文摘
背景。牛皮癣是一种慢性炎性疾病的皮肤和关节,影响近2 - 3%的普通人群。假设不平衡自然微生物群落的类型可以加速疾病的发作。有些真菌可以玩超级抗原的作用,延长牛皮癣患者皮肤的慢性炎症。本调查的目的是确定真菌物种隔离患者牛皮癣。方法。2016年3月至2019年5月,289年之前的诊断牛皮癣患者包括在这次调查中。与氢氧化钾(KOH 10%),直接显微镜文化、尿素水解,头发射孔测试,和增长在米粒被用来确定临床分离株,表型。分子识别假丝酵母物种和细胞死亡物种,PCR-RFLP和PCR-sequencing分别使用。结果。46 289银屑病患者真菌感染(15.9%)。真菌(54.3%),假丝酵母spp。(19.5%),细胞死亡spp。(15.2%),曲霉属真菌spp。(6.5%)镰刀菌素spp。(4.3%)被真菌感染的病原体。在细胞死亡和假丝酵母物种,m . restricta(10.8%)和c . glabrata分别为(8.7%)是最普遍的物种。结论。我们的研究结果表明,真菌病原体,特别是真菌,可能发挥重要作用的致病性牛皮癣。此外,由于高酵母殖民在银屑病患者的临床样本,同时使用抗炎药和抗真菌可能代表一个有效的治疗方法来更好的管理这些患者中慢性病变。真菌学的测试应该被应用到表明银屑病患者的真菌疾病的发病率。
1。介绍
牛皮癣是一种免疫介导的炎症性疾病影响2 - 3%的普通人群(1]。等免疫系统的失调角化细胞增生和浸润的炎症细胞,尤其是单核细胞,中性粒细胞,树突细胞和T淋巴细胞在表皮和真皮,现在被认为是作为一个决定性现象在银屑病的发病机制2]。虽然微生物抗原的性质或自身抗原引发银屑病T细胞仍存在争议,Th1之间的交互,Th17, Th9, Th22, Treg细胞似乎是牛皮癣的发展的重要因素3]。木糖醇的革兰氏阴性细菌,内生细菌,皮肤真菌感染,肠道酵母可能参与银屑病的发展(4- - - - - -6]。牛皮癣是一种multiorgan障碍通常发生在肥胖患者,系统性动脉高血压、2型糖尿病、心血管疾病,焦虑,和非酒精性脂肪肝病(7,8]。本调查的目的是评估银屑病患者真菌感染和病原微生物的鉴定表型和分子技术。
2。材料和方法
这是一个横断面研究真菌学的一个参考实验室(Shefa实验室。)在伊斯法罕,伊朗。2016年3月至2019年5月,289年之前的诊断牛皮癣患者显示钉或皮肤变化包含在这个调查。银屑病是皮肤科医生诊断和确认的专业诊所。病人采取局部或全身性抗真菌药物在前15天被排除在研究(n= 17)。年龄,性别,工作,身体位置,临床表现为每个病人记录。这项研究是通过伊斯法罕大学医学伦理委员会(没有。IR.MUI.MED.REC.1398.634)和书面知情同意是获得所有的病人。
2.1。传统的方法
指甲剪和皮肤屑收集在无菌培养皿直接显微镜检查(测距装置)和文化。氢氧化钾(KOH) 10%和20% +二甲亚砜(DMSO)被用于测距装置的皮肤差点崩溃和指甲剪,分别。Sabouraud葡萄糖琼脂与氯霉素和环己酰亚胺(Mycobiotic琼脂;Difco、底特律、MI)对皮肤真菌(spp), Czapek-Dox琼脂(QUELAB,魁北克,加拿大)(曲霉属真菌spp), Sabouraud葡萄糖琼脂(Difco、底特律、MI),和迪克森的琼脂(HiMedia、印度)细胞死亡spp。)申请文化和孵化30°C和37°C。文化连续检查真菌生长到4周。额外的诊断测试如尿素水解(QUELAB、加拿大),文化营养媒体(琼脂毛癣菌属;BIOMARK、印度),头发射孔测试和增长米粒被用来确认皮肤真菌的主要识别spp。9,10]。
2.2。分子识别假丝酵母物种
2.2.1。DNA提取
基因组DNA提取使用沸腾的方法(11]。总之,铂环量新鲜殖民地于80年暂停了μL双重蒸馏水和煮10分钟,然后在6500 rpm离心机6分钟。包含DNA的上层清液用于PCR。
2.2.2。聚合酶链Reaction-Restriction片段长度多态性(PCR-RFLP)
its1 - 5.8 - srdna its2区域放大了PCR混合物5μL(10×反应缓冲区,1.5毫米MgCl20.4毫米核苷酸30 pmol ITS1(5′太极拳GTA GGT棉酚有条件现金援助GCG三大′)和30 pmol ITS4(5′膀胱移行细胞癌GCT答TGA答GC-3′)引物(12),2.5 U的聚合酶,和3μ在最后一卷50 L DNAμl . PCR循环条件如下:最初的变性阶段在95°C 5分钟,其次是30周期在95°C的变性30年代,在55°C 45 s退火,在72°C和扩展了1分钟,最终扩展阶段在72°C 7分钟。PCR产品消化了下丘脑-垂体-肾上腺轴的二世(Msp我)限制性内切酶(Fermentas维尔纽斯,立陶宛)。5微升的PCR产品和10μL的RFLP扩增子被凝胶电泳分离的琼脂糖凝胶(包含0.5 1.5%和2%μ分别g / mL溴化乙锭)。
2.3。分子识别细胞死亡物种
2.3.1。DNA提取
基因组DNA提取的皮肤屑和头皮屑或从殖民地亚文化Dixon的琼脂(HiMedia、印度)用玻璃珠和苯酚/氯仿技术(13,14]。总之,皮肤规模或头皮屑的铂环量被转移到1.5毫升埃普多夫管,包括300年μL玻璃珠和300年μL裂解缓冲(200毫米三羟甲基氨基甲烷/盐酸液pH值为7.5,25毫米EDTA, 0.5% SDS和250毫米氯化钠)。之后,标本被离心机在7000 rpm为1分钟,然后300年μL的苯酚/氯仿补充说,其次是涡流和离心6分钟5000 rpm。在下面,上层清液被转移到一个新的管,并添加了相同数量的氯仿和离心机在6000转7分钟。随后,上层清液被转移到一个新的管,然后酒精(2.5次)和3 M乙酸钠(1/10体积)添加和储存在−20°C 1 h和离心5分钟在10000。上层清液被删除了,500μL酒精70%添加到小球,当时在12000 rpm离心机12分钟。在最后阶段,上层是丢弃,50μL双重蒸馏水添加和保存在−20°C。
2.3.2。放大的26 s rDNA D1、D2的地区
PCR反应包括5μL (10×PCR缓冲,1.5毫米MgCl2向前,0.5毫米(5′-TAACAAGGATTCCCCTAGTA-3′)和反向(5′-ATTACGCCAGCATCCTAAG-3′)引物(15),每个deoxynucleoside三磷酸的0.2毫米,1.25 U的聚合酶,和2μ在最后一卷50 l模板DNAμl。PCR条件如下:最初的变性步骤5分钟在94°C,紧随其后的是34个变性的周期为45秒94°C,退火为45秒55°C,在72°C和扩展了1分钟,最终扩展步骤72°C的7分钟。PCR产品可视化1.5% (w / v)琼脂糖凝胶电泳在此种缓冲区,沾SYBR安全DNA凝胶染色在此种(1:10000稀释),和拍摄下紫外线透照器(英国UVITEC)。
2.3.3。测序
所有扩增子进行序列分析。他们被乙醇提纯净化方法,循环测序反应进行方向前进(Bioneer、韩国)。测序产品进行评估与浓度2.4 (https://chromas.software.informer.com/2.4/)使用NCBI BLAST搜索和分析对真菌DNA序列中存在的数据库(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)。
2.4。统计分析
卡方和费舍尔的确切在SPSS软件版本测试23 (、IBM、纽约Armonk)应用进行分析。一个被认为具有统计显著性值小于0.05。
3所示。结果
46 289银屑病患者真菌感染(15.9%)。参与者的男女比例是28/18。患者的年龄范围是10至82年。11日至20日的年龄范围(23.9%)和81 - 90年(2.2%)和最低频率最高,分别为(表1)。学生们最常见的感染人群(26.1%),其次是员工(23.9%)和家庭主妇(21.7%)(图1)。糖尿病(19.6%)、特应性皮炎(13%),使用皮质类固醇(10.9%),和广泛的使用抗生素(8.7%)是最真菌感染的诱发因素。肥胖、心血管疾病和吸烟是主要的共病的疾病在银屑病患者(表2)。真菌(54.3%),假丝酵母spp。(19.5%),细胞死亡spp。(15.2%),曲霉属真菌spp。(6.5%)镰刀菌素spp。(4.3%)真菌感染的病原体在当下研究(表3)。在细胞死亡和假丝酵母物种,m . restricta(10.8%)和c . glabrata分别为(8.7%)是最普遍的物种。有趣的是,没有一个假丝酵母物种白色的(图2)。所有的序列细胞死亡种虫害沉积下的基因库中加入数字MT645556 MT645557, MT645569, MT645570, MT645572 MT645573, MT645587。确切概率法表明,银屑病和真菌物种之间的关系并不显著 。
(一)
(b)
4所示。讨论
在过去的十年中,炎症性皮肤疾病和微生物之间的联系已被越来越多的接受(16]。假设不平衡自然微生物群落的类型皮肤和粘膜有可能加速疾病的发病在自身免疫性疾病患者等弱势主机(17]。各种微生物包括真菌、病毒和细菌可以扮演超级抗原(凹陷)触发特异性T细胞和发起、强化和延长慢性炎症皮肤病(18]。例如,它已被证明金黄色葡萄球菌在牛皮癣皮肤殖民和过敏性皮炎(19,20.]。许多真菌与细菌相似,也被公认在鼓励肤质淋巴组织。假丝酵母物种是人类微生物区系的重要组成部分,通常殖民泌尿生殖器的粘膜膜和胃食管的大片和皮肤。他们导致感染患者的免疫系统受损21]。尽管微生物的重要作用在炎症性皮肤病的发病机制分析,此连接被忽视的真菌。过度增长的假丝酵母物种被发现在患者的皮肤炎症性皮肤病如牛皮癣和过敏性皮炎(22]。假丝酵母病毒抗原,主要表面蛋白白念珠菌,已被证明有superantigen-like续集,后多克隆T细胞激活和控制释放促炎细胞因子(23]。在一个荟萃分析由Pietrzak et al。21),所有分析调查显示更高的口头殖民假丝酵母银屑病患者。他们建议牛皮癣可能的系统性疾病引起口腔念珠菌病;然而,我们没有检测银屑病患者的口腔殖民或口咽念珠菌病在目前的研究。Picciani等人显示26%的银屑病患者口腔念珠菌病(与对照组相比24]。抗菌肽(安培),这是非常在银屑病患者的皮肤,可以抑制假丝酵母种虫害的增长(25];然而,塔Sarvtin等人报道假丝酵母物种隔绝皮肤样品的15%的银屑病患者相比,4%的健康人(26]。我们分离假丝酵母种虫害的皮肤屑牛皮癣患者的4.3%。假丝酵母主要的物种,白念珠菌是最常见的病原体分离型银屑病患者的临床样本4),但是没有假丝酵母物种白色的在目前的调查(图2)。虽然男性和女性相同影响牛皮癣寻常的,年轻的病人中,女性比男性更容易受到影响(2]。抗真菌药物被证实能够减少炎症在牛皮癣4];然而,我们没有评估这个变量的影响,因为抗真菌药物的使用是我们研究的排除标准之一。牛皮癣患者的甲真菌病的发生是有争议的,从10%到56%不等(5,27]。一个可能的解释是,指甲在银屑病的病理变化,如角化过度、点蚀,甲脱离,错综复杂的分辨从甲真菌病临床和精确的评估依赖于真菌学的测试。甲癣的银屑病患者可能与银屑病指甲异常毛细管单位损害免疫防御通常提供的完整的甲床和银屑病患者免疫抑制药物的使用。另一方面,更快的周转牛皮癣患者的指甲可能注意到作为一个重要的防御机制对真菌入侵(28]。目前调查的局限性之一是缺乏对照组比较牛皮癣患者的甲真菌病的速度和控制人口;然而,大多数真菌感染在我们的研究中属于指甲感染(52.2%)。这是不到钉子参与报道Jendoubi et al。28)和Zargari et al。29日)分别为71.2%和69.5%,分别。符合我们的发现,指甲凹陷是最常见的指甲矩阵参与银屑病患者(30.]。一些文献显示,85 - 90%的患者牛皮癣扩大钉一生参与(31日),但73%的病人在本研究钉牛皮癣。Leibovici et al。27]显示更高的指甲感染患病率男性和老年病人。在协议中,我们还发现男性更高频率的甲真菌病;然而,青少年是最受感染的人群在我们的调查。一些研究证实我们的发现32,33],和其他人否认[34,35]。Leibovici等人报告了更高比例的皮肤真菌的真菌感染的病原微生物的分布毛癣菌属石(35.4%)在临床标本(27),而Epidermophyton floccosum和t . interdigitale / mentagrophytes是最常见的皮肤真菌物种在目前的调查(30%)。尽管如此,在一些报纸,牛皮癣患者的皮真菌病的患病率较低(36,37),在其他的研究中,这种感染的患病率更高的银屑病患者与对照组(5,38]。
5。结论
银屑病患者真菌感染的流行是有争议的。我们的研究结果表明,真菌病原体,特别是真菌,可能发挥重要作用的致病性牛皮癣。此外,由于高酵母殖民在银屑病患者临床样本,同时使用抗炎药和抗真菌可能代表一个有效的治疗方法来更好的管理这些患者中慢性病变。此外,我们发现,银屑病患者真菌感染的发生并不像普遍认为高深。真菌学的测试应该被应用到表明银屑病患者的真菌疾病的发病率。
数据可用性
本研究基于数据可从相应的作者。此外,序列数据用于支持这项研究的结果已经存入基因库库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/sequenceids/)加入数字MT645556、MT645557 MT645569, MT645570, MT645572 MT645573, MT645587。
的利益冲突
作者宣称没有利益冲突有关的出版。
确认
作者感谢Shefa实验室人员进行数据收集的患者。本研究在伊斯法罕医科大学的支持下,伊斯法罕、伊朗(没有。298224)。