对糖蛋白的抗体由人类周围神经和空肠弯曲杆菌在多焦点患者中神经病变

摘要

我们检测了24例多灶性运动神经病变(MMN)患者的血清样本对神经节苷GM1和Gal的反应性(β1-3）含热糖蛋白从人周围神经中分离出来空肠弯曲杆菌（Cj) O血清型:19。ELISA检测了11例(45.8%)MMN患者的IgM抗gm1抗体，对照组仅1例(4%)。Western blots显示6例(25%)MMN患者的血清对几个Gal(半乳糖)呈阳性反应(β1-3)含有galna的糖蛋白从人周围神经和从CjO: 19隔离。3例(12.5%)MMN患者的血清在所有分离株(60-62 kDa、48-51 kDa、42 kDa和38 kDa)中均显示出电泳迁移率相似的阳性反应条带。6例患者均对从人周围神经分离的48-52 kDa蛋白呈阳性反应。对60-62 kDa蛋白的IgG抗体滴度增加Cj3例患者中检出19例格林-巴利综合征患者，血清对周围神经抗原也呈IgG阳性反应，电泳活动性相同。其中一名患者有既往病史Cj感染，这表明可能性Cj也可以参与MMN的发病机制。

1.介绍

多焦油电机神经病变（MMN）是一种慢性免疫介导的神经病变，其特征是不对称的，主要是远端肢体弱点，无感觉损伤，并且通过在电机上存在多焦持续部分传导块，但不是感觉神经[1]。个别运动神经相关的肌无力与运动传导阻滞有关，其部位不同于常见的卡压或压迫综合征[2]。22-85%的MMN患者有神经节苷GM1血清IgM抗体的报道，这些报道的发病率的显著差异可能与不同的实验室技术有关[3.]。在MMN中也有针对GM1以外的其他神经节苷类的IgM抗体的报道。先行词空肠弯曲杆菌（Cj)感染与通过分子模拟机制的脂多糖(LPS)诱导格林-巴利综合征(GBS)有关Cj[4.]。纯电动机轴突GBS与GM1，GD1A，GALNAC-GD1A，GD1B和GM1B的抗体相关联[5.-7.]。我们之前已经展示了来自MMN或具有LPS的慢性神经病患者的抗gm1和asialo-GM1抗体的反应性Cj[8.]。的可能性Cj也可以参与MMN的发病机制，该发病机制已经得到了发育MMN和抗GM1抗体的高滴度的患者的几个报告Cj肠炎(9.-12.]。

彭纳氏O:19血清型Cj含有含有gm1样寡糖决定因子的脂多糖，通常与纯运动性GBS有关[5.那13.那14.]。交叉反应的决定因子检测到糖蛋白从人周围神经和CjO:19，通过花生凝集素(PNA)和GBS患者GM1阳性血清识别Cj感染 [15.那16.]。本研究的目的是研究从人周围神经分离的MMN和GM1样蛋白抗原患者的GM1阳性血清的交叉反应性CjO: 19。

2.材料和方法

2.1。血清样本

24名MMN患者的血清样本在塞尔维亚临床中心的神经门诊和神经门诊被诊断为MMN。作为阳性对照，我们随访了GBS患者的血清Cj感染。这些患者具有高滴度的抗gm1抗体与人周围神经和神经糖蛋白交叉反应CjO: 19。作为阴性对照，我们使用了5名其他神经系统疾病(运动神经元疾病(MND)、多灶感觉运动神经病变(MSMn))患者的血清和24名健康志愿者的血清。

2.2。人周围神经糖蛋白的分离

在死于非神经系统疾病的患者尸体解剖后8小时内获得人体周围神经，并将其冷冻在−70℃(马其顿斯科普里西里尔大学医学院法医学系)。神经组织在液氮中粉碎，三氯甲烷甲醇(1:2)溶液分离，均质化(MICROSON，超声波细胞干扰剂XL, Misonix Incorporated, NY, USA)， 0.5% Triton X-100, 0.4% SDS蛋白酶抑制剂鸡尾酒，65℃加热10分钟。不溶性物质在室温下以4200 rpm离心45分钟去除[17.]。分离的蛋白质被冻干并保持在- 70℃直到使用。

2.3。糖蛋白的分离c .空肠(O: 19)

从两个菌株中分离得到细菌蛋白CjO血清型:19。第一个菌株是商业菌株CjO:19, ATCC 700297，从中国单纯运动轴突型GBS患者中分离(American Type Culture Collection, Rockville, MD, USA)。第二种是CjO:19，与细菌性肠炎患者分离，c .空肠-与GBS发展无关的肠炎(马其顿斯科普里大学西里尔和卫理公会医学院微生物和寄生虫学研究所)。Cj菌株在弯曲杆菌琼脂(Campylosel, bioMerieux，法国)培养。细菌在42℃下生长48h，在微氧条件下(5% O₂, 10%的公司₂， 85%氮₂、CampyGen Oxoid)。的Cj在斯科普里医学院微生物学和寄生虫学研究所，通过确定已开发菌落的宏观和微观特征，通过测定流动性，根据革兰氏染色和适当的生化测试(氧化酶、过氧化氢酶和棘波酸盐水解)确定。血清型鉴定试剂盒(Denka Seiken，东京，日本)证实了O:19。

该细菌在哥伦比亚琼脂(Oxoid)上进一步增殖，42℃，在微嗜氧条件下(5% O₂, 10%的公司₂， 85%氮₂、CampyGen Oxoid)。取各菌株20个培养皿中的细菌细胞，0,9% NaCl w/v, 4000 rpm离心30 min。用8.0 mL 0.1 M Tris-HCl (pH 7.8)重悬微丸，超声破坏(MICROSON，超声波细胞干扰剂XL, Misonix股份有限公司，美国NY)。离心后(45分钟;上清蛋白在0.1 M Tris-HCl (pH 7.5)下4℃透析2次，冻干并保存在- 70℃直到使用[18.]。

2.4。纯化含gal - galna糖蛋白

含有gal - galna的糖蛋白从人的周围神经和Cj(O:19)通过亲和层析纯化，使用琼脂糖结合花生凝集素(PNA) (Sigma-Aldrich)，如Apostolski等人所述[17.]。

2.5。SDS-PAGE和Western Blot

在10%丙烯酰胺/双丙烯酰胺凝胶上分离(20μ通过十二烷基硫酸钠 - 聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE），将纯化的糖蛋白电流电泳在硝酸纤维素片上转移到硝酸纤维素片上的总糖蛋白。在Tris缓冲盐水（TBS-0.02M Tris碱，0.5M NaCl，pH 7.5）中，在室温下1小时，在8％BSA中封闭不反应的结合位点。将印迹用含有1％吐温20的TBS洗涤三次，并从稀释1：100的患者用血清温育过夜。洗涤后，与抗人IgG抗体一起孵育，与过氧化物酶共轭，（Sigma-Aldrich，USA）孵育，（Sigma-Aldrich，USA），在室温下稀释1：1000，1小时。使用二氨基苯甲酸（DAB），15mM咪唑和0.025％H进行反应产物的可视化₂O.₂(BioRad Laboratories, Hercules, CA, USA)。

2.6。用制备的SDS-PAGE纯化电泳迁移率在60 ~ 62 kDa和48 ~ 50 kDa之间的糖蛋白

电泳迁移率在60 - 62和48 - 50 kDa之间的免疫反应蛋白使用制备的SDS-PAGE纯化。总蛋白提取物(约40用10%丙烯酰胺/双丙烯酰胺凝胶电泳分离，采用垂直电泳系统(Protean IIxi, BioRad)。将凝胶浸泡在1mm二硫苏糖醇(DTT)和0.25 M KCl的冰溶液中，观察分离后的蛋白。在黑色的背景上，蛋白质是白色的条带。以分子量为7-212 kDa的蛋白标准品(SDS-PAGE预染色标准品，broad range, Bio-Rad)作为分子量标记。感兴趣的条带(活动性在60 - 62 kDa和48 - 50 kDa之间)被切成小块。与去离子水清洗后,凝胶块被转移到微型离心机管(2毫升),使退色1毫米德勤和孵化洗脱缓冲(5毫米德勤,50毫米三羟甲基氨基甲烷盐酸,液pH值7日,9日,0,1% SDS, 0, 15 M氯化钠和0,1毫米EDTA),一夜之间,旋转瓶,在室温下。离心(12000 rpm, 15 min)后将凝胶片从溶液中取出。样品中的洗涤剂通过加入冰冷的丙酮并在- 20℃下孵卵一晚来去除。12000 rpm离心15 min后得到的微球溶解于含2% SDS的1,5 M Tris HCl pH 8,8中。采用DC蛋白检测试剂盒(BioRad)检测蛋白浓度。

2.7。酶联免疫吸附试验(ELISA)

对患者血清与神经节苷(GM1, AG1)和纯化的糖蛋白的反应性进行了测试CjO: 19隔离。96孔板(平底，高结合，康宁，美国NY)孔在4℃下涂过夜，含抗原(0.2)μg / mL神经节甘脂,4μg/mL蛋白)和BSA (10μg / mL)。用1% BSA/PBS封孔，室温下2小时，用0.9% NaCl、0.05%吐温20、0.02%叠氮化钠缓冲液洗涤4次。从患者血清添加到井,在重复序列稀释(1:100年,1:200年,1:400年,1:800年,1:1600年,1:3200年,1:6400年,和1:12800)在0.1% BSA和0.1%渐变20 / PBS和孵化在室温下过夜。洗涤后加入抗人IgG和抗人IgM，与过氧化物酶(Sigma-Aldrich)结合，1:10 00稀释，作为二抗。洗涤板后，将过氧化物酶底物(OPD片，Sigma-Aldrich)加入孔中，在450 nm的酶标仪(VICTOR X3, Perkin Elmer, USA)上用分光光度法测定显影颜色的光密度。计算每一稀释度所得值的平均值，用空白值减去所得值进行修正。取OD值大于阴性对照组两倍的血清为阳性。其效价定义为反应性为阳性的最高血清稀释率。

3.结果

3.1。抗神经节苷类抗体

ELISA检测结果(表)111例MMN患者血清中均出现了抗GM1 IgM抗体(45.83%)。在所有MMN患者中，只有1例(6.5%)检测到抗GM1 IgG抗体，2例(9.3%)检测到IgG对AG1阳性反应。其他神经系统疾病患者的血清对任一神经节甙均无反应性。在健康对照组中，只有1例(4%)对GM1神经节苷脂表现出阳性反应。

3.2。免疫印迹

Western blots显示，在6例(25%)MMN患者中，人周围神经和两者的蛋白分离物中都有几个阳性反应带Cjo：19个孤立（表2)。对分离蛋白反应性阳性的6个血清对抗gm1 IgM抗体的反应性均为阳性。3个MMN患者(12.5%)的血清中均检测到电泳迁移率相似的阳性反应条带(60-62 kDa、48-51 kDa、42 kDa和38 kDa)。6例患者均对从人周围神经分离的48-52 kDa蛋白呈阳性反应。在其他神经系统疾病患者中，2例(40%)对同一抗原呈阳性反应，但对任何分离物的其他蛋白均无反应。其中一个阴性对照(4%)对三个分离株中存在的60-62 kDa蛋白和从人周围神经中分离的48-50 kDa蛋白表现出阳性反应。有代表性的墨迹如图所示1和2。

3.3。ELISA

对6例western blot阳性患者的血清进行ELISA检测，以确定60-62 kDa和48-51 kDa糖蛋白的抗体效价(见表)3.)。从3例MMN患者的血清中检测了IgG抗体对60-62 kDa蛋白的效价(1:3200 - 1:12 800)升高。IgG抗体对60-62 kDa蛋白的阳性反应和增加的效价(1:400 - 1:12 800)CjO:19-GBS在3例患者的血清中也被证实，对周围神经抗原呈阳性反应，具有相同的电泳移动性。其中一名患者有既往病史Cj感染。只有一种测试的血清显示出阳性IgG反应性与分离的60-62 kda抗原CjO: 19-enteritis相关。

从人外周神经中分离的48-51 kDa蛋白对检测血清均呈阳性反应(效价1:20 00 - 1:20 00)，而对分离的电泳活性相似的抗原，只有1份血清呈阳性反应(效价1:20 00)CjO: 19-GBS相关。6个检测血清对48-51 kDa蛋白均无阳性反应CjO: 19-enteritis相关。

4.讨论

24例MMN患者中有11例(45.8%)检测到血清中GM1的IgM抗体。既往系列MMN患者GM1抗体阳性率在25 ~ 80%之间[19.-21.]。AAEM的共识声明将GM1抗体纳入MMN的支持实验室标准[22.]。MMN患者的血清与从人周围神经和from分离的蛋白具有交叉反应性CjO: 19。三种分离物分别以60-62 kDa、48-51 kDa、42 kDa和38 kDa的浓度分别得到4个阳性反应蛋白。这些蛋白与PNA的交叉反应表明糖蛋白结构和GalGalNAc行列式的存在[17.]。MMN患者的IgM抗gm1抗体和48-51 kDa pna结合糖蛋白抗体之间的相关性不能从本研究中得出结论，因为其他神经病患者的血清也对这些条带呈阳性反应。这项研究应该在更多的MMN患者和对照组中进行。从分离的具有60-62 kDa和48-51 kDa流动性的MMN和pna结合糖蛋白患者的血清也有交叉反应Cj。除了从人周围神经中分离的48-51kDa蛋白外，来自其他神经病患者的血清并未显示出对测试抗原的任何反应性。Western印迹结果表明，与蛋白质分离的蛋白质的测试血清的反应性没有显着差异Cjgbs相关或Cj肠炎。相比之下，ELISA结果显示，不同细菌分离株的血清对抗原的反应性有显著差异。3例MMN患者表现出对60-62 kDa糖蛋白的IgG抗体CjO：19GBS和阳性IgG交叉反应抗体，具有相同的电泳迁移率的周围神经抗原。其中一种患者的IgM抗GM1抗体滴度增加以及以前的历史Cj感染，表明MMN的发病机制中可能的分子模拟机制[9.那11.]。糖蛋白的IgG抗体和神经节苷的IgM抗体的产生机制有待进一步研究。被测血清对分离的糖蛋白有较高的反应性Cj -与蛋白质相比相关的GBS相关联Cj肠炎。两种方法所获得的反应的可变性可能是由于抗原与不同基质的相互作用不同而引起的构象差异造成的。也有一种可能，血清的不同反应性是由于免疫反应中使用的抗体的不同特异性造成的[8.]。分离蛋白中存在不同构象决定因素的可能性Cj由来自人周围神经的蛋白质共享的-GBS，该蛋白质被来自MMN患者的血清中的抗体识别，尚未阐明。

血清抗体与人外周神经抗原及分离抗原的交叉反应性Cj是否可以用反映自然非致病性自身免疫的天然自身抗体的概念来解释，或者用感染和自然暴露于病原体(包括病原体)而产生的抗体来解释Cj[23.-25.]。这解释了健康对照组的一份血清对60kda糖蛋白的阳性反应。

MMN患者对人周围神经抗原的IgG抗体滴度升高可能是暴露于非免疫原性神经抗原后发生的脱髓鞘和神经细胞损伤的二次反应[25.]。这些自身抗体可能进一步有助于疾病的进展和恶化。

与健康对照组和其他神经病变患者相比，MMN患者中抗神经节苷类和抗糖蛋白抗原的出现频率更高，这表明它们在神经损伤的诱导和传播以及神经症状的发展中可能具有致病意义。这些抗体的交叉反应Cj抗原显示了人与细菌糖蛋白共享的表位，以及它们在感染后自身抗体和周围神经病变的诱导中的可能作用空肠弯曲杆菌。确定交叉反应的pna结合糖蛋白的结构和定位将有助于理解包括MMN在内的髓系相关神经系统疾病的触发机制。

利益冲突

没有利益冲突。

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