治疗效果的皂素丰富的一部分牛膝根粗林恩。在Sprague-Dawley Adjuvant-Induced关节炎大鼠

文摘

目标。牛膝根粗林恩。(AA)在民间用于治疗各种炎症性疾病和关节炎等条件。抗炎活性皂苷(SR)分数丰富的AA之前已经报道过了。本研究的目的是评估SR的抗关节炎药效果的一部分牛膝根粗在adjuvant-induced关节炎大鼠。方法。关节炎是关节炎评分,评估爪子体积,tibiotarsal联合厚度的变化,痛觉过敏的参数,和脾脏和胸腺指数。血液学的、血清生化、炎性细胞因子在活的有机体内抗氧化参数测量研究的最后一天。结果。SR分数显著抑制爪肿胀和关节炎评分和提高痛阈的能动性和爬楼梯的测试。有一个逆转的水平改变参数,丙氨酸转氨酶、天冬氨酸转氨酶、碱性磷酸酶、和抗氧化参数如超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、谷胱甘肽、丙二醛、一氧化氮。SR分数显著降低血浆肿瘤坏死因子-α水平和白细胞介素- 6。此外,组织病理学显示显著减少滑膜增生,炎症细胞浸润,关节和骨破坏。结论。这些观察结果解释的治疗效益SR的AA在镇压adjuvant-induced关节炎大鼠的进展。

1。介绍

类风湿性关节炎(RA)是一种慢性自身免疫性疾病,包括疼痛综合症,僵硬和对称动关节的滑膜炎导致缓慢渐进的疾病,其特征是持续崩溃的关节软骨和软骨下骨的变化。RA影响大约1%的世界人口,更常见于女性比男性3:1比率[1,2]。目前,类风湿性关节炎是由疾病修饰治疗风湿病的临床治疗主要是药物(DMARDs),如甲氨蝶呤、柳氮磺胺吡啶,及非甾体类抗炎药(非甾体抗炎药),包括布洛芬、aceclofenac,萘普生结合类固醇激素可的松和强的松(3]。然而,这些药物只瞬变抑制炎症和缓解症状为治疗可治愈的不可用市场的后果与关节炎有关。因此,探索新的治疗风湿病的药物疗效高、低毒性是必要的。

牛膝根粗(AA)瀑布。(苋科)是广泛分布在亚洲,南美,非洲4]。每年,多年生、僵硬和直立草本成长1米高(5]。答:粗线传统上用于治疗痔疮,肾水肿、咳嗽、肺炎、肾结石、皮肤疹、蛇咬、淋病、痢疾、哮喘、高血压和糖尿病(4,6]。AA已经报道了其初步的抗炎和抗关节炎药活动,antinociceptive,抗真菌,免疫调节绝育和堕胎药,antiurolithiatic和抗焦虑的活动(6- - - - - -12]。

我们先前的研究展品皂素丰富的AA (SR)分数具有抗炎效果通过activity-guided分馏(13]。三萜皂甙从草药关注由于其结构的多样性和生物活性抗肿瘤、抗真菌、抗病毒,anticoronary的心dieseaes [3]。因此,我们当前的研究旨在证实抗关节炎的皂素效果丰富的一部分答:粗线并探讨其潜在机制ajuvant-induced关节炎大鼠。

2。材料和方法

2.1。植物材料

整个工厂的牛膝根粗收集从领主区在2013年10月,印度马哈拉施特拉邦。植物材料验证了Ganesh艾耶教授Ramnarain鲁亚学院Matunga(东),孟买。凭证标本(2012/02)的植物在植物标本存放药品科技、化学技术研究所,孟买,印度。

2.2。试剂

欺诈完全佐剂(FCA)和吲哚美辛买来Sigma-Aldrich(圣路易斯,密苏里州,美国)。ELISA检测包从KRISHGEN购买生物系统、印度。所有其他化学物质和用于研究均为分析纯试剂采购从Sigma-Aldrich(圣路易斯,密苏里州,美国)。

2.3。分数的准备

整个干植物(3.5千克)与甲醇提取和过滤。提取(418克)溶解在水中,切块用石油醚、氯仿、乙酸乙酯n丁醇,先后。生物活性石油醚分数与甲醇分区。Methanolic分数进一步吸收水和乙醚,直到所有reextracted叶绿素色素被移除。然后水相分区n丁醇。的n丁醇部分集中到干燥和皂素的混合物(5.60 g)。

2.4。动物

Sprague-Dawley成年雌性大鼠(180 - 200克)是来自动物的房子,Haffkine生物制药有限公司,孟买。动物被维护在一个12小时光/暗周期,在控制房间温度(25±1°C)和相对湿度(55±5%)。啮齿动物的动物喂养标准饮食与免费的水随意。所有的动物都适应于前一周的实验室环境实验。动物伦理委员会的药品科技、化学技术研究所,孟买,批准所有实验协议按照委员会控制和监督的目的动物实验(CPCSEA)的指导方针。

2.5。Adjuvant-Induced关节炎大鼠

SD大鼠随机分为5组,即对照组,FCA对照组,阳性对照组的吲哚美辛(1毫克/公斤)和SR分数(50和100毫克/公斤)组,每组六个老鼠。除对照组,关节炎是由单一注射诱导0.1毫升的FCA进入左后爪在0天。这个主要免疫后,治疗组口服接种与SR分数(50和100毫克/公斤),吲哚美辛(1毫克/公斤),而正常对照组和FCA对照组被给予相同体积的生理盐水。所有组织都是口头管理这些剂量每日关节炎感应,直到实验结束后(28天)。

2.6。测量关节炎的进展

2.6.1。爪测量体积和Tibiotarsal联合厚度和关节炎评分

爪子体积和tibiotarsal联合注射爪厚度测量使用plethysmometer(模型没有。7140年,尤格巴西、意大利)和数字卡尺(Mitutoya、日本)天0,7日,14日,21日,分别和后28天车辆/药物管理局(14]。关节炎的严重性评估使用以下标准:在0 - 4 0 menas没有水肿或肿胀,1意味着轻微水肿和红斑有限,2意味着从脚踝轻微水肿和红斑跗骨,3表示中度水肿和红斑从脚踝到睑板骨,和4意味着水肿和红斑从脚踝到整个腿。分数的总和为所有4四肢关节炎指数计算,最大可能的得分16每鼠(15]。

2.6.2。背弯曲疼痛,活性测试和爬楼梯的能力(16]

在背屈痛(DFP), FCA注入爪子得分是基于尖叫和腿撤军后大鼠踝关节的弯曲五次,直到脚趾摸腿的前面。DFP得分从0到2:得分0,如果没有尖叫和腿部撤军;得分为1,如果有发出或腿撤军;分数2,如果发出和腿撤军。观察运动性的5分钟,从0到2分。得分0:老鼠避免接触地面的脚;分数1:老鼠与困难同行脚趾接触地面;分数2:老鼠很容易走。在爬楼梯能力测试中,训练老鼠被允许爬上楼梯与步骤5,10,15厘米水在第二和第三步上的食物。这爬楼梯能力得分从0到3,得分0如果老鼠没有爬一步,得分1如果他们爬到步骤1,分数2如果他们爬到步骤2,得分3如果他们爬到步骤3。

2.6.3。胸腺和脾脏指数

在动物免疫后的28天,牺牲和胸腺和脾脏被立即删除,重。胸腺和脾脏指数的比率表示为胸腺和脾湿重与体重(毫克/ g),分别为(14]。

2.6.4。血液学的分析

在28天FCA注射后,大鼠的血液样本中收集的EDTA包含管从retroorbital静脉穿刺。总从血液样本和差动测定白细胞计数。

2.6.5。在肝脏生化分析

动物牺牲后28天免疫;肝脏被迅速删除和存储在−70°C。肝脏是均相的一部分。匀浆离心机在6000 x在4°C g 20分钟,上层的收集。上层清液是用来测量超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT),减少谷胱甘肽(GSH)、丙二醛(MDA)和一氧化氮(NO)活动(14]。

2.6.6。生化分析血清和血浆细胞因子水平

的碱性磷酸酶(ALP)、天冬氨酸转氨酶(AST)、丙氨酸转氨酶(ALT)血清使用定量测定比色测定试剂盒(制造的名字),根据制造商的指示。(il - 1)和肿瘤坏死因子-α(TNF -α)在等离子体是由使用商用大鼠细胞因子ELISA试剂盒,根据制造商的指示14]。

2.6.7。组织病理学评价膝关节

在28天FCA注射后,血液采集后所有的老鼠都牺牲了。膝关节的爪子被注入组织病理学检查。关节固定在10%磷酸缓冲福尔马林,脱钙10% EDTA 30天在4°C,然后嵌入石蜡。部分5μm是苏木精和伊红染色())和光学显微镜下检查。

2.7。统计分析

数据表示为均值±SEM和统计的比较进行了使用单向方差分析(方差分析)其次是事后Dunnett比较控制和测试组的测试。背弯曲疼痛,爬楼梯能力测试和能动性表示为平均分数和克鲁斯卡尔-沃利斯检验是用来比较组。在确定的最低级别的意义。

3所示。结果

3.1。SR分数对大鼠后爪体积,Tibiotarsal关节厚度,和关节炎评分

鼠爪肿胀趋势如图1(一),正确的后爪肿胀增加到28天。SR分数(50和100毫克/公斤)和吲哚美辛(1毫克/公斤)治疗组显著降低爪子水肿与FCA控制()。后第14天,显然辨认tibiotarsal联合厚度的变化观察治疗组相比FCA治疗组。在第七天,没有发现显著差异在tibiotarsal关节所有组(图的厚度1 (b))。关节炎得分天7、14、21、28日由物理观察。SR分数(100毫克/公斤)治疗显著()抑制关节炎评分FCA注入大鼠后爪从14天、28天。然而,SR分数50毫克/公斤显著降低关节炎评分在28天(表1)。

3.2。SR分数对背屈曲的影响疼痛,活性测试和爬楼梯的能力

如图2,FCA-induced关节炎大鼠表现出低阈值的痛觉过敏的参数如背弯曲疼痛疼痛,能动性,爬楼梯的能力。背弯曲疼痛治疗与SR分数剂量100毫克/公斤显示意义减少平均得分在28天相比,治疗关节炎大鼠()。治疗消炎痛和SR分数显示改善受损的能动性模式相比,治疗关节炎组。此外,SR分数在剂量为100毫克/公斤表现出显著(爬楼梯)增加得分21天,28天关节炎相比对照组。

3.3。胸腺和脾脏指数

胸腺和脾脏指数在28天化验。结果报告的增加胸腺和脾脏指数FCA对照组与正常对照组相比。有显著()降低胸腺和脾脏指数在SR分数治疗组(表2)。

3.4。血液学的考试

外周血剖面的变化观察注射后28天的葬礼后老鼠的爪子。吲哚美辛(1毫克/公斤)显示白细胞总数显著减少。然而,没有显著性差异在SR分数治疗大鼠血液学的概要文件(表3)。

3.5。生化检查在肝匀浆

SOD的影响,猫、谷胱甘肽、MDA,没有在表中做了总结4。SOD、CAT、谷胱甘肽活动明显减少,而MDA和FCA对照组相比没有水平明显增加正常控制()。治疗SR分数(50和100毫克/公斤)和吲哚美辛(1毫克/公斤)显示显著调制以上抗氧化指标。因此SR一部分潜在的抗氧化作用。

3.6。血清生化分析

表5描述了SR分数的影响在关节炎大鼠血清标记酶水平的组织。AST水平显著增加,在关节炎大鼠观察ALT和高山。SR管理部分(50和100毫克/公斤)和吲哚美辛(1毫克/公斤)相比显著恢复这些索引FCA控制()。

3.7。血浆细胞因子水平

等离子体水平的炎性细胞因子TNF -α和il - 6在治疗关节炎大鼠明显高于治疗组()。剂SR分数50和100毫克/公斤明显抑制TNF -的生产α和il - 6在关节炎大鼠(图3)。

3.8。组织病理学检查

组织病理学结果如图4。在关节炎组关节周围软组织肿胀也都有不同程度的炎症细胞浸润,滑膜增生,关节软骨的破坏。tibiotarsal关节的组织学图像改善关节炎动物对待SR分数(50和100毫克/公斤),作为证据,显著减少滑膜增生和炎症细胞浸润,揭示了SR分数的保护作用在关节炎。

4所示。讨论

关节炎是一种免疫介导的破坏关节,以疼痛、肿胀、压痛,困难的运动。的事件突显关节炎的进展是由几种趋化因子如白细胞介素(il - 1、il - 6和il - 10)、肿瘤坏死因子(TNF -α)、干扰素(INF -γ)+白细胞,附着力因素(17]。当前的治疗通常涉及免疫抑制剂的使用伴随着一系列不良事件,尤其是在长期治疗。近似人类的动物模型骨关节炎adjuvant-induced关节炎大鼠(18]。皮下的死亡分枝杆菌H37Ra引起免疫反应的激活,导致白细胞聚集在随后造成的关节疼痛和炎症(19]。非甾体抗炎药是有效减轻关节疼痛和肿胀与滑液积累有关。然而,他们并不是特别有效的规避疾病进展。在这里,我们选择了吲哚美辛作为标准治疗,因为它在人类关节炎临床疗效。在这项研究中,我们对老鼠有0.1毫升的弗氏完全佐剂和评估关节炎的发展在不同的阶段,用爪子体积和tibiotarsal联合厚度。尽管在爪子显著增加体积和tibiotarsal厚度明显只有14天,表明滑液积累,增加适度减少了吲哚美辛和SR治疗组(100毫克/公斤)14天,与阴性对照组相比。效果观察SR(50毫克/公斤)组中只有28天。

疼痛是一个重要的参数来评估运动性联合破坏的影响。痛觉过敏是关节炎发展的重要指标,可以通过痛苦的直接测量和评估其对活性的影响。在这项研究中,SR分数(100毫克/公斤)显著提高痛阈的痛觉过敏的老鼠在28天。SR(100毫克/公斤)的影响在爬楼梯更加明显从21日开始,而显著增加运动性得分明显只有28天。吲哚美辛始终显示改善运动性和爬楼梯的分数从第14天开始;然而影响疼痛评分明显之后才20天。这表明,抗炎作用比对疼痛的影响更加明显,这可能是由于减少促炎细胞因子。研究结果进一步支持的重要的抑制作用SR分数(50毫克/公斤和100毫克/公斤)在肿瘤坏死因子的水平α和血浆il - 6的FCA-challenged老鼠。

虽然免疫因素负责触发致病事件导致关节炎、氧化事件在疾病进展中发挥作用。根据Halliwel,脂质过氧化,引起免疫反应的结果,最终导致氧化增加,进一步加剧了条件(20.]。增加氧化应激产生的水平减少固有的抗氧化酶谷胱甘肽peroxidise,过氧化氢酶和超氧化物歧化酶(21]。与抗氧化防御下降,并发增加活性氧的水平和一氧化氮(NO),因此增加的脂质过氧化作用因MDA升高(22]。SR分数显著恢复治疗抗氧化状态通过减少没有和MDA水平,提高SOD的含量,过氧化氢酶、谷胱甘肽酶。

临床、关节炎已经知道导致白细胞特别是白细胞水平上升伴随着扩大在脾23]。脾脏被报道参与白细胞的存储和招聘网站的炎症。管理FCA导致血液白细胞总数增加表明白细胞参与应对antigen-mediated关节炎的侮辱。这些变化被SR治疗显著逆转分数(50和100毫克/公斤)。治疗SR分数(50和100毫克/公斤)也导致显著降低脾脏的重量。

组织病理学分析FCA诱导关节炎大鼠表现出轻微的炎症细胞的浸润程度,滑膜增生,关节软骨的破坏。治疗SR(50和100毫克/公斤)显著提高的组织学tibiotarsal关节,导致减少破坏和炎症的证据。

本研究结果揭示的一个重要潜在SR的一部分牛膝根粗在减缓关节炎的进展和逆转病理变化造成关节炎的发展。这种效应可以归因于减少细胞因子的水平,TNF -α和其他促炎因子。同时,这可能意味着改善氧化应激可能是由于直接抗氧化作用的SR分数加上改善身体的天然抗氧化剂酶介导的防御。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

确认

作者感谢博士Ganesh艾耶植物材料的识别。作者也要感谢仙露Chaudhary女士在这项研究中起到了推波助澜的作用。作者要感谢金融大学拨款委员会(UGC)的支持下,印度新德里(没有。F 5-63/2007)。

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