人类肝但不是CNS-Expressed c反应蛋白在转基因小鼠实验性自身免疫性脑脊髓炎抑制gydF4y2Ba

文摘gydF4y2Ba

我们最近表明,人类的c反应蛋白(CRP),表示hepatically转基因小鼠(CRPtg),改善实验性自身免疫性脑脊髓炎的结果(运算单元),多发性硬化症(MS)的小鼠模型。肝脏是在人类和c反应蛋白合成的主站点CRPtg老鼠也表达了在中枢神经系统的低水平。来确定中枢神经系统的表达人类的CRP是足以影响运算单元,我们生成的神经元c反应蛋白转基因小鼠(nCRPtg)在人类CRP表达式是由特异性神经元CagydF4y2Ba^{2 +gydF4y2Ba}/ calmodulin-dependent蛋白激酶二世gydF4y2BaαgydF4y2Ba(CaMKIIgydF4y2BaαgydF4y2Ba)基因启动子。我们发现hepatically表达/血液中的c反应蛋白,但不是中枢神经系统表达了CRP,严重降低实验性自身免疫性脑脊髓炎。这些结果表明,人类表现CRP在实验性自身免疫性脑脊髓炎的保护措施的边缘,而不是在中枢神经系统和揭示先前未被欣赏的网站特异性CRP在中枢神经系统疾病的有益的行动。gydF4y2Ba

1。介绍gydF4y2Ba

c反应蛋白(CRP)是一种血源性急性期反应物生成主要由肝细胞(gydF4y2Ba1gydF4y2Ba]。结合配体表达在细菌和受损组织及随后促进炎症和免疫过程通过激活或抑制的补充或参与各种Fc受体(gydF4y2Ba2gydF4y2Ba,gydF4y2Ba3gydF4y2Ba]。越来越多的证据表明,血源性CRP可以穿过血脑和blood-spinal绳壁垒,从而可以发现CRP的脑脊液(CSF) (gydF4y2Ba4gydF4y2Ba,gydF4y2Ba5gydF4y2Ba和沉积在中枢神经系统病变gydF4y2Ba6gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba8gydF4y2Ba]。c反应蛋白的来源也可能是当地然而,c反应蛋白生产由多个CNS-resident细胞包括神经元,小胶质细胞和星形胶质细胞被报道(gydF4y2Ba9gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba11gydF4y2Ba]。不管它的起源(肝与当地),CRP在中枢神经系统的存在与许多疾病,包括阿尔茨海默病(gydF4y2Ba8gydF4y2Ba,gydF4y2Ba9gydF4y2Ba,gydF4y2Ba12gydF4y2Ba),肌萎缩性脊髓侧索硬化症(gydF4y2Ba13gydF4y2Ba),多发性硬化症(MS) (gydF4y2Ba12gydF4y2Ba,gydF4y2Ba14gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

我们实验室已经使用转基因小鼠肝脏中表达人类CRP (CRPtg) [gydF4y2Ba15gydF4y2Ba)表明,血液传播人类CRP改善实验性自身免疫性脑脊髓炎(运算单元),[女士的啮齿动物模型gydF4y2Ba16gydF4y2Ba]。我们观察到在CRPtg延迟性和温和的临床症状的实验性自身免疫性脑脊髓炎与野生型小鼠相比,结果我们属性的人类encephalitogenic CRP-mediated抑制T细胞(gydF4y2Ba16gydF4y2Ba]。这个场景是一致的保护作用hepatically派生/血液传播人类CRP,我们已经记录在其他自身免疫的小鼠模型gydF4y2Ba17gydF4y2Ba]。研究表明,额外的实验性自身免疫性脑脊髓炎人类CRP CRPtg改善疾病的能力取决于其能力抑制类型IIB Fcγ受体(FcgydF4y2BaγgydF4y2BaRIIB) [gydF4y2Ba18gydF4y2Ba),发现这可能部分解释了紧张性抑制CRP对T cell-driven自身免疫的影响(gydF4y2Ba16gydF4y2Ba,gydF4y2Ba17gydF4y2Ba]。仍然是未知的,然而,无论是人类CRP发挥其保护作用在外围对实验性自身免疫性脑脊髓炎或中枢神经系统。本研究进行直接解决这个问题。gydF4y2Ba

我们生成的老鼠在人类的表情gydF4y2Bac反应蛋白gydF4y2Ba转基因是由CagydF4y2Ba^{2 +gydF4y2Ba}/ calmodulin-dependent蛋白激酶二世gydF4y2BaαgydF4y2Ba(CaMKIIgydF4y2BaαgydF4y2Ba)基因启动子gydF4y2Ba19gydF4y2Ba]。CaMKIIgydF4y2BaαgydF4y2Ba由所表达的观察神经元在大脑和脊髓gydF4y2Ba19gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba23gydF4y2Ba]。我们证明,在这些神经元CRPtg老鼠(nCRPtg)人gydF4y2Bac反应蛋白gydF4y2BamRNA表达和蛋白的生产受到限制的中枢神经系统和c反应蛋白的存在gydF4y2Ba本身gydF4y2Ba不改变中枢神经系统实质的炎症状态。与血源性肝血统的人类CRP (gydF4y2Ba16gydF4y2Ba,gydF4y2Ba18gydF4y2Ba),CSF-borne CRP的中枢神经系统的起源并没有减弱运算单元。这一发现强烈表明,c反应蛋白的有益的行动可能表现在实验性自身免疫性脑脊髓炎外围的影响,揭示了先前未被发现的位置专CRP在中枢神经系统自身免疫性疾病。gydF4y2Ba

2。材料和方法gydF4y2Ba

2.1。代nCRPtg老鼠gydF4y2Ba

针对人类c反应蛋白的表达我们利用鼠标的中枢神经系统gydF4y2BaCaMKIIgydF4y2BaαgydF4y2Ba基因启动子构建之前用来驱动神经元表达的转基因产品(gydF4y2Ba19gydF4y2Ba,gydF4y2Ba21gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba23gydF4y2Ba]。的gydF4y2BaCaMKIIgydF4y2BaαgydF4y2Ba启动子克隆是一个慷慨的礼物马克Mayford(斯克里普斯研究所的拉霍亚,CA)和其他地方已经被完全描述gydF4y2Ba19gydF4y2Ba]。简而言之,一个3.2 kbp cDNA插入编码人类gydF4y2Bac反应蛋白gydF4y2Ba基因被消化和结扎NotI独特gydF4y2BaNotIgydF4y2Ba网站pMM403,立即8.5 kbp的上游gydF4y2BaCaMKIIgydF4y2BaαgydF4y2Ba启动子(图gydF4y2Ba1(一)gydF4y2Ba)。的方向gydF4y2Bac反应蛋白gydF4y2Ba插入和结果的完整性gydF4y2BaCaMKIIgydF4y2BaαgydF4y2Bac反应蛋白gydF4y2Ba构造(图gydF4y2Ba1(一)gydF4y2Ba)检查的线性化质粒通过HindIII消化直接DNA测序紧随其后。的表达gydF4y2BaCaMKIIgydF4y2BaαgydF4y2Bac反应蛋白gydF4y2BamRNA验证了该瞬时转染培养小鼠神经N2a细胞(数据未显示),和转基因老鼠在南加州大学癌症中心进行转基因注入核心设施的线性化gydF4y2BaCaMKIIgydF4y2BaαgydF4y2Bac反应蛋白gydF4y2Ba直接构建到C57BL / 6 pronuclei,紧随其后的是受精卵转移到pseudopregnant女性。基因组DNA分离结果小狗被筛选聚合酶链反应(PCR)检测转基因(图gydF4y2Ba1(一)gydF4y2Ba)。两轮注射了五nCRPtg积极的老鼠。CRPtg老鼠,同样在C57BL / 6的背景,详细描述了在其他地方(gydF4y2Ba15gydF4y2Ba]。CRPtg,人类c反应蛋白表达主要在肝脏和作为急性期反应物,达到血液水平与观察到的人类与炎症性疾病(高达500gydF4y2BaμgydF4y2Bag / mL) (gydF4y2Ba15gydF4y2Ba]。所有老鼠一个标准的鼠标球饮食(Ralston Purina饮食)gydF4y2Ba随意gydF4y2Ba并保持在恒定的湿度在标准条件下(gydF4y2Ba%)和温度(gydF4y2Ba°C) 12小时光周期(6点。下午6点)。所有协议都是机构的动物保健和使用委员会批准在伯明翰阿拉巴马大学一致gydF4y2Ba指导实验室动物保健和使用的gydF4y2Ba发表的美国国立卫生研究院(NIH出版96 - 01、1996年修订)。gydF4y2Ba

2.2。gydF4y2Ba原位gydF4y2Ba杂交和免疫荧光gydF4y2Ba

麻醉小鼠灌注冷磷酸盐通过transcardial灌注(PBS)。一个小切口在右心房,无菌注射器插入左心室,PBS慢慢注入,直到所有的器官都完全灌注。大脑、脊髓和肝脏被删除并处理。冻结的部分(10到16gydF4y2BaμgydF4y2Bam)被用于gydF4y2Ba原位gydF4y2Ba杂交和免疫荧光研究。意识和反义digoxigenin-labeled riboprobes特定的人类gydF4y2Bac反应蛋白gydF4y2Ba信使rna用于杂交(gydF4y2Ba17gydF4y2Ba),其次是顺序洗涤和immunodetection使用碱性磷酸酶抗体结合。杂交信号是一夜之间使用氯化硝基四唑蓝/ 5-bromo-4-chloro-3-indolyl磷酸(电视台/ BCIP)衬底(罗氏)和光学显微镜捕捉到的图像标准。免疫荧光,冰冻切片染色的单克隆抗体对人类CRP直接共轭异硫氰酸荧光素(FITC)(芬兰图尔库,疯狂的;马伯4 c28f)和复染色对核抗原单克隆抗体NeuN(标记的神经元)直接结合生物素(微孔、Billerica马;mAb377)。anti-NeuN抗体检测使用streptavidin-Texas红共轭(Gilbertsville罗克兰免疫化学,PA;目录号S000-09)。细胞核染色使用4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)(包含IHC世界,伍德斯托克,MA)。荧光显微图捕获使用徕卡显微镜DMRB 40 x放大。gydF4y2Ba

2.3。定量逆转录聚合酶链反应(存在)gydF4y2Ba

衡量人类gydF4y2Bac反应蛋白gydF4y2Ba表达总RNA提取灌注孤立的器官使用试剂盒根据制造商的指示(表达载体,宏伟的岛,纽约)。RNA当时对待DNaseI (Ambion,宏伟的岛,纽约)和互补脱氧核糖核酸合成使用iScript工具包(Bio-Rad大力神,CA)。SYBR绿色Mastermix (Bio-Rad)和人类gydF4y2Bac反应蛋白gydF4y2Ba引物被用来放大cDNA CFX96 thermocycler (Bio-Rad)。评估mRNA加工使用gydF4y2Bac反应蛋白gydF4y2Ba引物退火,外显子1(意义:5′-CTCTCATGCTTTTGGCCAGAC-3′)和外显子2(反义:5′-CTACTGTGACTTCAGGAACCTC-3′)(图gydF4y2Ba1(一)gydF4y2Ba,小箭头),产生576个基点的扩增子如果基因内区在场或288个基点如果基因内区(图缺席gydF4y2Ba1 (b)gydF4y2Ba)。否则我们使用的引物,扩增外显子2的209个基点拉伸(意义:5′-TTTACAGTGGGTGGGTCTGAA-3′和反义:5′-CCACCGAAGGAATCCTG-3′)(大箭头在图gydF4y2Ba1(一)gydF4y2Ba)。所有gydF4y2Bac反应蛋白gydF4y2Ba存在放大反应运行使用下列条件:初始变性5分钟在95°C,紧随其后的是50周期放大(95°C 10秒,55°C,持续30秒,30秒和72°C)和最后一个65°C伸长了30秒。为了确保纯度,融化曲线分析了从95°C的温度降低0.5°C的每一步。测量表达神经元一氧化氮合酶(gydF4y2BanNOSgydF4y2Ba),诱导一氧化氮合酶(gydF4y2Ba伊诺gydF4y2Ba)、内皮一氧化氮合酶(gydF4y2Ba以挪士gydF4y2Ba),神经胶质酸性纤丝的蛋白(gydF4y2BaGFAPgydF4y2Ba),gydF4y2BaCD68gydF4y2Ba,我们使用了类似的协议,只有在引物序列和不同退火温度。引物序列和退火温度如下:gydF4y2BanNOSgydF4y2Ba(意义:5′-GGGCAAACAGTCTCCTACCA-3′和反义:5′-AGGGTGTCAGTGAGGACCAC-3′,退火温度60°C);gydF4y2Ba伊诺gydF4y2Ba(意义:5′-TGCATGGACCAGTATAAGCAAGC-3′和反义:5′-GCTTCTGGTCGATGTCATGCAA-3′,退火温度60°C);gydF4y2Ba以挪士gydF4y2Ba(意义:5′-TGTCTGCGGCGATGTCACTATG-3′和反义:5′-CGAAAATGTCCTCGTGGTAGCG-3′,退火温度60°C);gydF4y2BaGFAPgydF4y2Ba(意义:5′-GCAGAAGCTCCAAGATGAAAC-3′和反义:5′-CCTTTCTCTCCAAATCCACAC-3′,退火温度54°C);gydF4y2BaCD68gydF4y2Ba(感觉5′-GCACAGTGGACATTCATGGC-3′和反义:5′CGGTTGCAAGAGAAACATGG-3′,退火温度为51.3°C)。为每一个感兴趣的基因mRNA表达规范化表达甘油醛3 -磷酸脱氢酶(gydF4y2BaGAPDHgydF4y2Ba),使用以下引物扩增:意义:(5′- ATTCTTCCACCTTTGATGC-3′)和反义:(5′- TGGTCCAGGGTTTCTTACT-3′)。所有表达数据使用ΔCt方法表示。gydF4y2Ba

2.4。脑脊液和血液收集gydF4y2Ba

CSF收集使用修改既定的方法(gydF4y2Ba24gydF4y2Ba]。简而言之,深麻醉下了一个口子从枕骨脖子的后面,分离肌肉组织和暴露小脑延髓池上方的脑膜。轻轻插入一个小毛细管之间枕骨突起和阿特拉斯的脊柱,因此渗透atlantooccipital膜。CSF在慢慢收集通过允许内部填充毛细管腔的压力;的产量10 - 20gydF4y2BaμgydF4y2BaL获得明确的液体通常是没有血液污染的迹象。脑脊液样本存储在4°C和分析在24小时内。肝素化血液收集的颌下脸颊穿孔(gydF4y2Ba25gydF4y2Ba)和血浆储存在−20°C到分析不到一个星期后。在某些情况下,收集脑脊液和血液从小鼠24小时后ip管理25gydF4y2BaμgydF4y2Ba克细菌脂多糖(gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba055:B5, Sigma-Aldrich)。血液、脑脊液和脑匀浆CRP水平取决于人类特定ELISA CRP。gydF4y2Ba

2.5。感应的运算单元gydF4y2Ba

髓鞘少突细胞蛋白肽(MOG)gydF4y2Ba被用来进行免疫接种小鼠如前所述[gydF4y2Ba16gydF4y2Ba,gydF4y2Ba18gydF4y2Ba]。0天,小鼠皮下注射了150gydF4y2BaμgydF4y2BaggydF4y2Ba在不完全弗氏佐剂乳化包含500gydF4y2BaμgydF4y2Bag heat-killedgydF4y2Ba结核分枝杆菌gydF4y2Ba(底特律Difco MI)。也在0天又2天,老鼠收到200 ng的腹腔内注射百日咳毒素(生物实验室名单,坎贝尔,CA)。使用临床症状发展的实验性自身免疫性脑脊髓炎每天监测范围从0到6如下:0,无症状;1、失去尾巴基调;2、弛缓性的尾巴;3,不完整的一个或两个后肢瘫痪;4,完整的后肢瘫痪;5、垂死的(在这种情况下,动物是人道的安乐死);6,死了。老鼠发现了至少30天。 All immunized mice developed EAE, and with the day of onset considered to be the first of two consecutive days the clinical score reached or eclipsed 2. The maximum clinical score achieved by each animal during the 30-day observation period was averaged for each genotype and used to estimate disease severity, and for each genotype the daily average clinical score was plotted. The cumulative disease index (CDI) was determined by summation of clinical scores from the day of disease onset to day 30.

2.6。统计分析gydF4y2Ba

所有统计数据作为意味着相关标准错误。组差异由单向方差分析(方差分析)和事后图基的多重比较测试。在所有情况下,一个值gydF4y2Ba被认为是显著的。gydF4y2Ba

3所示。结果与讨论gydF4y2Ba

两个最初的五个转基因小鼠(nCRPtg8和nCRPtg10)被牺牲,用来确认gydF4y2Bac反应蛋白gydF4y2Ba信使rna表达并适当处理gydF4y2Ba在活的有机体内gydF4y2Ba(图gydF4y2Ba1 (b)gydF4y2Ba)和c反应蛋白的蛋白质是在中枢神经系统(图gydF4y2Ba1 (c)gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba原位gydF4y2Ba杂交利用digoxigenin-labelled riboprobes又免疫荧光显微镜利用反c反应蛋白结合anti-NeuN抗体证实人类gydF4y2Bac反应蛋白gydF4y2Ba信使rna(图gydF4y2Ba2gydF4y2Ba,(b)、(b1)和蛋白质(图(b2))和c反应蛋白gydF4y2Ba2gydF4y2Ba,(e)和(e1))都是局部神经元在中枢神经系统内。其余nCRPtg野生型C57BL / 6小鼠交配,证实了生殖系nCRPtg13转基因的传播。nCRPtg13因此担任的创始人和是野生型C57BL / 6小鼠交配产生所有后续研究动物。强劲nCRPtg13表达人类的后代gydF4y2Bac反应蛋白gydF4y2Ba信使rna在他们的大脑和脊髓,但不是在他们的肝脏(图gydF4y2Ba3(一个)gydF4y2Ba)。更重要的是,人类CRP的脑脊液蛋白检测nCRPtg(图gydF4y2Ba3 (b)gydF4y2Ba),但不是在血液里,即使在有限合伙人注入(数字gydF4y2Ba3 (b)gydF4y2Ba和gydF4y2Ba3 (c)gydF4y2Ba)。按照最初的报道(gydF4y2Ba15gydF4y2Ba在CRPtg),我们观察到健壮的人类gydF4y2Bac反应蛋白gydF4y2Ba表达式在肝脏(图gydF4y2Ba3(一个)gydF4y2Ba)和大量的血液中的c反应蛋白的蛋白质,特别是在有限合伙人注入(图gydF4y2Ba3 (c)gydF4y2Ba)。这些结果是一致的与中枢神经系统的独家nCRPtg人力c反应蛋白的来源。没有胚胎杀伤力,性别特异性,或不寻常的表型相关神经元c反应蛋白已被观察到。gydF4y2Ba

来判断是否神经c反应蛋白表达改变中枢神经系统的炎症环境,我们测量基线几个不同的中枢神经系统炎症生物标记物的表达。这些标记是中枢神经系统的调节nCRPtg(图gydF4y2Ba4gydF4y2Ba)。已经证实,人类gydF4y2Bac反应蛋白gydF4y2Ba蛋白质表达和CRP在nCRPtg限制到中枢神经系统,CRP在中枢神经系统炎症的存在,我们测试是否CNS-expressed CRP足以影响。MOG peptide-induced实验性自身免疫性脑脊髓炎的结果正如我们之前的报道(gydF4y2Ba16gydF4y2Ba,gydF4y2Ba18gydF4y2Ba出现明显延迟),我们发现实验性自身免疫性脑脊髓炎严重性和实验性自身免疫性脑脊髓炎CRPtg与野生型相比显著降低,但神经元(图c反应蛋白的表达没有这样的影响gydF4y2Ba5gydF4y2Ba和表gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

人类c反应蛋白的表达在中枢神经系统中记录的几组(gydF4y2Ba9gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba11gydF4y2Ba),而当地表达相对较低,在肝脏,它可能仍然有重要的生理和/或心理后果(gydF4y2Ba26gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba28gydF4y2Ba]。在本文中,我们报告的生成一个新的转基因小鼠在人类gydF4y2Bac反应蛋白gydF4y2Ba由neuron-targeting表达转基因。据我们所知,这是第一次人类c反应蛋白转基因动物在人类的CRP是表达的细胞在肝脏以外,第一个模型在人类的c反应蛋白的蛋白质生产仅限于中枢神经系统。使用这些老鼠我们提供重要的新证据表明,c反应蛋白表达在中枢神经系统gydF4y2Ba本身gydF4y2Ba不改变中枢神经系统的环境,然而人类CRP与hepatically表示,延迟发病和[减少的临床严重性实验性自身免疫性脑脊髓炎gydF4y2Ba16gydF4y2Ba,gydF4y2Ba18gydF4y2Ba),CNS-specific表达人类CRP是不够的。修改的实验性自身免疫性脑脊髓炎gydF4y2Ba

4所示。结论gydF4y2Ba

这些新的研究结果强烈支持我们的以前的论点(血源性/ hepatically合成人类CRP发挥其保护措施在血脑屏障对实验性自身免疫性脑脊髓炎CRPtg [gydF4y2Ba16gydF4y2Ba,gydF4y2Ba18gydF4y2Ba,gydF4y2Ba29日gydF4y2Ba]。我们先前的研究表明这种有益效果是最有可能的结果encephalitogenic T细胞反应的抑制,从而达到间接通过c反应蛋白作用于一个或多个FcgydF4y2BaγgydF4y2BaRIIB表达抗原递呈细胞(gydF4y2Ba16gydF4y2Ba),通过直接绑定到幼稚T细胞(gydF4y2Ba29日gydF4y2Ba),或两者的结合机制。因此,当人类CRP仅限于中枢神经系统的表现,在nCRPtg一样,人类CRP可能没有机会影响外围encephalitogenic T细胞的生成,因此它不能采取行动或改善其症状出现延迟实验性自身免疫性脑脊髓炎。这一发现提供了引人注目的新证据,CRP是站点特定的生物影响。gydF4y2Ba

利益冲突gydF4y2Ba

作者宣称没有利益冲突有关的出版。gydF4y2Ba

确认gydF4y2Ba

这项工作是支持由美国国立卫生研究院(研究所F31NS081903泰勒T赖特和趋势,1 r01dk099092-01a1亚历山大j . Szalai)和由奖CA 1059 -国家多发性硬化症协会- 13。作者也希望承认UAB的高分辨率成像设备(HRIF),这是支持由癌症中心支持格兰特(e CA013148)和风湿性疾病的核心中心(e AR048311)。gydF4y2Ba

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