类风湿性关节炎的DNA损伤:年龄相关性增加脂质Peroxidation-Derived DNA加合物,Heptanone-Etheno-2′脱氧胞苷

文摘

客观的。评估什么类型的DNA损伤检测类风湿性关节炎(RA)。方法。DNA加合物,如8-oxo-hydroxy-7 8-dihydro-2′脱氧鸟苷(8-oxo-dG), 1, N⁶-etheno-2′脱氧腺苷(εdA)和heptanone-etheno-2′脱氧胞苷(HεdC)基因组dna,来自全血细胞从46 RA患者和健康对照组31日,由高性能液相色谱串联质谱分析,及其在RA患者和控制水平进行比较。此外,DNA加合物和RA的临床参数之间的相关性进行了分析。结果。与控制相比,H的水平εdC在RA显著提高()和年龄相关的(r= 0.43,P< 0.01),而在8-oxo-dG和没有显著差异εdA积累之间的RA患者和控制。Hε直流水平相关与关节肿胀的数量(r= 0.57,P< 0.0001)和弱的温柔的关节(r= 0.26,P= 0.08)的RA患者,他们没有表现出显著的与血清学标志物如c反应蛋白和基质金属蛋白酶3。结论。这些发现表明,Hε直流对RA的发展可能有一些影响和/或其并发症。

1。介绍

类风湿性关节炎(RA)是一个系统性、慢性关节和周围组织的炎性疾病,伴随着剧烈的疼痛,不可逆的关节破坏和系统性并发症(1]。其病因尚未完全阐明,但氧化应激的病理因素之一,有助于其发展(2- - - - - -5]。邵等人最近报道检测DNA损伤的存在和DNA修复酶的缺乏,共济失调毛细血管扩张突变(ATM),在RA T细胞(6]。此外,DNA氧化产品、8-oxo-hydroxy-7 8-dihydro-2′脱氧鸟苷(8-oxo-dG),已被证明是高度在RA患者中表达的2]。暴露于电离辐射引起的DNA损伤,紫外线,和外生或内生DNA链破坏,化学诱变剂导致的,这被认为是诱变,致癌,老化的因素(2]。另外随着新的DNA损伤,脂质peroxidation-derived最近报道在人类的DNA加合物(7,脂质过氧化作用也被认为是一个因素的RA的发病机制或局部炎症反应4,8- - - - - -10]。DNA加合物是8-oxo-dG代表,1,N⁶-etheno-2′脱氧腺苷(εdA)和heptanone-etheno-2′脱氧胞苷(Hε直流);后两个是直接的活性氧(ROS)派生和脂质peroxidation-derived加合物。Hε直流也视为4-oxo-2 (E -)nonenal(4号)生成的产品(7]。

这些先前发现的基础上,在这项研究中,为了研究DNA加合物的作用在RA的发展,我们将检查三个DNA加合物,8-oxo-dG,ε哒,和Hε,从RA患者和健康对照组全血细胞通过一个敏感技术,高性能液相色谱串联质谱(质/ MS)。

2。材料和方法

2.1。研究参与者

研究人群包括46个RA(38妇女和8人)患者和健康对照组31日妇女和17人(14)。所有的RA患者,年龄中位数(范围):52(22 - 81)年,遇到了1987年修订的美国风湿病学院(ACR) RA分类标准(11]。中值(范围)温柔的关节和关节肿胀数是2(0-28)和2(经历),分别,而中位数(范围)血清c反应蛋白(CRP)浓度为0.83 mg / dL(表(0.04 - -6.2)1)。术治疗病人的记录显示,19日非甾体类抗炎药(非甾体抗炎药)(一个与塞来昔布、选择性环氧合酶2 (cox - 2)抑制剂与其他非选择性cox - 2抑制剂和18),29日与甲氨蝶呤、29和强的松和5生物制剂(两个栏和一个英夫利昔单抗,adalimumab,和叫)。对照组由31名健康志愿者没有任何慢性疾病,与中值36(22-57)岁(范围)。获得了受试者的书面同意根据赫尔辛基宣言,和研究已经由大阪大学医院的伦理委员会批准。来自RA患者的临床表现和实验室数据获得当天的外周血样本,所以,一些实验室测试数据都没有。

2.2。DNA纯化和消化

从全血基因组DNA纯化细胞DNA提取器世行设备采用碘化钠法(Wako、大阪、日本)的去铁胺甲磺酸(西格玛奥德里奇日本KK、东京、日本)所有解决方案调整的最终浓度0.1毫米按照制造商的协议,然后纯化DNA是储存在−80°C。孤立的DNA被消化核苷与先前描述的核酸酶P1方法(12]。DNA加合物分析,50μL 30%二甲亚砜被添加到每个DNA样本,然后受到质/女士。

2.3。DNA加合物的标准和稳定同位素标准

8-oxo-dG值三个DNA加合物,ε哒,和Hε,评估及其化学结构如图1(一)。4号的DNA加合物Hε直流合成根据以前公布的方法(13]。8-oxo-dG和εdA从西格玛奥德里奇获得日本。(U -¹⁵N₅]8-oxo-dg Shinya Shibutani博士提供的是和善的,纽约州立大学石溪分校,纽约,美国和其他的DNA加合物合成稳定同位素标准根据前面描述的方法(12使用[U -]¹⁵N₅]或[U -¹⁵N₃]-deoxynucleoside购买从剑桥同位素实验室(美国安多弗的)。

2.4。质/ MS仪器

色谱法进行的Quattro天涯Pt三阶段四极质谱仪(美国Waters-Micromass,米尔福德,MA)配备了联盟2695年分离模块,和一个2487双λ吸光度检测器(美国水域,米尔福德,MA)使用。一个整除(20μL)消化DNA样本的注入和分离Shim-Pack XR-ODS列(3.0毫米×75毫米、日本岛津公司、日本),以线性梯度筛选了5%到30%的甲醇水在0和27分钟之间,30%到80%的27至35分钟,然后保存在35 - 40分钟80%甲醇的流量0.2 mL / min。以下实验条件被使用:离子源温度:130°C,反溶剂温度:380°C,锥电压:35 V,和碰撞能量:15 eV,反溶剂气体流量:700 L / h,锥气体流速:35 L / h,碰撞气体:氩。正离子模式用于multireaction监控(MRM)分析在下列条件下(锥电压、碰撞能量,前体离子→产品离子):[U -¹⁵N₅]8-oxo-dg: (40 12 288.8→172.8), [U -¹⁵N₅]-ε14岁的大卫·爱登堡:(35 280.9→164.9),[U -¹⁵N₃]- hεdC: (35 10 367.0→251.0), 8-oxo-dG:(40岁,12日283.9→167.9),ε14岁的大卫·爱登堡:(35 275.9→159.9),和HεdC:(35岁,10、364.0→248.0)。

2.5。DNA加合物量化

每个DNA加合物是量化通过计算目标加合物的峰面积的比值,其同位素如下:潜在的DNA加合物的峰面积或峰面积的内部标准/数量的2′脱氧鸟苷(dG)。dG的数量在每个DNA样本估计通过监控dG峰面积在254 nm紫外可见检测器与质/ MS系统串联连接。QuanLynx(版本。4.0)软件(Waters-Micromass,曼彻斯特,英国)是用于创建标准曲线和计算加合物浓度。

2.6。统计数据

8-oxo-dG值,ε哒,和HεdC在RA患者和健康对照组比较使用协方差分析的均值(ANCOVA)协变量模型包括年龄和性别。在分析之前,对数转换,因为8-oxo-dG值,ε哒,和Hε直流不是正态分布。结果back-transformed然后表示为调整几何平均比率及其95%可信区间(CI)。DNA加合物的水平之间的关联和临床或实验室测试结果RA患者的观察与斯皮尔曼等级相关系数进行了分析。值小于0.05被认为是重要的。所有的分析SAS 9.3版本的Windows (SAS研究所卡里、数控、美国)。RA患者和之间的匹配性的数量控制,14个妇女和7人被随机选择。8-oxo-dG的比较,ε哒,和HεdC在RA患者和健康对照组,两个示例测试进行对数转换数据。此外,引导方法用于生成匹配的10000套样品性,并分析了每个样本两个示例测试评估结论从匹配的鲁棒性分析。

3所示。结果

3.1。8-oxo-dG检测,ε哒,和Hε直流

纯化dna从外围全血细胞RA患者()和控制()受到质/女士特定DNA加合物的检测。几个主要的DNA加合物的山峰被观察到,在这其中,相对应的峰值8-oxo-dG,ε哒,和Hε直流和稳定同位素的内部标准如图所示1 (b)。这些DNA加合物的体积计算部分中描述的方法2。

3.2。Hε直流提升在RA患者的血细胞

8-oxo-dG和结果ε达图所示2。中值(范围)的水平8-oxo-dG每10⁹基地在RA患者和控制是176.4(52.5 -449)和127.1(58.1 -372),分别和他们没有区别。此外,没有显著差异ε两组之间的dA, RA: 29(2.6 -1635)(每10位数(范围)⁹基地与控制:每10 34.7 (0.2 -121)⁹基地。四个RA患者显示增加εdA积累,但这些值与疾病之间没有检测到协会活动参数如c反应蛋白和涉及关节的数目。然而,Hε在RA患者中,直流水平显著高于10.3(0.3 -119)(每10位数(范围)⁹基地比控制,每10 0.33 (0.3 - -17.8)⁹基地()(图3(一个)),这个意义是在所有年龄区间分析(意味着比35岁:;其他年龄间隔:)如图3 (b)的意思是加合物的HεdC在RA患者大约是5倍,在控制。此外,为了匹配性RA患者之间的数量和控制,女性14和7人的基准是随机挑选的,并证实了Hε直流(但不是8-oxo-dG和εdA)水平显著高于在RA患者比控制(数据未显示)。

3.3。正比的Hε直流水平和关节肿胀和老化

相关性分析探讨是否Hε直流水平与临床或实验室测试结果包括血小板计数、c反应蛋白的浓度、血清淀粉样蛋白A (SAA),白蛋白,和基质金属蛋白酶3 (MMP3),以及水平的总胆固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇除了肿胀关节和关节的数目。结果如表所示2。稍微积极,但不显著,水平之间的相关性观察Hε直流和血小板的数量、c反应蛋白的浓度,SAA, MMP3,温柔的关节的数目。另一方面,Hε直流水平表现出显著正相关与关节肿胀的数量(,)和肿胀和关节的总数(,)(表2和图4),也是年龄相关性(,)(表2和图3 (b))。最后,Hε直流水平没有联想到疾病持续时间、类和阶段,积极的自身抗体,如类风湿因子和anticitrullinated蛋白抗体,或使用非甾体抗炎药、甲氨蝶呤或强的松。

4所示。讨论

这里的研究表明,H的水平ε脂质peroxidation-derived DNA加合物,明显高于在RA患者的全血比的控制,这种差异与衰老增加。我们所知,这是这部小说的发现。此外,H之间的关联度ε直流水平和关节肿胀的数量表明,Hε直流可能发挥病理作用在RA的发展。

风湿性关节炎的病因尚未完全阐明,但人们普遍认为遗传和环境因素相互作用导致其发展(1,2]。几个环境因素如吸烟、感染、环境毒素,或营养物质被发现导致DNA修饰,包括增强的DNA加合物的存在,从而影响基因的激活或DNA复制(14]。这些因素也被认为对RA的发展有重大影响。氧化还原状态的评估RA一直得到广泛的研究。特别是很多氧化应激标记,包括DNA损伤,评估在不同样本(血液、尿液和滑液)的RA患者。在先前的研究中,RA和氧化应激之间的关系在基因组DNA有据可查,ROS,由中性粒细胞浸润为RA的滑液,已经涉及疾病的发病机理(5,15- - - - - -17]。氧化产品还发现高架在RA患者的脂质和蛋白质(15]。DNA损伤加剧已经证明通过评估通过碱性彗星化验(5,6]或标记所示8-oxo-dG尿液,海拔高度的滑膜液和主RA患者的血淋巴细胞(2,15,18]。在我们的试验中,然而,我们无法检测overaccumulation 8-oxo-dG RA患者的全血细胞。造成这种差距的原因是未知,但是我们认为这是由于不同的样本来源或试验方法。先前的研究分析8-oxo-dG浓度在尿液和滑膜液采用酶联免疫吸附试验和8-oxo-dG水平外周血淋巴细胞通过高效液相色谱法,当我们检查8-oxo-dG水平从全血基因组DNA细胞通过质/女士。另一个更可能的原因是疾病活动的差异,因为这的RA患者参与我们的研究似乎是温和自投标和关节肿胀的平均数量是2,2,分别和CRP值中值为0.83 mg / dL,低于此前报道的价值。然而,它应该再次指出,即使在RA患者轻度疾病活动,Hε直流水平升高及相关涉及关节的数目,提高H的可能性εdC可能成为小说和敏感的生物标志物检测RA疾病活动。

化学结构的分析表明,氧化DNA损伤导致DNA链破坏,包括双单链断裂和DNA四级结构的变化导致其解除,解除和增强DNA被发现血液中的单核细胞的RA患者(19]。脂质peroxidation-derived DNA损伤的重要性在炎性疾病已经暗示20.),事实上,脂质过氧化反应和氧化低密度脂蛋白水平高度表达的RA患者,同时积极联系RA疾病活动和脂质过氧化作用已经被报道10,15,21]。多不饱和脂肪酸(欧米伽)施加已发现氧化应激引起的一系列α,β等不饱和醛丙烯醛、巴豆醛和丙二醛形成脂质过氧化氢自由基,这是高度DNA -蛋白反应(7,10,14,22,23]。Hε直流有一个环外的戒指和一个笨重的侧链形成的脱氧胞苷反应4号和可能导致线粒体功能变化7,14,22- - - - - -25]。H的存在ε直流已被确定在不同的细胞和组织(7]。功能上,Hε直流发现阻止DNA合成,从而导致明显错编密码在DNA的复制板修改与脱氧胞苷(26]。威廉姆斯等人认为,花生四烯酸或酶催化亚油酸是cox - 2到15 (年代)-hydroperoxy-5Z,8Z,11Z,13E-eicosatetraenoic酸(15 (年代-HPETE),然后发生溶血性分解形成dna活性双官能团的亲电试剂,4号(20.]。考虑到我们的相关分析发现,Hε直流部分可能是负责在滑膜病理活动,并进一步研究使用滑膜是必需的。可想而知,高级积累HεdC在RA患者是由于氧化反应的不平衡在抗氧化防御系统,损害的DNA修复酶和/或过度活动15-lipooxygenase或cox - 2,或存在4号或过剩ω在细胞膜6欧。然而,没有观察到的差异在Hε直流的RA患者即使他们已经与非甾体抗炎药或皮质类固醇治疗,这是众所周知的,抑制15-lipoxygenase。RA患者甲氨蝶呤报道显示8-oxo-dG浓度降低(27),但我们不能发现任何H之间的联系ε直流和甲氨蝶呤使用。尽管监控H是很重要的ε直流水平治疗后为了评估这些药物的效果ε直流生产,我们的研究结果还表明,Hε直流监管不同于8-oxo-dG在RA患者。还需要进一步的研究来阐明机制,占过度生产的Hε直流的RA患者。

尽管很明显,Hε直流水平全血细胞数量的关联与关节,涉及的病理效应水平的提高HεdC在RA还有待阐明。此外,它是另一个重要的问题澄清是否这对RA高程是特定。由于Hε直流epigenetically可能改变基因的积累,也是已知高度诱变(14),这导致了持续的炎症,或者通过p53突变或基因表达的交替,可能会增加癌症的发病率在RA患者(28,29日]。进一步的研究需要阐明H的角色εdC在RA及其并发症的发展。

5。结论

目前的研究表明,脂质peroxidation-derived DNA加合物,Hε是高度累积全血细胞的RA和水平是依赖于年龄的。积极的协会之间的Hε直流值和相关关节的数量表明,HεdC可能成为一种新的生物标志物来评估疾病活动的RA。基于前面的研究结果,本文DNA损害可能扮演了一个重要的角色在RA和/或其并发症的发展虽然还需要进一步的研究来阐明DNA加合物在RA的确切意义。

利益冲突

理事长绪方Atsushi收到义制药株式会社、咨询费有限公司其他作者没有利益冲突声明。

确认

这项工作是支持的项目促进基础研究健康科学研究所的生物医学创新(t . Tanaka)和科研补助金(KAKENHI 23221006 t .松田)。

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