GAKG-RGEKG是引起免疫交叉反应的抗原表位普氏菌sp.和人胶原蛋白:慢性牙周炎分子拟态的证据

摘要

世界上20%的人口患有牙周病。这个过程通常以昏睡和慢性的形式发生，因此这个疾病被称为慢性过程。所有慢性疾病都不断引起免疫系统的激活，因此由专业抗原呈递细胞呈递到淋巴细胞的微生物肽能呈递与人类经济重要结构非常相似的微生物肽，从而引起自身免疫性疾病，这一过程称为分子拟态。因此，本研究的目的是验证牙周病原体与人蛋白之间存在分子拟态现象。将Socransky牙周复合物对人胶原进行爆破，然后利用MHI结合虚拟法对相似蛋白进行建模和筛选。制备所选的表位，并获得慢性牙周志愿者的血浆，进行点免疫结合试验。假设蛋白质的普氏菌Sp.和人胶原抗原表位相似性高，斑点免疫结合阳性。这一结果表明，牙周病可能发生拟态现象。

1.介绍

自从Socransky发表牙龈下菌斑的微生物复合体以来，人们对与牙周病进化直接相关的微生物有了更多的了解;而且已经有可能确定新的治疗方法[1］．然而，Socransky提出，患有慢性牙周炎的受试者有Porphyromonas gingivalis，梅毒denticola,拟杆菌连翘，属于红色复合体[1］．

这些严格的厌氧菌具有许多毒性因子，这些因子以这种方式激活免疫系统，免疫反应导致牙齿支持组织的破坏。Ximenes的另一个有趣的修订描述了龈上菌群的复合体，这表明与龈下菌群相比几乎没有什么不同[2］．

对抗这些微生物复合物的免疫反应只有一个相似之处:炎症。众所周知，牙龈下菌斑会导致牙龈发炎，但不会破坏牙齿支持组织。也就是说，一旦通过清除牙菌斑消除了病因(也就是说)，这种炎症就消失了;但如果炎症由于牙菌斑的积累而持续，它会导致先天和适应性免疫系统的激活，导致牙齿支持物的再吸收。如果不通过牙周治疗来阻止这一过程，最终会导致牙块脱落[3.］．

牙齿支持组织的破坏过程是通过使用tlr(主要是TLR4)激活固有细胞(中性粒细胞和巨噬细胞)来解释的，识别龈下菌斑中主要革兰氏阴性厌氧微生物的LPS，并将通过NF-kB促进炎症胞嘧啶的转录。因此，这种炎症胞嘧啶类似于TNF-α, il - 1β，而IL-6一旦分泌，将负责RANKL的产生和分泌，RANKL将与其RANK接收器形成复合物，用于破骨细胞的分化和生存机制[3.- - - - - -5］．

伴随的先天免疫的答案,牙周细菌动员机制的适应性免疫反应,是专业的细胞(巨噬细胞和树突细胞)的先天免疫,目前认识到微生物通过tlr,一旦吞噬,第一个刺激他们的成熟,第二种胞嘧啶谱图将通过MHC II决定特异性抗原淋巴细胞的随后极化和激活[6］．T-helper CD4+淋巴细胞亚群在对抗刺激时将占主导地位，它们将服从损伤部位的当前胞嘧啶类型。因为Th2淋巴细胞将具有与体液和抗炎应答相关的表型[7，8］．

另一方面，Th17淋巴细胞的存在及其胞嘧啶IL-17的分泌会增加先天免疫细胞对微生物的应答作用。这个答案的本质是破坏骨骼支撑。然而，在自身免疫性疾病(如风湿性关节炎)破坏的组织中也发现了IL-17。然而，一些作者认为，当这种胞嘧啶在损伤中出现时，通过患者接受更多的牙周治疗，可以维持牙齿支持的破坏，从而导致自身免疫牙周炎[3.- - - - - -5］．

许多研究将类风湿关节炎、冠状动脉综合征、甚至红斑狼疮等自身免疫性疾病与牙周炎联系起来;这可以证明分子模拟现象可以发生在口腔内，免疫系统处于激活状态，能够破坏自身组织[9- - - - - -12］．分子拟态被定义为微生物与另一生物组织(在本例中是人类组织)之间的蛋白质或类似肽的序列。这种现象通常与自身免疫性疾病有关[13］．

对T细胞和B细胞的免疫耐受假设有许多教育过程，在这些细胞中，如果它们首先不能识别组织相容性主要复合物I和II，如果它们识别自己的结构，就会被清除。因此，分子模拟不服从这一教育过程。它的发生仅仅是因为某些微生物结构与客体的某些成分相似，从而导致自身免疫疾病。这一过程的一个例子发生在免疫反应对蛋白m链球菌对心肌肌凝蛋白产生交叉反应，促进心脏损伤[14］．

另一个发生这种现象的例子是胰腺细胞，这是由于与I型糖尿病病毒感染相关的T细胞的交叉答案[15］．最后一个例子是类似的白细胞交叉反应答:actinomycetemcomitans以及分子模拟破坏牙周组织过程中观察到的糖蛋白- b2，因为本研究中白蛋白肽与糖蛋白- b2肽的相似性为60% [16］．

本研究的目的是验证牙周病原体与人蛋白之间存在分子拟态现象。

2.材料和方法

2．1.序列对齐:爆炸

免费的BLAST程序(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)工作。首先，对Socransky描述的人类蛋白质与牙周病原体细菌的蛋白质进行了总体比对。随后，使用DNASTAR Lasergene软件(美国威斯康星州)对具有相似性的蛋白质进行了第二次单独blast。

2．2.表位亲和力预测

MHCpred免费计划(http://www.ddg-pharmfac.net/mhcpred/MHCPred/)来评估所发现序列的亲和力普氏菌sp.假设的蛋白质，由更大的组织相容性的II型人类，我们使用等位基因MHC II HLA-DPA101 / DPB104:01和HLA-DPA101:03 / DPB102:01。

2．3.蛋白质建模

实时瑞士模型程序(http://swissmodel.expasy.org/)用来完成蛋白质的建模。一旦获得，就进行尝试，然后使用PyMOL (https://www.pymol.org/）

２.４.斑点免疫结合技术试验的病人选择和获得

选择来自大学牙科诊所Católica de Santa María患有慢性牙周炎的自愿患者。根据1999年牙周病分类诊断为慢性牙周炎[17，牙周袋大于6mm，牙菌斑堆积，牙槽骨丢失。

选取11名志愿者，从每位患者身上抽取20 mL血液，然后继续采集血浆。获得的等离子体被小心地储存起来，以备以后使用。随后，所讨论的肽从ByoSynthesis (Texas, USA)获得，随后提交给diva技术，由Sumi等人描述[18］．

3.结果

３．１．序列对齐:爆炸

用BLAST方法可以发现一种微生物肽，与人类胶原蛋白相似度超过90%。这种差异仅仅是10个氨基酸的总表位中1个氨基酸的差异(见表1)1)．

３.２．表位亲和力预测

普氏菌sp.遵循MHC II的排列，百分比主要为85%(方框1和2)．

4.蛋白质建模

Swiss-Model和PyMOL程序得到了非常相似的结构(图)1(一)和1 (b)）

这些蛋白质具有3个具有相似特征的螺旋结构。

5.DIBA

结果显示，7例慢性牙周炎患者的样本结扎阳性较强(++)，3例阳性较轻(+)，1例未结扎阳性(-)(图)2)．

6.讨论

牙周病的病因显然是由微生物引起的，如果不清除这种侵袭剂，它会以这样一种方式激活免疫系统，导致慢性骨吸收，导致受影响的牙块完全脱落。因此，免疫系统的激活开始于巨噬细胞通过TLR2和TLR4的激活途径对微生物的识别，导致炎症胞质的出现，随后表达RANKL，用于破骨细胞的激活和生存机制[5，19］．然而，在慢性牙周病中，由于微生物生物膜与免疫细胞的接触，淋巴细胞的抗原持续存在;因此，适应性免疫系统被激活[5，6，8，19］．

的普氏菌在Socransky的复杂橙色中，已经描述了一些物种，比如出现在牙周病初期的细菌:牙龈炎。该物种拥有一系列的毒性因子(粘附、竞争、水平基因转移等)[20.能够产生牙周炎症的症状。然而，本种并不像该病中重要的牙周病原体那样被分类。

分子拟态是一种理论可能性，即某一生物的抗原决定基序列与另一微生物的某些成分相似，在牙周炎症中证明是明显的[16与免疫细胞直接结合的微生物数量。一些研究已经能够证实这一事实，发现类风湿性关节炎损伤中的抗体[16，21- - - - - -25，特别是针对p . gingivalis．因此，只有两篇科学文章证实了抗体对普氏菌类风湿性关节炎中的Sp. [23，26］．

我们的结果证实了这两个发现，除了描述了产生分子模拟的表位，这在科学文献中还没有描述。因此，这个表位属于一种功能未知的蛋白质，其结构似乎与人类胶原蛋白非常相似。除了对MHC II有反应外，类似的细菌蛋白与人类胶原蛋白的相似性之前已经有报道和研究[27，我们的研究结果证实了这一点。这一结果为解释类风湿关节炎的起源提供了重要的一步，因为针对这一细菌表位的抗体也通过相似性对人类胶原蛋白产生反应。因此，抗原表位GAKG-RGEKG可以被认为是一个自身抗原。

今后的研究必须以发现这种蛋白质在某种程度上的功能为指导普氏菌并观察类风湿关节炎患者的这种反应。

7.结论

这一结果表明，分子模拟现象在牙周病中存在，几乎在牙龈炎症的初始阶段，引起影响胶原蛋白的自身免疫性疾病，如风湿性关节炎。

相互竞争的利益

作者声明，本研究不存在利益冲突。

致谢

目前的工作是在秘鲁Vicerrectorado de Investigación de la Universidad Católica de Santa María de Arequipa的研究基金下进行的。

参考文献

1. S. S. Socransky, A. D. Haffajee, M. A. Cugini, C. Smith, and R. L. Kent Jr.，《龈下菌斑的微生物复合体》临床牙周医学杂志，第25卷，第2期2，第134-144页，1998。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
2. l.a. Ximénez-Fyvie, A. D. Haffajee和S. S. Socransky，“成人牙周炎患者龈上和龈下菌斑的微生物组成”，临床牙周医学杂志第27卷第2期10，页722-732,2000。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
3. R. A. Kayal，“骨免疫学在牙周病中的作用”，生物医学研究的国际， 2013, vol. 2013, Article ID 639368, 12页，2013。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
4. S. J. Kim和B. Diamond， "致耐受性树突状细胞和自身免疫的调节"细胞与发育生物学研讨会，第41卷，第49-58页，2015。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
5. J. M. Kramer和S. L. Gaffen，《白细胞介素-17:炎症、自身免疫和治疗的新范式》，牙周病学杂志》第78期6, pp. 1083-1093, 2007。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
6. R. Kennedy, D. F. Lappin, P. M. Dixon, D. Bennett, M. P. Riggio，《马牙周炎和口腔健康中的牙龈toll样受体和细胞因子信使RNA水平》，马兽医杂志》, 2016年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
7. L. Campbell, E. Millhouse, J. Malcolm和S. Culshaw，“T细胞，牙齿和组织的破坏——T细胞在牙周病中做什么?”分子微生物学口语第31卷第1期6、pp. 445-456, 2016。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
8. N. Silva, L. Abusleme, D. Bravo等人，“牙周病的宿主反应机制”，应用口腔科学杂志，第23卷，第2期。3, pp. 329-355, 2015。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
9. C. Danzer和J. Mattner，“微生物对自身免疫性疾病的影响”，免疫档案和实验治疗第61卷第1期3, pp. 175-186, 2013。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
10. A. D. Proal, P. J. Albert和T. G. Marshall，《人类微生物组和自身免疫》，风湿病学的最新观点，第25卷，第2期2, pp. 234-240, 2013。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
11. R. Root-Bernstein和D. Fairweather，《感染和自身免疫关系的复杂性》，当前过敏和哮喘报告第14卷第1号条款407年,2014年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
12. C. Sie, T. Korn, M. Mitsdoerffer，“中枢神经系统自身免疫中的Th17细胞”实验神经学，第262卷，第18-27页，2014。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
13. S. Benvenga, A. Antonelli，和R. Vita，“环境污染背景下的甲状腺结节和甲状腺自身免疫”，内分泌和代谢紊乱综述，第16卷，第5期。4, pp. 319-340, 2016。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
14. R. Root-Bernstein, J. Vonck，和A. Podufaly，“柯萨奇病毒和链球菌在诱发风湿性心脏病和自身免疫性心肌炎中的抗原互补性，”自身免疫，第42卷，第2期1, pp. 1 - 16, 2009。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
15. K. T. Coppieters, A. Wiberg, M. G. von Herrath，《1型糖尿病的病毒感染和分子拟态》学院号，第120卷。12，页941-949,2012。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
16. Wang D.， T. Nagasawa, Y. Chen et al.，“Aggregatibacter放线菌共生菌的分子拟态β2糖蛋白我。”口腔微生物学与免疫学，第23卷，第2期。5，页401-405,2008。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
17. G. C. Armitage，“牙周病和牙周病分类系统的发展”，《牙周病学，第4卷，第4期。1，第1 - 6页，1999。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
18. S. Sumi, A. Mathai，和V. V. Radhakrishnan，“斑点免疫结合试验”，在蛋白质印迹和检测:方法和方案，第536卷方法和协议，第89-93页，施普林格，柏林，德国，2009。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
19. M. Sarra, F. Pallone和G. Monteleone，《慢性炎症性疾病中的白细胞介素-21》，BioFactors第39卷第3期4, pp. 368-373, 2013。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
20. 阮勇，沈磊，邹勇等，“比较基因组分析普氏菌媒介物从受感染根管分离的菌株显示出与致病性和适应性相关的特征。BMC基因组学， 2015年第16卷，第122条。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
21. A. Ballini, S. Tetè， A. Scattarella等，“抗环瓜氨酸肽抗体在牙周病中的作用”，国际免疫病理学和药理学杂志，第23卷，第2期。2，页677-681,2010。视图:谷歌学术搜索
22. T. R. Mikuls, J. B. Payne, R. A. Reinhardt等，“类风湿性关节炎和牙周炎患者对牙龈卟啉单胞菌(P. gingivalis)的抗体反应”，国际免疫药理学，第9卷，第5期。1，第38-42页，2009。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
23. K. Moen, J. G. Brun, T. M. Madland, T. Tynning, R. Jonsson，“免疫球蛋白G和A抗体对拟杆菌forsythus和普氏菌媒介物在关节炎患者的血清和滑膜液中临床和诊断实验室免疫学，第10卷，第5期。6，第1043-1050页，2003。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
24. M. Ogrendik, S. Kokino, F. Ozdemir, P. S. Bird, S. Hamlet，“类风湿性关节炎患者口腔厌氧菌的血清抗体”，MedGenMed: Medscape全科医学第7卷第1号条款2、2005。视图:谷歌学术搜索
25. R. Seror, S. Le Gall-David, M. Bonnaure-Mallet et al.，“反的协会Porphyromonas gingivalis早期类风湿性关节炎患者不吸烟状态的抗体滴度:来自早期类风湿性关节炎患者前瞻性队列的结果关节炎与风湿病学，第67卷，第5期7, pp. 1729-1737, 2015。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
26. D.马西斯，《关于关节炎的直觉》eLife，第2卷，文章编号e01608, 2013。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
27. Z. Yu, B. An, J. A. M. Ramshaw, B. Brodsky，“形成三螺旋结构的细菌胶原样蛋白”，结构生物学杂志第186期3, pp. 451-461, 2014。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索

版权

版权所有©2016 Gustavo Alberto Obando-Pereda。这是一篇发布在知识共享署名许可协议，允许在任何媒介上不受限制地使用、传播和复制，但必须正确引用原作。