蛋白质转译后的修改在干燥综合征患者的唾液腺

文摘

本研究调查转译后的反应在干燥综合征患者的唾液腺。我们分析了主要干燥的活检的病人使用免疫组织化学和tag-purified anticyclic citrullinated蛋白质检测citrullinated肽(CCP)抗体的存在peptidylarginine deiminase 2 (PAD2)同时评估。目前的工作证明了弱的PAD2酶在一些正常的唾液腺,尽管PAD2表达式在干燥的患者明显增加。citrullinated蛋白质的存在也在干燥的患者的唾液组织发现,强烈支持原位的蛋白质转译后的修改这个设置。此外,共同表达的共产党和PAD2表明这是依赖于酶的转译后的修改。总之,干燥综合征患者表达了催化机械生产转译后的反应,可能会导致自身抗原引发。

1。介绍

干燥综合征是一种自身免疫性epithelitis,主要影响唾液和泪腺腺和结果在新铸的卢比综合症,临床特点是口腔干燥,干眼病,角膜结膜炎(1]。

瓜氨酸是一个α胺基酸,可以隔绝西瓜(2]。此外,它是鸟氨酸循环的中间体,在肝脏合成尿素形成期间被鸟氨酸转换成精氨酸(3]。瓜氨酸存在于两种形式:免费的瓜氨酸,这是一个产品号的酶家族,和瓜氨酸转译后的结果修改某些蛋白质精氨酸残基,这是催化了peptidylarginine deiminases(垫)。这个家族的酶deiminates蛋白质精氨酸残基,收益率报瓜氨酸残基,在这种方式,蛋白质citrullination NOS独立(4]。

我们之前证明炎症citrullination干燥综合征患者的唾液腺,部分依赖伊诺。这种酶是在炎症细胞浸润的腺泡和唾液上皮细胞,和原位没有超速可能导致腺损伤(5]。肿瘤坏死因子等促炎细胞因子经常观察到这些病人的腺体组织,和这些因素可能会触发伊诺的生产6]。尽管蛋白质citrullination是一个重要的事件在类风湿性关节炎发病机理7,8),这个过程也可以发生在干燥综合征。大约有7.5%的原发性干燥综合征患者阳性anticyclic citrullinated蛋白质(anti-CCP)抗体9),这个标记的存在在干燥综合征可能与nonerosive关节炎[有关10]。蛋白质citrullination已被证明是一个重要的病理生理机制在类风湿性关节炎,这个过程也被报道在其他自身免疫性疾病如antibody-associated神经退行性疾病(11]。因此,我们研究蛋白质citrullination腺水平干燥综合征。

2。材料和方法

2.1。组织

小唾腺活检从24个原发性干燥综合征患者进行了研究。病人满足欧洲标准的修订版本提出的欧美共识(12]。本研究包括17名女性和七个男性的平均年龄47岁(范围、37-57年)。所有的病人活组织检查和控制被告知,和书面授权。同等数量的在口腔外科活检获得的其他目的个人没有干燥综合征,包括控制。我们机构的伦理委员会的授权和监控协议,符合要求的世界医学协会赫尔辛基宣言。标本固定在甲醛,嵌入在石蜡切片在4μm厚度,与苏木精和伊红染色。两个病理学家显微镜下进行活检,根据修订后的多级分类评估累计关注分数(13]。无污点的组织部分被用于免疫组织化学。

2.2。Anti-CCP抗体

酶联免疫分析方法检测到抗体citrullinated从波形蛋白合成肽,并从病人血清和控制。类风湿性关节炎患者血清中被用作积极控制。化验进行根据制造商的指示(德国Luebeck Euroimmun AG)。首先,血清样本稀释1:100稀释缓冲。第二,血清稀释孵化了60分钟在室温下井的聚苯乙烯板涂有合成循环citrullinated肽(ccp),含有arginine-modified残留。citrullinated合成肽包括栏目,EBV核抗原,免疫球蛋白序列,ccp包括重组鼠栏目或变异人类波形蛋白(14]。第三,洗盘子洗了缓冲区。第四,结合抗体标记的第二抗体(共轭POD-rabbit多克隆攻击人类免疫球蛋白)在一次30分钟的孵化。第五,颜色反应了在30分钟的孵化与开发者pNPP(颜色p-nitrophenyl磷酸二钠盐)。第六,反应停止,微型板块进行评估使用ELISA读者在450海里。最后,五校准器被用来构造曲线分析,和结果表示在单位。所有分析都是一式三份。

2.3。净化Affinity-Bound CCP肽

类风湿性关节炎病人是anti-CCP抗体阳性(栏目或变异人类波形蛋白)提交ELISA,像前面描述的那样15]。具体anti-CCP结合抗体的筛选了聚苯乙烯CCP-coated盘子后2小时使用0.2 glycine-HCl孵化,pH值2.8,和筛选了抗体中和1米三,pH值9.5。恢复抗体主要集中在Centricon离心设备30 kDa分子量截止(微孔)。

2.4。标签与过氧化物酶抗体

affinity-purified抗体蛋白浓度测定采用布拉德福德法(16),high-affinity-purified anti-CCP与辣根过氧化物酶标记抗体(合)(σ,圣路易斯,密苏里州)使用Avrameas[描述的方法17与修改)。简单地说,high-affinity-purified过氧化物酶抗体的摩尔比率是1:10。酶与戊二醛和孵化preactivated 37°C 30分钟。耦合反应诱导在18个小时在室温下孵化的碳酸钠缓冲区,pH值9.5。Anti-CCP /合广泛渗出与蒸馏H₂O使用膜的孔隙大小40 kDa。anti-CCP /合共轭分馏在minicolumn挤满了交联葡聚糖g - 200与PBS的平衡,洗脱体积的120μL / /分数在25管收集。蛋白质浓度在不同的分数,和三池创建根据色谱图。直接ELISA试验确定反应每个池的共产党,和每个池集中获得最终使用Centricon设备体积的33%。亲和力anti-CCP-purified抗体被用来跟踪CCP抗原使用免疫组织化学的唾液腺。

2.5。免疫组织化学

进行免疫组织化学检测蛋白质转译后的修改4μ米厚的部分固定小唾液腺的显微镜载玻片。标本deparaffinised, permeabilised Triton x - 100 / 0.01%磷酸盐(PBS)和PBS洗了三次。内源性过氧化物酶使用3% H就熄了10分钟₂O₂在甲醇。组织孵化了净化人类免疫球蛋白与硫酸铵沉淀从正常的人类血清中和的存在可能的唾液腺,类风湿因子活动和沉淀分离对蒸馏水使用Slide-A-Lyzer透析磁带(10 K MWCO热费希尔科学Inc .,罗克福德,IL)。免疫球蛋白是纯化使用HiTrap蛋白G惠普列。组织被清洗和孵化12小时affinity-purified anti-CCP抗体BFS-PBS(稀释1:50)的10%。绑定anti-CCP抗体开发使用3、3′H diaminobenzidine - 0.06%₂O₂(σ,圣路易斯,密苏里州)清洗后,与0.5硫酸反应停止。幻灯片是光学显微镜下检查。所有化验蒙蔽的方式进行了一式三份和评估。此外,抗核抗体(猫。231246年,Calbiochem,达姆施塔特,德国;1:100稀释10%胎牛血清(的边后卫)pbs)和一个anti-PAD 2抗体(pa5 - 19474,皮尔斯;稀释1:30)进行免疫组织化学检测的唾液腺。这些抗体被孵化一夜之间,用PBS洗净,孵化与二级抗体(山羊anti-rabbit免疫球蛋白与过氧化物酶标记;Abcam ab759)。颜色反应是引起失明的方式如前所述和评估(5]。

2.6。统计分析

数据处理使用确切概率法使用GraphPad软件,QuickCalcs;的双尾值< 0.005被认为是具有统计学意义。

3所示。结果

3.1。淋巴细胞浸润

无炎性浸润被归类为得分为0,这是所有控制活检的特征。五切片干燥综合征患者得分作为一级,而这些活检离散涎腺炎展出。六个活检得分为II类和表现出中等浸润的单核细胞分组在一个焦点。五个活检取得了第三类和表现出严重的涎腺炎和浸润的焦点之一。八活检取得四级和显示慢性涎腺炎与多个焦点(表1)。

3.2。的净化和标签的高亲和性Anti-CCP抗体

我们anti-CCP纯化抗体,绑定到商业聚苯乙烯板覆盖着citrullinated合成肽,从每个microwell总蛋白。我们恢复了30μg /具体和甘氨酸洗脱后的高亲和性anti-CCP抗体。我们使用传统的辣根过氧化物酶耦合方法绑定到anti-CCP抗体和戊二醛的摩尔比率酶:抗体10:1,工作得很好。共轭抗体使用凝胶过滤色谱进一步分离,产生三个分数。第一部分池包含了HRP-anti-CCP轭合物(分数9 - 11或池1),这一部分非常被动的ELISA共产党,与一个3倍的光学密度高于原血清滴定度。第二池anti-CCP活动较弱(分数12 - 14或池2)。池3(分数18 - 20)包含nonconjugated过氧化物酶分数,这是不利于anti-CCP ELISA(图1)。

3.3。Anti-CCP抗体

两个样本的原发性干燥综合征患者anti-CCP抗体阳性血清,而健康对照组为anti-CCP抗体阴性。

3.4。正常的唾液腺PAD2表达

的peptidylarginine deiminases属于一个家庭带正电的转译后的修改的酶蛋白精氨酸残基通过citrullination中性瓜氨酸残基的过程。这些酶在各种生理过程中发挥作用,并广泛分布于组织。因此,我们研究这些酶的分布在正常唾液腺和观察到的离散的PAD2导管上皮细胞的选择小的唾腺活检。然而,这种酶的表达没有腺泡。

3.5。蛋白质翻译后修饰发生在干燥综合征患者的唾液腺

我们下一个检查的转译后的citrullinated蛋白在原发性干燥综合征患者的唾液腺使用我们high-affinity-purified anti-CCP抗体。我们发现存在的唾液腺蛋白质转译后的修改,腺泡,和炎症浸润病灶70%的干燥综合征患者活检,尽管证据citrullination过程没有在正常控制样本,值< 0.0001(数据2和3和表1)。

3.6。蛋白质Citrullination PAD2依赖

PAD2当时的分配比的分布citrullinated肽(根据anti-CCP标签)来确定这种酶之间的关系原位citrullination。我们观察到总协议这两个因素的存在,这表明这个表达式是一致的广泛领域citrullination导管,腺泡和炎症浸润病灶。这些结果强烈支持原位蛋白质的转译后的修改(图4)。

4所示。讨论

抗原引发的转译后的修改正常蛋白质的自身免疫性疾病是一个重要的组成部分。这个过程将某些蛋白质抗原表位基因易感个体可能引发自身免疫反应。本研究调查是否干燥综合征患者的唾液腺的潜在来源蛋白质转译后的修改。从原发性干燥综合征患者活检用于检测蛋白质转译后的修改使用tag-induced anti-CCP抗体和免疫组织化学。的潜在作用PAD2酶作为催化剂,这些修改也评估。本研究的主要结果可以总结如下。首先,PAD2酶被发现在一些正常的唾液腺,但其表达在干燥综合征患者明显增加。第二,citrullinated蛋白质的存在在干燥的患者的唾液组织强烈支持蛋白质的转译后的修改原位。第三,共产党的共同表达和PAD2表明转译后的修改是酶依赖。最后,炎性浸润与PAD2有关过度,这是蛋白质的存在直接相关的修改。

PAD2酶同种型广泛分布在各种哺乳动物的组织,包括神经系统、骨骼肌肉,胰腺,甜蜜的腺体,唾液腺,乳腺脂肪垫,骨髓,免疫细胞如单核细胞和巨噬细胞(18- - - - - -20.]。唾液腺广泛表达的蛋白质可能修改垫,包括波形蛋白,烯醇酶等21- - - - - -23]。此外,唾液腺持续表达PAD2,这种酶可以将精氨酸残基转化为瓜氨酸,citrullination过程的基石。此外,唾液腺上皮和腺组件的表达波形蛋白,烯醇酶,和其他潜在的蛋白质基质PAD2,和一些蛋白质已经被认定为自身抗原在自身免疫性疾病,包括类风湿性关节炎。因此,我们假设所有的转译后的修改存在的必要元素,这些分子被观察到在干燥综合征患者的唾液腺。这转译后的过程后,修改蛋白质已被证明引发自身免疫反应。的第一个证据抗体生成反应改性蜂窝组件被报道为中间丝相关蛋白自身抗体的存在,这是发现在正常口腔黏膜的上皮细胞。因此,这个自身抗体被称为是一个“antiperinuclear因素”,并显示在类风湿性关节炎患者。同样,anti-CCP抗体作为类风湿性关节炎的早期标志,和anti-CCP抗体在疾病发病机理的重要性已经被越来越多的证明(24- - - - - -28]。此外,蛋白质转译后的修改可能会触发其他自身免疫性疾病,如视神经炎、腹腔疾病,多发性硬化(29日- - - - - -31日]。

在当前的研究中最大的挑战是穷人的anti-CCP试剂从商业来源。因此,我们获得的类风湿性关节炎患者自身抗体来执行我们的研究。我们受到研究Vossenaar et al。32),因为这些作者获得affinity-purified血清的抗体类风湿性关节炎患者使用一种免疫吸附技术重组肽是由噬菌体展示技术。我们使用一个非常简单的技术,利用的能力固定在聚苯乙烯合成肽的高亲和性anti-CCP商业板块结合抗体的筛选了与甘氨酸缓冲板,该方法降低了博士恢复有用的高亲和性anti-CCP抗体,它演示了一个三倍增加反应性citrullinated合成肽在商业ELISA盘子。这些抗体的高亲和性anti-CCP共轭过氧化物酶,作为一个优秀的共产党标签,证明在免疫组织化学分析;效率我们的抗体是与之前报道的其他作者(32]。此外,潜在的假阳性类风湿因子的存在阻止了预孵化与正常免疫球蛋白,中和类风湿因子的活动。

我们的结果对干燥综合征病理生理学认识很重要,因为这些修改构成额外的引发自身免疫机制。这些修改也可能适用于其他自身免疫性疾病因为转译后的修改可能代表一种常见的自身抗原的起源的机制。例如,Routsias等人的研究表明,自动抗原La的转译后的修改增加了其抗原性(33,34]。这些结果支持一个新的角度探索的起源基于抗原基因易感个体引发自身免疫。

然而,许多问题仍未解决。例如,做垫酶在正常表达的既定的腺上皮细胞(PAD2)发挥作用的初始引发自身免疫在干燥综合征?此外,做之前触发诱发炎症病灶形成和PAD2超表达单核细胞和巨噬细胞导致唾液腺蛋白质的转译后的修改吗?这两种可能性可能共存并创建一个反馈回路,尽管这一假说的理论方面需要澄清使用其他实验方法。

5。结论

总之,干燥综合征患者具有催化机械蛋白质转译后的修改,这可能会导致自动抗原引发。

确认

这项工作是支持PROMEP-UAZ-CA-5 Autoinmunidad,批准号103.5 / 09/1327,红色tematica: Autoinmunidad multicentrica。作者感谢Lizeth Ivon Alvarez-Chairez和莎拉Paola Hernandez-Martinez一些实验的有价值的帮助。

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