用的二进制结果kappa统计数据。一个 - - - - - -值小于0.05在所有统计测试被认为是显著的。描述程序都是我们实验室的常规测试流的一部分,和数据进行了分析回顾的方式(1]。

3所示。结果

总共324 ANA-positive病例(ANA-IIFA在选定的情况下也通过免疫印迹)进行ANCA (IIFA PR3和MPO ELISA) 2017年1月至2021年12月被纳入本研究。这些,anti-MPO阳性(ELISA)被排除在外(n=从研究(参见图17)1)。

表1描述了ENA-blot记录和pANCA ethanol-fixed粒细胞衬底的解释。大约6.5%的ENA-blot消极的情况下产生了积极的pANCA模式。总的来说,ENA-blot阳性病例给三倍正明显比ENA-blot pANCA负例(19.2%,6.5%; )。半定量的安娜之间没有相关性可以观察到测量(在成绩方面,即。,++++, +++,++,+ and +/-) and pANCA positivity, though statistically significant relation was observed in two grades (++ and +/-). This grading system is as per described in the product insert and calculated by using software [EUROLineScan Ver. 3.4.30, Euroimmun, Lübeck, Germany] from the scan images of blots. Association was significant between some ANA-IIFA patterns and apparent pANCA positivity, as shown in Table2。在31.5%的核同质阳性样本,观察pANCA显著的方式( )。斑点和DFS70模式也与更高比例的pANCA记录(表2虽然协会并没有统计学意义。总的来说,pANCA积极性是ANA-IIFA-positive样本的三倍(14.7%)比ANA-IIFA-negative样品(4.2%),这是统计学意义( )如表中所描绘的一样2。科恩kappa的两组测试(ANCA-IIFA ENA-blot阳性样本和ANCA-IIFA ANA-IIFA样本)是令人满意的。

4所示。讨论

在当前的研究中,大约19.2%的ANA-positive (ENA-blot)科目(postimmunoblot-see表1显示pANCA干扰。同样,pANCA干扰post-ANA-IIFA被发现的比例14.7%(见表2)。在immunoblot-based测试中,阿拉斯的相对浓度(由年级EUROLineScan软件的分析,获得最高等级显示正在考虑,如果多个安娜目标积极在相同样本)在一个给定的样本与pANCA干扰频率(如表所示1)。可以看出,干扰较低等级(+ +)是比这更(显著)更高年级的安娜积极性(+ + +),这与先前的类似的作品很好地印证了(16]。安娜的模式(在IIFA)与pANCA结果相关性很好。如表中所描绘的一样2,核同质模式(AC1)是最常与可能pANCA干扰(31.5%的病例)与其他模式,如斑点(11.1%)相比,DFS70(10.3%),与着丝粒(6.7%)。这种模式相关性计算与早期作品(16- - - - - -18]。一些研究不包括模式信息,与我们的(17]。我们也分析了免疫印迹结果(表1对我们目前的工作),这是独一无二的。

ANCA-associated主要抗原(髓过氧物酶和蛋白酶3)本地化的细胞质颗粒粒细胞(2,8]。在乙醇固定,细胞脱水,伴随着细胞膜损伤(2,8]。MPO抗原是带正电,得到静电吸引DNA分子(带负电)细胞,并迁移到后者。这就产生了细胞核周围的模式IIFA染色后可观察到的过程给一个模式类似于IIFA-ANCA pANCA测试(另一方面,当同一衬底被福尔马林固定,颗粒和内容是固定在细胞质中,导致cANCA模式MPO和PR3) (2,8]。anti-MPO抗体靶抗原(MPO-antigen吸引electrostatistically对DNA的乙醇基质)和antihistone / anti-dsDNA抗体(组蛋白/ dsDNA)是类似这也许可以解释为什么核同质模式(主要是由于antidouble-stranded DNA抗体或抗体antihistone)更频繁容易给pANCA干涉(表2)[2,3,10,18]。排除安娜干涉积极pANCA情况至关重要疾病相关,致病机制,临床表现,治疗方法不同(3,10]。

Anti-MPO血清中抗体的存在可能是由于不同类型的抗原表位出现在MPO抗原。不可能有一个检测系统(ELISA)覆盖所有epitopes-some这些抗体检测不到(ELISA)可能是临床相关(血管炎导致)3]。因此,另一个可能性是pANCAs可能是由于一个变种anti-MPO抗体特定的抗原决定基不包括在特定类型的免疫测定/ ELISA进行或没有可用的。总的来说,实验室化验区分vasculitis-associated pANCA从pANCA与其他抗原特异性是复杂的。彻底的理解分析目标在一个合乎逻辑的解释是必要的(3]。

可以将目前的工作相关的另一个领域是一个条件的测试策略如自身免疫性肝炎。核同质安娜和非典型ANCA模式的关键实验室标记1型自身免疫性肝炎(19]。后者被认为是一个选择性的标志1型自身免疫性肝炎。抗体(pANCA-related)下面是具体对外围核抗原和不反对细胞质抗原,它将显示一个积极pANCA模式ethanol-fixed formalin-fixed基片衬底和消极。这是非常有用的非典型pANCA的识别。核同质安娜模式与这19,20.]。

这里更相关的是,在大多数相关的自身免疫性肝炎ANA-IIFA-positive病例(2/3rd)模式观察核同质(HEp-2衬底),而(1/3)斑点或核仁的休息。抗原识别在这些情况下单-和双链DNA,核仁的染色质,组蛋白,着丝粒,细胞周期蛋白,ribonuclear蛋白质,和未知的(30%的病例)21]。

我们当前研究的两个限制是一个小样本大小和有偏见的队列(ANA-IIFA-positive样本回顾性的方式作为起点)。我们试图克服这些限制,采取措施,如长期研究持续时间(5年),执行一些测试(免疫印迹)保存样本,包括样本涵盖多个学科/部门不同年龄、性别、临床表现等,和数据分析和数据收集的不同的人。

安娜的整体分析表明存在干扰在ANCA解释在我们的人口。在设置执行IIFA-based ANCA测试可能需要采用一种经济工作流来排除或减少错误由于安娜干扰的问题。现有临床/测试指南建议IIFA-based ANCA检测低抗体阳性样本或消极抗体样本的临床特征的AAV [6,7]。添加一个安娜筛选试验(干扰检测)在这种情况下可以理想和逻辑。这种方法可以是一个经济可行的替代昂贵的选项使用额外的基质(附加formalin-fixed粒细胞和ethanol-fixed HEp-2-granulocyte)每ANCA测试。

缩写

ENA:	可推断出的核抗原
AAV:	ANCA-associated血管炎
ANCA:	Antineutrophil胞质抗体
安娜:	抗核抗体
IIFA:	间接免疫荧光试验
pANCA:	细胞核周围的ANCA
cANCA:	细胞质ANCA。

数据可用性

所有数据与手稿本身是可用的。

的利益冲突

作者(年代)宣布他们没有利益冲突。

确认

作者要感谢导演,全圣地让我们开展这项研究微生物学实验室的部门。我们提供我们真诚感谢实验室技术人员和支持人员在自身免疫性疾病的微生物学,全圣地。我们表达我们的感激和感谢所有的病人(这样品被认为是给谁的回顾性研究)和临床医生在全印度医学科学院的多个部门。

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