自身抗体在Senear-Usher综合症:大或多个自身免疫?

文摘

Senear-Usher综合症或天疱疮狼疮是一个重叠的病理临床和血清学天疱疮foliaceus和红斑狼疮。皮肤活检的天疱疮患者狼疮揭示皮肤棘层松解和存款细胞桥粒的免疫球蛋白,并积极在狼疮带试验。在本文中,我们决定是否与天疱疮狼疮相关的自身抗体针对单一抗原或多个抗原的刺激独立B细胞克隆。我们本文表明天疱疮患者狼疮产生antiepithelial抗体特定desmoglein 1和3和抗核抗体特定Ro,洛杉矶,Sm和双链DNA抗原。淋洗后特定anti-epithelial或核抗体,恢复使用double-fluorescence化验和测试,缺乏大了狼疮细胞桥粒和核和细胞质之间抗原。这一结果表明,针对不同抗原的自身抗体在天疱疮狼疮,这些自身抗体是由独立的克隆。鉴于这些临床和血清学数据,我们建议天疱疮狼疮表现为多种自身免疫性疾病。

1。背景

天疱疮是一种罕见的瀑特异性自身免疫性疾病的特点是起泡的皮肤和粘膜。天疱疮是组织病理学特点是皮肤棘层松解(1),包含一系列的条件,包括以下几点:寻常天疱疮,天疱疮foliaceus,天疱疮vegetans,多种的天疱疮,天疱疮狼疮(PE),也被称为Senear-Usher综合症。在体育,水泡恰逢脂溢性红斑的皮疹类似皮疹与狼疮有关。血清学、PE患者自身抗体,这类似于天疱疮患者foliaceus和皮肤红斑狼疮。同样地,天疱疮狼疮的皮肤免疫病理的特点是皮肤棘层松解与免疫球蛋白沉积在细胞桥粒和真皮(狼疮带试验)。组织学和血清学标记antidesmoglein的第1天疱疮foliaceus和体育都是一样的2]。

第一个病人,这种疾病被Ormsby报道,米切尔,不久之后,Senear,开创描述一群共享11天疱疮患者临床特征的红斑狼疮和活检显示皮肤棘层松解(3]。随后,提出了天疱疮狼疮是天疱疮的临床变异foliaceus。目前,大多数医生认为这种疾病是一种良性的天疱疮foliaceus包括红斑狼疮的症状和血清学特征。

PE是脂溢性病变的临床特征的鼻子,鼻唇沟,颧骨部位类似红斑狼疮的“蝴蝶”分布。病变也可能影响preauricular地区。与红斑角化过的疤痕和肤浅的水泡可以出现在胸部4]。口腔黏膜、咽和外阴不参与。

自身抗体直接参与天疱疮的发病机制,而在红斑狼疮,自身抗体与肾小球肾炎相关联。这些自身抗体的存在可能会先于临床表现,和高自身抗体效价通常是与炎症相关冲突。antidesmoglein 1的致病作用在天疱疮抗体foliaceus证明了泡在实验动物生产后注入天疱疮foliaceus免疫球蛋白(5,6];另一方面,很少有报道,提供抗核抗体的频率在天疱疮,然而它的频率和PE的致病作用仍未知7,8]。

尽管这些知识,抗原引发疾病没有完全理解。有一些线索表明,环境和其他细胞应激相关因素可能引发自体抗体生产;然而,导致多种自身免疫因素仍有待确定。因为体育天疱疮和红斑狼疮患者自身抗体,因为该疾病临床表现类似于良性天疱疮和皮肤的红斑狼疮,我们试图解决的主要问题是这样的。天疱疮狼疮目标单一抗原自身抗体吗?如果是这样,这种polyreactivity可能源于大。另外,PE自身抗体的结果从不同的抗原刺激吗?在这种情况下,可能导致polyreactivity从分子间抗原决定部位蔓延。

2。材料和方法

2.1。血清

样品收集在我们的实验室在1995年和2008年之间从天疱疮的临床诊断患者使用在目前的调查。最初的纳入标准是存在两个antiepithelial (AEA)和抗核抗体(ANA),由免疫荧光。

从最初的52个阳性患者,10被选上是因为他们滴度至少1:160天疱疮和红斑狼疮自身抗体。我们选择这个安娜效价截止因为高滴度是国际公认的积极成果。此外,10个健康对照组包括年龄和性别匹配的。这个群体包括是因为牛的鼻子不是一个常见的抗核抗体抗原来源的决心。

十个血清选择我们的调查得到诊断为天疱疮患者狼疮。8例妇女和两个平均年龄45岁的男性。临床上,病人有水泡,红斑的沿着颧骨和脂溢性病变分布地区,retroauricular地区,和上胸部的一部分。所有的患者积极的活检为天疱疮,表皮内的水泡和acantholytic细胞。这些患者肾、心肺或中枢神经系统的参与。

2.2。评估Antiepithelial抗体间接免疫荧光法

从屠宰场获得新鲜的牛的鼻子被用作检测天疱疮抗原来源。冰实验室组织运输,嵌入Tissue-Tek 10月,冻结在−20°C。组织样本被削减时4米使用低温恒温器(−20°C),和片固定在幻灯片(9]。天疱疮血清的稀释测试1:80:2560。抗原的血清样本孵化基质30分钟在潮湿的房间,和幻灯片洗了三次在PBS (pH值7.2)。这一步是紧随其后的是一个30分钟的孵化与多价FITC-labelled兔子反抗血清(Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国)。三个额外的PBS洗后,幻灯片和glycerol-PBS安装(9:1)和评估使用奥林巴斯B-Max BX-40荧光显微镜由两个独立的观察员盲目的方式。

2.3。抗核抗体

商业HEp-2细胞(免疫概念NA,萨克拉门托,CA)对幻灯片孵化与血清稀释30分钟1:160:1280,其次是三个PBS洗和30分钟孵化FITC-labelled兔子反多克隆丙种球蛋白(IgA免疫球蛋白,IgMσ)。另一轮的洗涤后,幻灯片和荧光显微镜(安装在glycerol-PBS和评估10]。

2.4。与核酸酶和胰蛋白酶消化

大的天疱疮狼疮血清自身抗体是在两个化验检查。(1)消除核抗原存在于牛鼻组织,组织是由30分钟消化孵化与核酸酶混合物(0.25% DNAse /核糖核酸酶,σ,圣路易斯,密苏里州,美国)在37°C。消化后,幻灯片在PBS清洗三次,紧随其后的是一个30分钟的孵化1:160稀释的病人血清。洗后,幻灯片进一步孵化FITC-labelled山羊反人类免疫球蛋白。最后,核染色和荧光在细胞间的水平空间进行评估。(2)消除细胞桥粒、幻灯片和0.5%胰蛋白酶消化1分钟,和细胞桥粒抗原被通过一个简短的洗SSC缓冲区(氯化钠150毫米和NaCit 15毫米)。然后,反核的水平反应评估。两个积极的控制被包含在这个实验,以确保消除抗原的酶。一个积极的控制从个体与系统性红斑狼疮与血清ANA(1: 5120)和anti-DNA浓度高(1:1280)。这种血清样品进行了测试在牛的鼻子与核酸酶消化。 The other positive control was serum from an individual with pemphigus vulgaris who was AEA positive (1 : 2560). This serum sample was tested on cow nose digested with trypsin.

2.5。Affinity-Purified抗体

每个血清样本30分钟孵化与牛的鼻子或HEp-2细胞与胰蛋白酶消化或核酸酶。然后,幻灯片在PBS清洗三次,特别是结合抗体的筛选了0.2 glycine-HCl, pH值2.8。洗出液中和1米三,pH值9.5 [11),筛选了抗体与Centricon离心设备集中与30-kDa分子量截止(美国微孔,Billerica的)。然后,affinity-purified antiepithelial和抗核抗体被用于执行下面描述的双重荧光标签和ELISA检测。

2.6。Double-Fluorescence标签化验

评估的具体反应性天疱疮狼疮血清与desmosomal对接点的affinity-purified antiepithelial抗体是孵化30分钟未消化的牛鼻组织。样本与PBS洗了三次,然后结合抗体的标记与山羊反人类免疫球蛋白FITC-labelled抗体在30分钟的孵化。孵化后,新一轮的PBS洗了。评估特定核反应,30分钟的幻灯片是孵化affinity-purified抗核抗体,并与PBS洗后,红核标记被激活30分钟的孵化与德克萨斯red-labelled山羊反人类免疫球蛋白。最后,幻灯片是安装和评估在荧光显微镜下染料的使用适当的过滤器。在这些实验中,细胞桥粒染色绿色和细胞核被染成红色。

2.7。良好的抗原特异性

的affinity-purified antiepithelial抗体在每个血清样本进行测试对desmoglein反应1和3使用商业ELISA试剂盒(MBL、国际、沃本妈,美国)。此外,Ro反核反应,洛杉矶,Sm / RNP和磷脂是评估ELISA (Euroimmun AG,吕贝克,德国)。anti-DNA活动被间接免疫荧光法使用评估短膜虫属luciliae化验。

3所示。结果

3.1。血清

所有的阳性血清天疱疮antiepithelial抗体滴度在变量,和八个血清抗体反应与desmogleins (Dsg)。关于狼疮特异性,所有的血清抗核抗体阳性滴度高于1:160 HEp-2细胞。占主导地位的荧光模式很好斑点(六个血清)。一个血清样本有一个均匀的核仁的模式,和其余的血清样本表现出扩散核荧光(图1)。

3.2。血清反应性抗原来源后消化的酶

天疱疮的反核反应性狼疮患者血清废除HEp-2细胞和核酸酶消化。核细胞荧光消失在牛的鼻子,但是荧光在细胞间的空间仍然存在。相反,细胞间核荧光反应消失,但仍积极牛的鼻子用胰蛋白酶处理。最后,在一组牛鼻组织样本双用胰蛋白酶消化和核酸酶荧光被废除。控制实验使用高ANA-titer狼疮血清对牛的鼻子与核酸酶消化不利。此外,寻常天疱疮AEA高的血清效价与trypsin-digested负牛的鼻子。这个实验的结果证明的能力消化过程来消除这些抗原和血清样本可以有两种不同的特异性:是antiepithelial,另一个是反核(图2)。

3.3。Double-Fluorescence化验与Affinity-Purified抗体

的affinity-purified antiepithelial抗体测试未消化的牛的鼻子和用绿色标记在细胞间的空间视觉效果,产生一个蜂窝天疱疮的荧光模式特征。的affinity-purified抗核抗体标记红色的是绑定在角化细胞的细胞核。合并后的图像如图3显示两种颜色的荧光。

3.4。细Affinity-Purified抗体的特异性

确定affinity-purified分子特异性的抗体,他们与ELISA检测。使用这种分析,我们证明了抗体筛选了从牛的鼻子与核酸酶消化展出anti-Dsg1或anti-Dsg3活动但不是核反应。有趣的是,八血清阳性Dsg1和Dsg3,但在两个血清,尽管AEA积极性,优良的特异性不能确定。这些自身抗体是最有可能针对另一个细胞桥粒组件。

同样,从牛的鼻子affinity-purified抗体筛选了与胰蛋白酶消化anti-Ro显示,anti-La, anti-Sm / RNP anti-DNA活动但不是anti-Dsg1或-Dsg3活动。这个实验证实了假设血清从天疱疮狼疮患者自身抗体具有两个不同的家庭,一个对应于天疱疮和针对细胞桥粒蛋白和其他针对核质狼疮抗原,如核糖核蛋白或deoxyribonucleoproteins(图4)。

3.5。天疱疮患者狼疮进化免疫反应

定义免疫反应的分子进化,我们跟踪的免疫特异性血清从三个病人十多年。这个分析的结果产生的结论desmoglein复杂(Dsg 1)最初的自身抗体的目标是因为antiepithelial抗体出现几个月或几年前反核的反应。此外,immunodominant抗原决定基的目标细胞桥粒复杂,所展示的antiepithelial抗体滴度较高(图5)。在此基础上分析,我们可以得出结论,细胞桥粒复杂是初始抗原目标,和抗原决定基随后发生扩散,导致生产核糖核蛋白的自身抗体。

4所示。讨论

目前的调查旨在确定天疱疮狼疮是一个multiple-autoimmune过程。当前结果证实antiepithelial的共存和反核特异性在个体的血清样本,如前所述[12]。此外,我们的免疫化学研究排除自身抗体大。因此,目前发现的致病性相关的观点,因为他们认为存在的多种自身免疫过程在一个病人。

天疱疮狼疮的免疫病理反应早期被Chorzelski et al。12]报告存在的免疫球蛋白和补充dermo-epidermal结类似红斑狼疮带试验;患者还表现出抗核抗体和他们提议天疱疮和红斑狼疮的共存;虽然这一病理遗忘多年,最近出现了一个有趣的论文Oktarina et al。13)表明,在天疱疮狼疮紫外线照射后,沿着dermo-epidermal anti-Dsg1抗体沉积结模仿的狼疮带安娜-病人,然而不同的病人在目前的工作是报道,安娜/ AEA积极和他们没有紫外线辐射。

目前认为患有寻常天疱疮抗体发展Dsg 3,而在天疱疮患者foliaceus,自身免疫反应是针对Dsg 1 (14]。因为体育是一种良性变异的天疱疮foliaceus,预计这些患者会出现Dsg 1的自身抗体。然而,这项研究的结果表明,这些患者同时出现抗体desmoglein 1和3。这一发现可能是意想不到的;然而,抗体的存在Dsg1和3之前已经报道过在个人特有的天疱疮foliaceus [15]。在目前的研究中,我们发现affinity-purified antiepithelial抗体从八个十个病人认可desmoglein 1和3;因此anti-Dsg3的存在在我们的病人可能导致抗原决定基的传播现象,及其可能在PE起泡作用需要进一步阐明。根据目前的结果,我们推测,患者血清自身抗体是由独立的B细胞克隆,因为自身抗体缺乏大。

自身免疫性重叠的概念出现在发现锋利的et al .,谁发现一群患者狼疮的症状,硬皮病、皮肌炎、风湿性关节炎。这个临床实体被任命为混合性结缔组织病(MCTD),及其生物标志物被确认为anti-RNP自身抗体(16]。然而,不同的自身免疫性疾病共存的一个病人可以归因于Senear历史和亚瑟,沟通天疱疮之间可能存在的相关性和红斑狼疮(4]。随后,不同组的皮肤科医生所描述的附加猛烈的自身免疫性疾病和其他疾病之间的联系,如腹腔疾病,甲状腺炎,白癜风,恶性贫血17- - - - - -19]。目前接受,共享自身免疫的概念,因此,早期的调查集中在分子水平上涉及的机制。这些研究揭示了立体化学相互作用的变异度高的地区MHC II类和某些抗原表位(20.,21]。这些研究是基于理论提出的银和1985年Goyert [22]。然后,一个“共享抗原决定基“葛瑞格森等人提出的解释类风湿性关节炎的遗传易感性。有趣的是,在他们的建议,他们指出可能的风险发展的寻常天疱疮和重症肌无力在受试者份额第三高变区抗原表位的D轨迹23]。然而,共享自身免疫的监管角色之外MHC蛋白的变异度高的地区,已经出现了,相反,新的线索对某些等位基因定义自身免疫的临床表现。例如,在猛烈的自身免疫性疾病,一个等位基因可能驱动两个并发自身免疫性反应,一个针对核糖核蛋白,另一个针对细胞桥粒和半桥粒蛋白。DQ是这种情况β1 * 0301等位基因在天疱疮和博士β1 * 0402等位基因在某些类天疱疮的品种(24]。从理论上讲,这些等位基因可能显示不同的立体化学结合能力两个T-dependent抗原表位,如desmogleins或英国石油公司180年,和在其他情况下,他们可能绑定核糖核蛋白。这种特有的等位基因的行为将导致双重自身免疫反应,一瀑特异性反应为天疱疮和另一个反应,表现为不同的表型,如皮肤红斑狼疮(25- - - - - -28]。这种类型的双重反应可能参与天疱疮狼疮。

基于当前的研究结果,我们可以认为体育的主要目标是desmosomal复杂因为antiepithelial抗体反应出现第一,紧随其后的是反核的反应。因此,我们也可以推断细胞桥粒是immunodominant抗原决定基,因为在我们的病人,AEA效价总是高于安娜效价。这个immunodominance可以解释为细胞外desmosomal复杂的可用性。最后,这个有趣的疾病的分子研究代表了一个机会去探索分子间抗原决定基的分子机制传播多种自身免疫引起的可能原因。

确认

这工作是m . e . Perez-Perez学士论文。本文是由PROMEP-UAZ-CA5 Autoinmunidad和红色tematica Autoinmunidad multicentrica。作者感谢穆Moreno博士对他的批评。

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