实验性自身免疫性脑脊髓炎的抑制人类c反应蛋白转基因老鼠是FcRIIB依赖

文摘

实验性自身免疫性脑脊髓炎我们早些时候显示(运算单元)在人类c反应蛋白(CRP)转基因小鼠(CRPtg)延迟性和减少严重程度与野生型小鼠相比。自从人类CRP是已知的与Fc受体和Fc受体已知在扮演一个角色在实验性自身免疫性脑脊髓炎鼠标,我们试图确定FcRI,足球俱乐部RIIb或足球俱乐部RIII需要体现人类CRP-mediated CRPtg的保护。我们报告在CRPtg缺乏的两个激活受体,Fc国际扶轮和足球俱乐部RIII,人类CRP的有利影响仍然观察到。相比之下,如果CRPtg缺乏表达抑制性受体的FcRIIB,那么人类的CRP是废除的有益作用。同时,皮下政府净化人类CRP停滞在野生型小鼠,进行实验性自身免疫性脑脊髓炎的进展,但类似的治疗进展未能阻碍实验性自身免疫性脑脊髓炎老鼠缺乏FcRIIB。研究结果表明,a轴是负责保护CRPtg模型对实验性自身免疫性脑脊髓炎。

1。介绍

c反应蛋白(CRP)是一种广泛使用的血液炎症的标志(1),但越来越明显的是,蛋白质起着因果的作用在宿主防御病原微生物2)在心血管疾病(3]。此外,在至少三个不同的小鼠模型,人类c反应蛋白已被证明能够防止自身免疫性疾病(4- - - - - -6]。重要的是,我们发现人类的c反应蛋白转基因小鼠(CRPtg)对实验性自身免疫性脑脊髓炎(运算单元)6),多发性硬化症(MS)的动物模型。因此在CRPtg与野生型小鼠相比,运算单元开始被推迟,其严重性是减毒,渗透encephalitogenic t细胞和单核细胞/巨噬细胞在中枢神经系统是预防6]。CRP的encephalitogenic细胞相互作用和体现保护实验性自身免疫性脑脊髓炎人类CRP在这些细胞的作用方式并不确定。自从人类CRP在人类和小鼠Fc受体(7- - - - - -10),因为有越来越多的证据表明,Fc受体发挥重要作用在控制和其他自身免疫性疾病的出现实验性自身免疫性脑脊髓炎(11- - - - - -15),我们试图确定Fcγ在Rs是人类所需CRP-mediated保护实验性自身免疫性脑脊髓炎鼠标。

在这里,我们表明,对于CRPtg老鼠缺乏Fc激活受体的表达γ国际扶轮和足球俱乐部γRIII,表达人类的CRP延迟发作,减少以及严重的实验性自身免疫性脑脊髓炎或更好的,而不是与一个完整的Fc CRPtgγR曲目。相比之下在CRPtg老鼠缺乏表达抑制性受体,FcγRIIB,没有观察到人类CRP-mediated保护实验性自身免疫性脑脊髓炎。同样,管理人类c反应蛋白纯化野生型老鼠阻止疾病的恶化正在进行实验性自身免疫性脑脊髓炎,而相同的治疗未能阻止恶化的老鼠缺乏Fc运算单元γRIIB。合并后的数据表明,人类的CRP鼠标FcγRIIB互动及其假定抑制后果是必不可少的在实现人类CRP-mediated保护实验性自身免疫性脑脊髓炎CRPtg小鼠模型。

2。材料和方法

2.1。动物

CRPtg老鼠已经详细描述了在其他地方(16,17]。CRPtg应变(背景C57BL / 6) 31 kb人类DNA片段编码c反应蛋白所有已知的基因独联体代理CRP(即监管元素。,整个人类c反应蛋白启动子)和c反应蛋白假基因(16]。独联体代理监管元素在转基因负责组织特异性和急性期可诱导性表达,和反式表演所需的因素从鼠标的人其正确的监管是守恒的16,17]。人类CRP表示为一个急性期反应物CRPtg,达到血液水平与那些在人类炎性疾病(最高可达500g / mL) (17]。我们之前显示,人类血液中的c反应蛋白水平的CRPtg升高[在实验性自身免疫性脑脊髓炎6]。

CRPtg小鼠交配突变体(也C57BL / 6)缺乏功能表达的基因编码α进行攻击的足球俱乐部γRI (Fcγ国际扶轮^{- / -}老鼠)[12),足球俱乐部γRIIB (FcγRIIB^{- / -}老鼠)[18),而足球俱乐部γRIII (FcγRIII^{- / -}老鼠)[19]。足球俱乐部γR-deficient与充分CRPtg与non-CRPtg后代获得预期的孟德尔比率每个基因型出现的表型正常,并没有一个足球俱乐部γR缺陷显著改变人类CRP(图的表达式1)。识别不同的基因型,我们使用c反应蛋白transgene-specific和足球俱乐部γR突变特异pcr,所述12,16- - - - - -19]。所有老鼠标准食物饮食(Ralston Purina饮食)和保持在恒定的湿度(605%)和温度(241°C), 12小时光周期(6点到下午6点)。所有协议都是机构的动物保健和使用委员会批准在伯明翰阿拉巴马大学一致指导实验室动物保健和使用的发表的美国国立卫生研究院(NIH出版96 - 01、1996年修订)。

图1

γ 6 没有影响的足球俱乐部R不足表达人类CRPtg c反应蛋白的老鼠。每个酒吧和每个须平均值和标准偏差,分别对人类血清CRP浓度测量老鼠。血后24小时获得ip注入25g内毒素,人类CRP测定通过ELISA,既是中描述(]。

2.2。感应的运算单元

一个immunodominant髓少突细胞蛋白(MOG)肽10-12-week-old小鼠进行免疫接种,如[6]。在0到7天,老鼠收到150年皮下注射g MOG肽包含500乳化完全弗氏佐剂g heat-killed结核分枝杆菌(底特律Difco MI)。在天0和2,老鼠收到的腹腔内注射百日咳毒素(500 ng)(生物实验室名单,坎贝尔,CA)。使用临床症状发展的实验性自身免疫性脑脊髓炎每天监测范围从0到6如下:0,无症状;1、失去尾巴基调;2、弛缓性的尾巴;3,不完整的一个或两个后肢瘫痪;4,完整的后肢瘫痪;5、垂死的(在这种情况下,动物是人道的安乐死);6,死了。小鼠观察至少30天,那些分数至少连续超过2天2被认为已经开发出运算单元。 The maximum clinical score achieved by each animal during the 30-day observation period was used to calculate average maximum clinical score (severity) for each experimental group. To study the time-course of disease, average clinical scores were calculated and plotted daily for each group of mice, and cumulative disease index was calculated by area under the curve. When determining the average day of onset of EAE, animals that did not develop any symptoms of EAE during the 30-day period were assigned a day of onset of 31.

2.3。管理人类CRP。小鼠实验性自身免疫性脑脊髓炎

运算单元是诱导如上所述,症状监测的发展。那天他们的疾病症状达到或超过2分(弛缓性尾巴),每个鼠标收到50皮下注射克高纯度(95% - -98%)人类CRP(我们生物,Swampscott, MA)。额外的疾病课程随后10天。c反应蛋白制备钠azide-free,自成一体0.4 ng内毒素/毫克蛋白鲎变形细胞试验,pentameric完整性根据重载原生聚丙烯酰胺凝胶电泳(数据没有显示)。控制动物收到200克heat-denatured人类CRP(煮5分钟)。

2.4。统计分析

中,基因型不同的实验性自身免疫性脑脊髓炎天发病和最大的临床评分(的意思sem)是由单向方差分析和评估posthoc Neuman-Keul多重比较的测试。一个值小于。05年被认为是显著的。

3所示。结果与讨论

正如我们之前的报道(6),推迟发病实验性自身免疫性脑脊髓炎1星期CRPtg比野生型小鼠(图2(一个)和表1;,以及),这推迟疾病导致减少累积指数(表1;32.8和46.55),尽管平均疾病严重程度没有明显降低(表1和图2(一个))。相比之下,对于CRPtg缺乏表情的Fcγ国际扶轮或足球俱乐部γRIII(图2 (b)和2 (c)、职责),人类开始CRP-mediated保护不仅包括推迟实验性自身免疫性脑脊髓炎和降低疾病累积指数也显著减少疾病的严重程度(表1)。相比之下,对于CRPtg老鼠缺乏抑制受体FcγRIIB,表达人类的CRP授予没有防护(表中获益1和图2 (d))。

(一)

(b)

(c)

(d)

(一)
(b)
(c)
(d)

图2

γ γ γ γ γ γ γ γ 1 需要从实验性自身免疫性脑脊髓炎Fc CRP-mediated保护国际扶轮IB。CRPtg与同窝出生仔畜野生型(a)或各自的同行缺乏Fc的表情国际扶轮(b),足球俱乐部国际扶轮II(c),或俱乐部国际扶轮IB注射MOG肽(d),症状监测和实验性自身免疫性脑脊髓炎。c反应蛋白的转基因(封闭的圆圈在每个面板)和完整的Fc在老鼠姗姗来迟的实验性自身免疫性脑脊髓炎Rs (a)和延迟性,减少小鼠缺乏的严重性实验性自身免疫性脑脊髓炎Fc国际扶轮(b)或俱乐部国际扶轮II(c),与此形成鲜明对比的是,在老鼠身上缺乏Fc国际扶轮IB(d),表达人类的CRP没有有益的影响。见表样本大小和统计分析。

其他组织表明,人类CRP皮下接种小鼠可以扭转自身免疫性和antibody-induced炎症(5,20.),一个有益的影响,据报道需要一定的足球俱乐部γRs (20.]。测试如果人类CRP政府可能同样保护小鼠免受运算单元和测试如果FcγRIIB是必需的,我们人类CRP野生型和俱乐部进行纯化γRIIB^{- / -}老鼠与持续的疾病。结果在图进行了总结3。我们观察到野生型小鼠(图3(一个)与人类CRP)治疗,但不治疗heat-denatured CRP,停止运算单元的发展。相比之下,没有保护CRP的影响治疗观察FcγIIB^{- / -}老鼠(图3 (b))。

(一)

(b)

(一)
(b)

图3

γ ^{- / -} γ ^{- / -} c反应蛋白治疗摊位在野生型老鼠而不是Fc的实验性自身免疫性脑脊髓炎国际扶轮IB老鼠。野生型(a)与Fc国际扶轮IB注射50 (b)与正在进行的实验性自身免疫性脑脊髓炎g纯化时CRP南卡罗来纳州临床分数达到2(水平线),症状监测和实验性自身免疫性脑脊髓炎为10天。控制收到heat-denatured CRP。

已经证明,人类体内的一些活动CRP可能结果(直接或间接)的蛋白质绑定Fc的能力γRs (20.,21]。足球俱乐部γRs是大多数哺乳动物表达的受体家族的四个主要类型:FcγRI,足球俱乐部γRII,足球俱乐部γRIII,足球俱乐部γRIV [14,22,23]。每一个足球俱乐部γRI,足球俱乐部γRIII,足球俱乐部γRIV由配体的绑定α链搭配了一个常见的γ链(货代γ),编码一个immunoreceptor tyrosine-based激活主题(ITAM)传播的关键细胞激活信号。足球俱乐部γRIIB另一方面是由一个单一的α链,它带有细胞质tyrosine-based抑制主题(ITIM)传播细胞抑制信号。各种调查人员报告说,人类CRP绑定到一个或多个亚型FcγRI,足球俱乐部γRII,足球俱乐部γRIII,老鼠和人7- - - - - -10),而足球俱乐部γ在鼠标(Rs据说影响实验性自身免疫性脑脊髓炎14,24]。因此在CRPtg,人类CRP可能可以通过绑定一个加剧实验性自身免疫性脑脊髓炎有助改善炎症Fc物损伤你的心脏γ通过结合Rs encephalitogenic细胞或抑制实验性自身免疫性脑脊髓炎FcγRIIB。使用CRPtg老鼠与Fc的选择性删除γRs,我们能够调查如果能力意识到体内。

引人注目的有益作用的证据是主要取决于人类c反应蛋白在小鼠实验性自身免疫性脑脊髓炎的表达抑制性受体FcγRIIB。因此在俱乐部γRIIB^{- / -}既不推迟也不抑制小鼠实验性自身免疫性脑脊髓炎的人类c反应蛋白的转基因表达。事实上在CRPtg / Fc的节奏和严重性实验性自身免疫性脑脊髓炎γRIIB^{- / -}没有明显不同于野生型小鼠。相比之下,人类开始CRP-associated延迟实验性自身免疫性脑脊髓炎和症状完全表达在衰减的实验性自身免疫性脑脊髓炎的老鼠缺乏激活受体:Fcγ国际扶轮或足球俱乐部γRIII。我们没有正式排除Fc的可能性γRIV可能扮演一个角色,FcγRIV^{- / -}老鼠不提供给我们,但是我们确实执行实验小鼠缺乏γ链货代货物收据常见γ,这是预测缺乏Fc的表情γRI,足球俱乐部γRIII,足球俱乐部γRIV [14]。人类的c反应蛋白转基因货代γ^{- / -}明显比野生型小鼠抗(数据未显示),不过货代的贡献γ(因此FcγRIV)人类尚不清楚,因为货代CRP-mediated抗实验性自身免疫性脑脊髓炎γ^{- / -}老鼠本身(本质上是非常耐实验性自身免疫性脑脊髓炎24]。因此在他们和数据表明,人类CRP CRPtg鼠标的EAE-protective效果很大程度上取决于可用性/ Fc的表情γRIIB。可能通过绑定FcγRIIB,人类c反应蛋白表达从内部疾病过程中抑制了encephalitogenic的激活状态(Fcγ在CRPtg RIIB-expressing)细胞。同样,在nontransgenic老鼠体内注射人类只要Fc CRP有相同的影响γRIIB。

4所示。结论

CRPtg老鼠,transgene-expressed人类c反应蛋白,抑制实验性自身免疫性脑脊髓炎,这有益的行动需要FcγRIIB。如果在CRPtg运算单元,一个保护性CRP足球俱乐部γRIIB轴存在于人类与女士,然后CRP政府可能有利于患者的临床治疗,持续的努力在我们的实验室旨在识别CRP-responsive FcγRIIB-expressing encephalitogenic细胞(s)参与这一行动,我们假定是树突细胞(25]。

确认

所述纸是由研究授予国家多发性硬化症协会(RG 3216 - a - 5能和SRB),由美国国立卫生研究院培训补助(T32 AI07051 TNR和T32 AR07450 NRJ),和霍华德·休斯Med-Grad UAB的奖学金计划(TTW)。

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