浸润CD16⁺是否与外周血CD14减少有关⁺CD16⁺⁺单核细胞与狼疮肾炎的严重形式

摘要

我们的目的是描述肾小球单核细胞(Mo)浸润的特征，并将其与周围循环Mo亚群和狼疮性肾炎(LN)的严重程度联系起来。方法．我们评估了一家转诊医院的48例LN活检样本。显微镜下观察Mo细胞，免疫组化CD14、CD16染色。根据细胞数量，我们将LN样本分为低弥漫性浸润(<5个细胞)和高弥漫性浸润(≥5个细胞)。采用流式细胞术对外周血Mo亚群进行免疫分型。结果．平均年龄是年和平均SLEDAI是．SLE最常见的表现为蛋白尿(91%)和低补血(75%)。70%的患者出现严重LN (III类，27%;第四类,43%)。重症LN患者和CD16分级较高的患者⁺浸润的非经典细胞(CD14)水平较低⁺CD16⁺⁺)外周血中Mo含量。结论．我们的研究结果可能表明，那些LN越严重的患者CD14级别越高⁺CD16⁺浸润和外周血非经典细胞(CD14⁺CD16⁺⁺) Mo，可能反映了肾组织的招募过程。然而，鉴于样本较小，我们的结果必须仔细解释。

1.介绍

系统性红斑狼疮(Systemic lupus erythematosus, SLE)是最具代表性的自身免疫性疾病，是肾脏受累的主要特征之一。狼疮肾炎(LN)是SLE的标志特征之一，诊断时出现在40%-60%的患者中，是这些患者死亡的主要原因之一[1］．10 - 15%的患者在随访期间可能发展为终末期肾病，可能需要肾替代治疗和/或肾移植[2，3.］．

在SLE的发病机制中，先天免疫和免疫复合物已被广泛评估，但一些细胞机制尚未被深入描述。单核细胞(Mo)在形态、表型和功能上都是异质性的细胞。在人类中，已经描述了三种不同的循环Mo亚群。这些子集是根据CD14和CD16的表达来定义的。在健康受试者中，90%的Mo是CD14⁺⁺CD16⁻(经典Mo);4%有表型CD14⁺⁺CD16⁺(中度)，也被认为是成熟的，可以参与炎症反应。第三个亚群是CD14⁺CD16⁺⁺(非经典)与其他Mo亚群相比，IL-10的产生率较低[4］．

虽然这些亚群的作用是有争议的，但众所周知，它们可以通过CD16识别免疫复合物，还可以区分不同类型的细胞，如巨噬细胞或树突状细胞(DC)，并可以极化适应性免疫反应[5］．

Mo细胞亚群的主要修饰在SLE患者中尚未被广泛研究。我们最近描述了CD14⁺CD16⁺⁺Mo在活动性SLE患者中减少，并显示与其功能相关的分子变化[6］．这些发现可能提示这些亚群在SLE的发病机制中以及最终在LN的肾组织病变中发挥潜在作用。

有足够的“体外”证据表明CD16亚群在GM-CSF, TGF-的存在下可分化为DCβ、IL-10，但未完全成熟。以这种方式，非经典的CD16⁺Mo可能在参与组织损伤的SLE中作为先天和适应性反应的重要免疫调节剂发挥作用，甚至在其分化为巨噬细胞之前[7- - - - - -10］．

先前的一些研究已经在小鼠模型中调查了Mo的一些亚群[11]，但关于人类的信息有限[12，13］．这在一定程度上解释了小鼠和人类吞噬细胞之间的差异，Mo亚群的广泛变异，以及小鼠和人类模型之间的翻译研究缺乏等效性。

LN的发病机制尚不清楚。一些先前的研究表明，吞噬细胞CD14⁺CD16⁺可能参与肾小球浸润，与免疫复合物相互作用，并调节炎症反应的某些阶段，包括抗原呈递过程[14］．

鉴于之前的信息以及缺乏对LN患者的研究，我们的目的是描述肾组织中肾小球Mo浸润的特征，并将这些浸润与外周血Mo水平、疾病特征、疾病活动和组织学特征联系起来。

2.材料和方法

2．1．选择的样本

我们从安蒂奥奎亚大学病学系的临床记录中纳入328例经组织病理学和免疫荧光诊断为LN的活检样本。从2000年到2011年，328例样本中有241例是在哥伦比亚San Vicente Fundación医院Medellín进行的。仅纳入年龄大于18岁的患者(）.最后，48个组织样本被归类为足以进行新的分析。

2．2．组织病理学研究和免疫组化

肾活检石蜡包埋，切片4μm;然后这些样品在二甲苯中脱烃，并使用分级浓度的乙醇复水。标本用苏木精和伊红染色，在光镜下观察。根据ISN/RPS标准对组织病理状态进行分类。增殖性LN患者按严重LN分组。活动和慢性指标的组织学外观也评估基于国家卫生研究院评分。一位观察者(LA)在不了解临床病程的情况下检查了肾组织，并使用标准的病理方法确定诊断。SLE发病时肾脏受累或病程少于1年的患者被归类为早期LN。

使用不同的抗体，包括CD14: Thermo Scientific, Rockford, Illinois, USA，编号MA5-11394，稀释1:40;CD16: Thermo Scientific，编号MA5-11413，稀释1:200;CD68: Dako, Carpinteria, USA, code M0876，稀释1:200。这些单克隆抗体在室温下培养60分钟。过氧化氢阻断内源性过氧化物酶。抗原回收用热(蒸汽)和三缓冲液与乙二胺四乙酸在pH 7.0下保存30分钟。所使用的检测系统是基于聚合物(Ultravision Quanto, Thermo Fisher Scientific, Fremont, CA, USA)。

在显微镜下对Mo细胞进行识别。通过以下参数对阳性标记物进行量化:如果染色呈阳性，但同时有<2个细胞，则将染色分为“弥漫性”，并对弥漫性浸润进行如下评分:高度弥漫性≥5个细胞或低程度弥漫性<5个细胞。如果定量检测到超过2个细胞聚集在一起，则归类为“聚集物”。根据细胞计数的数量将聚集物分类为1级，小于5个细胞计数;2级，5至10个细胞计数;3级，超过10个细胞计数。

2．3.单核细胞亚群的免疫表型

Mo亚群体定义为三个亚群，根据以往的经典文献，(CD14⁺⁺CD16⁻)、nonclassic (CD14⁺CD16⁺⁺)和中间(CD14⁺⁺CD16⁺)莫15］．简单地说，用抗cd14 - percp、抗cd16 - fitc、抗hla - dr - pe或同型对照对25微升edta抗凝外周血进行染色。样品混合，室温黑暗孵育20分钟。用250μL的OptiLyse，并使用FACS Canto™II (Becton Dickinson, San Jose, CA)进行分析。将手工计数与绝对计数进行比较。所有患者均给予研究知情同意。这项研究得到了安蒂奥基亚大学医学研究所伦理委员会的批准。

２.４.统计分析

对几个变量进行了二分类分析。增殖性LN患者分为重度LN。此外，根据疾病持续时间(早期LN与非早期LN)和CD16的程度对患者进行分类⁺渗透(低或高水平)正如我们上面提到的。值表示为方法。正态分布变量的均值差异使用参数进行分析-检验，使用Wilcoxon检验评估非正态分布的变量。使用IBM SPSS v22统计软件包进行分析。

3.结果

共纳入48例活检证实为LN的Mestizo患者，其中87%为女性，平均病程为年。56%的患者有早发性LN。整个组的中位年龄为年。蛋白尿是最常见的肾脏特征(91%)，其次是血尿(66%)和无菌脓尿(38%)。主要临床特征见表1．平均24小时蛋白尿水平为平均肾小球滤过率(GFR)为毫升/分钟。不出所料，重症LN患者的蛋白尿水平明显高于非重症LN患者(与毫克,）.各组间GFR无差异。

系统性红斑狼疮疾病活动性指数(SLEDAI)平均评分为．我们观察到大多数患者的疾病活动度很高，部分原因是肾脏受累的比重(12分)。

3．1.病理特征

增殖性肾小球肾炎(IV类)21例(43.8%)，III类肾炎13例(27%)，II类和V类LN各6例(12.5%)。只有2例患者被归类为I类LN。我们使用了Rovin提出的活动和慢性指数[14]作为我们描述组织学发现的指南。急性病变最常见的表现是细胞增殖(83%)和核碎裂(25%)。71%的病例可见管状间质浸润。在少数患者中发现动脉和小动脉异常。

慢性改变在肾活组织检查中较少报道。肾小管和肾小球纤维化分别为37%和8%。其他慢性变化包括37%的患者出现管状萎缩，27%的患者出现基底膜增厚，10.4%的患者出现动脉硬化，8.3%的患者出现动脉透明变性。组织学表现见表2．

根据美国国立卫生研究院(National Institutes of Health)的评分，我们比较了II类和IV类LN的活动和慢性指数评分。IV级LN患者肾脏活检的急性和慢性指标均明显高于III级LN患者。平均急性指数为与，，平均慢性指数为与，，分别适用于III类和IV类。

3．2．Mo渗透体的表征

扩散CD16⁺在25例活检和CD14中发现细胞⁺只有16个活组织检查的细胞。代表性图片如图所示1CD16的免疫染色⁺和CD14细胞。

CD16弥漫性浸润程度较高的患者低补血发生率较高(100%对0%，)、较高但不显著的dsDNA抗体水平和较高的疾病活动性(SLEDAI评分≥10)。5名患者有CD16⁺莫总量。所有聚集为3级的患者在组织学分类中均为IV级LN。1例II类LN患者为1级，1例III类LN患者为聚集2级。关于CD14⁺在III类LN患者中观察到Mo细胞，仅积累1级聚集物。

3．3.外围莫子集

21例患者肾活检前后均有Mo亚群。绝对钼的平均水平为细胞/μL,古典莫细胞/μL,中间莫细胞/μL和非经典的Mo细胞/μL.当我们将患者分为严重型和非严重型LN时，严重型患者外周血中非经典Mo水平较低(与细胞/μl,图2(一个)）.当我们根据弥漫性CD16对患者进行分类时⁺浸润程度高或低，浸润程度高的患者外周血非经典Mo水平较低(与细胞/μl,图2 (b)）.表格3.根据疾病持续时间、LN严重程度和浸润程度总结了不同Mo亚群的水平。

同时，患者的CD16程度较高⁺浸润组的活动指数评分较高，但不显著(与，)及较高的慢性疾病指数评分(与，）.我们没有发现外周血Mo亚群与临床特征、血清学标志物(包括补体抗体或抗dsdna)或疾病活动性(SLEDAI)有任何关联。

4.讨论

Mo和巨噬细胞在小鼠模型和人类肾脏疾病中发挥重要作用。这些细胞不仅参与了肾脏损伤和纤维化等多个过程，而且还参与了多个修复过程。我们发现，重症LN(增生性)患者的弥漫性CD16级别更高⁺莫浸润。同时，严重型的外周血非经典Mo水平较低，这可能反映了更严重型LN(增生性III和IV型)中Mo细胞的器官募集现象。

Mo/巨噬细胞系系链细胞是参与多种肾脏疾病炎症过程的重要细胞之一。几项研究表明，在受损组织中发现的巨噬细胞数量不仅是炎症过程的旁观者，而且还像其他一些体外研究中发生的细胞一样发挥着活跃的作用[16］．巨噬细胞分布在全身的组织中，对体内平衡和疾病都有贡献。近年来，用于Mo/巨噬细胞测定的各种表面标记物越来越多，这使得肾脏和其他组织中不同亚群的鉴定成为可能。Mo亚居群在功能上是不同的。其中一些亚群与细胞因子产生的选择性模式有关[7，8］．

体外研究表明，巨噬细胞可以被多种细胞因子激活而极化。活化细胞和极化细胞有不同的功能。起初，极化的细胞被称为“经典”或“替代”Mo。然而，其他一些作者认为Mo应该根据其表型(基于表面分子)或其功能进行标记[17- - - - - -19］．脂多糖(LPS)受体(CD14)与Fc的表达差异γ受体III (CD16)已被用于区分不同的Mo亚群[4，20.］．

我们发现CD16有更多的弥漫性浸润和聚集⁺更严重的LN患者的细胞。CD16⁺为非经典或中间态Mo⁺细胞产生肿瘤坏死因子-α和干扰素(IFN)γ)，并参与炎症过程。此外,CD16⁺表达II类分子，具有更有效的抗原提呈能力。

之前，我们观察到SLE患者的CD16水平较低⁺在外周血中，指器官外的分化过程和受损器官内的细胞募集[6］．由于自身免疫现象，Mo在器官损伤过程的各个阶段都积极参与，这在一定程度上解释了Mo在炎症组织中的募集。Mo参与凋亡小体和免疫复合物的清除过程。此外，Mo可以诱导多种参与LN发病机制的细胞因子的产生(如IFN)γ）.最后，Mo促进上皮细胞和微血管的纤维化和丧失[21，22］．考虑到慢性指数评分与高CD16程度之间的关联⁺在我们的研究中，CD16 Mo可能不仅参与早期急性肾小球损伤过程，而且参与我们前面提到的慢性纤维化和微血管过程。

Fractalkine (CX3CL1)及其受体CX3CR1，已知介导细胞粘附和细胞迁移。在人类中，CX3CR1表达于Mo/巨噬细胞和细胞毒效应淋巴细胞，如自然杀伤细胞和细胞毒T细胞。在小鼠中，其在循环血细胞中的表达仅限于Mo/巨噬细胞和NK细胞。对Mo在LN中的作用的小鼠和人类研究还很有限。利用MRL/lpr小鼠模型，Nakatani和他的同事[11显示fractalkine表达和CD16⁺钼的浸润随LN的进展而增加。在另一项研究中，在LN早期阶段对MRL/lpr小鼠使用fractalkine拮抗剂[23］．与对照组小鼠相比，接受fractalkine拮抗剂的MRL/lpr小鼠肾小球高细胞性、肾小球硬化、新月状形成和血管炎明显减少。

Yoshimoto等人[12]评价fractalkine和CD16在肾小球中的表达⁺钼在LN患者中的作用。作者发现fractalkine肾小球表达与LN的组织病理学活性指数和增殖形式相关。此外，CD16的浸润量⁺Mo在SLE患者增生性肾小球病变中较高。

据我们所知，这是第一个将外周血Mo水平与肾组织Mo浸润相关联的研究。我们的研究表明外周血非经典Mo水平与高弥漫性CD16呈负相关⁺增生性LN患者肾小球组织的浸润细胞。

我们的研究有一些局限性。首先，我们分析了相对少数的活检证实为LN的患者。然而，尽管样本很小，我们根据CD16发现各组(重度和非重度)之间存在显著差异⁺Mo在外周血的浸润和亚群。考虑到本研究的性质，我们不能同时测量所有肾脏标本Mo浸润检测患者外周血中Mo的亚群。同样，由于我们医院是全身性自身免疫性疾病的参考中心，主要接受的患者医疗服务有限，因此我们的患者可以作为更严重的SLE合并LN患者的选择样本。最后，考虑到我们的大多数患者是mesestizo，我们的结果必须仔细解释，必须在其他具有不同种族/民族分布的人群中得到证实。

总之，我们的研究结果表明，活检证实有LN的Mestizo患者中，那些更严重形式的LN患者外周血非经典Mo (CD14)水平较低⁺CD16⁺⁺）.这些Mo亚群的减少可以部分解释为肾脏组织的募集过程。鉴于目前研究的样本很小，我们的结果必须仔细解释。尽管在临床研究中Mo在LN中的作用的信息有限，但使用fractalkine拮抗剂的动物模型研究为重症LN患者的治疗开辟了一个潜在的新靶点。到目前为止，还没有正在进行的临床试验来评估fractalkine拮抗剂对LN患者的潜在益处。

缩写

DC:	树突细胞
干扰素γ：	干扰素γ
LN:	狼疮肾炎
有限合伙人:	脂多糖
莫:	单核细胞
系统性红斑狼疮:	系统性红斑狼疮
咽部菌:	系统性红斑狼疮疾病活动性指数。

相互竞争的利益

两位作者宣称他们没有相互竞争的利益。

作者的贡献

Anabel Barrera García构思了这项研究，参与了数据分析，并批准了手稿的最终版本。José A. Gómez-Puerta参与了该项目的设计，并撰写并批准了最终的稿件版本。Luis F. Arias参与了肾脏活检的数据分析，并批准了手稿的最终版本。Catalina Burbano和Mauricio Rojas参与了单核细胞亚群的数据分析，审核并批准了手稿的最终版本。Mauricio Restrepo、Adriana L. Vanegas、Carlos H. Muñoz和Luis A. González参与了患者招募，并审核并批准了手稿的最终版本。Gloria Vásquez参与了研究的设计，支持数据分析，审核并批准了最终的手稿版本。所有作者阅读并批准了最终的手稿。

致谢

本研究得到了Colciencias项目的支持。11556933532(合同编号。575-2013)和安蒂奥基亚大学的Sostenibilidad项目。J. A. Gómez-Puerta得到了Colciencias的支持。656/2014)。

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