Omega-3脂肪酸对人体免疫细胞基质金属蛋白酶-9的产生和细胞迁移的影响:对多发性硬化症的影响

摘要

在多发性硬化症(MS)中，受损的血脑屏障(BBB)完整性有助于炎症T细胞迁移到中枢神经系统。基质金属蛋白酶9 (MMP-9)与血脑屏障破坏和随后的T细胞迁移到中枢神经系统有关。本文的目的是评估omega-3脂肪酸对MMP-9水平和T细胞迁移的影响。健康对照组的外周血单个核细胞(PBMC)用两种omega-3脂肪酸、二十碳五烯酸(EPA)和二十二碳六烯酸(DHA)预处理。用细胞上清检测MMP-9蛋白和活性水平。用EPA和DHA预处理Jurkat细胞，并将其添加到纤维连接蛋白包被的transwell中以测量T细胞迁移。EPA和DHA显著降低MMP-9蛋白水平和MMP-9活性，显著抑制人T细胞迁移。数据表明，omega-3脂肪酸可能通过调节免疫细胞产生MMP-9而使多发性硬化症患者受益。

1.介绍

多发性硬化症(MS)是一种中枢神经系统(CNS)的炎症性疾病，t淋巴细胞、巨噬细胞和抗体被认为参与了脱髓鞘和轴突损伤[1- - - - - -3.］．尽管MS的病因尚不清楚，但普遍认为MS是由于获得性免疫失调和异常激活导致中枢神经系统中T细胞驱动的炎症过程，导致脱髓鞘和轴突损伤。多发性硬化症通过改变中枢神经系统中T细胞驱动的炎症过程来改变治疗[4- - - - - -10］．鉴于这些疗法只是部分有效，仍有必要确定有效和安全的新疗法。

基质金属蛋白酶9 (Matrix metalloproteinase-9, MMP-9)是蛋白酶家族中的一员，通过消化细胞外基质、基底膜和体内其他组织中的胶原成分，帮助细胞外基质、基底膜和其他组织重塑。在多发性硬化症中，MMP-9被认为通过帮助破坏血脑屏障在炎症细胞向中枢神经系统的转移中发挥重要作用[11］．一些研究报告称，与对照组相比，MS受试者的MMP-9水平更高[12- - - - - -15］．干扰素β (ifn - β)具有抑制T淋巴细胞和CD4+ T细胞产生的MMP-9水平的能力[16- - - - - -18，这被认为是这种疗法改变疾病进程的一种机制[17］．

二十碳五烯酸(EPA)和二十二碳六烯酸(DHA)是长链-3脂肪酸(omega-3 FA)的两种形式，它们是免疫细胞调节剂，已被报道可降低MS患者受刺激的PBMC分泌的促炎细胞因子水平[19］．据报道-3脂肪酸可显著降低MMP-2、-3、-9和-13的水平[20.- - - - - -22］．一项体外研究报告说，与鱼油或-3脂肪酸混合物(53%的EPA和27%的DHA)孵育的lps激活的小胶质细胞分泌的MMP-9蛋白水平呈剂量依赖性下降[23］．报告数据对EPA和DHA的能力减少促炎细胞因子和MMP-9水平显示一个潜在的治疗作用这些omega - 3 FA女士我们组观察到显著减少MMP-9蛋白质分泌如果PBMC的开放研究十复发患者[女士汇款24］．

体外研究的目的是:(1)研究不同浓度EPA和DHA对PBMC MMP-9蛋白分泌的影响;(2)研究不同浓度EPA和DHA对PBMC MMP-9蛋白分泌的影响。(3)评估不同浓度的EPA和DHA对人体T细胞穿越纤维连接蛋白屏障的迁移作用。

2.方法和材料

2．1．主题

这项研究由俄勒冈健康与科学大学的机构审查委员会批准，研究对象在抽血前征得同意。13名健康对照受试者进行单次抽血分离PBMC。纳入标准包括年龄18岁或以上、无严重健康状况(如神经系统疾病、心血管疾病、未控制的糖尿病和癌症)的受试者。排除标准包括任何下列之一:怀孕,补充ω- 3 FA抽血的4周内,每周吃一份鱼抽血的4周内,在柜台和日常使用的处方或抗炎药物在两周的抽血。在抽取血液4小时内，从健康对照者的肝素化血液中分离出PBMC(淋巴细胞分离培养基;Mediatech)。

2．2.PBMC与EPA和DHA孵育

将PBMC重悬在X-Vivo 15中，其中添加1% l -谷氨酰胺、100 U/mL青霉素、100 ug/mL链霉素、1%丙酮酸钠和25 mM HEPES细胞/毫升。用于体外培养的脂肪酸是根据Curtis等人的方法制备的[20.］．简单地说，游离脂肪酸白蛋白(Sigma-Aldrich)以3.5的浓度重悬μg/mL in Tyrode-HEPES buffer (20 mM HEPES, 140 mM NaCl, 4.5 mM KCl, 1 mM MgCl)₂， 2.5 mM CaCl₂， 11mm葡萄糖，pH 7.4)。EPA、DHA和油酸(OA)从Sigma-Aldrich提取，以5 mg/mL的缓冲液配制，在37°C旋转孵育16小时，消毒，并在−20°C保存1周。

分离后，PBMC用以下浓度的EPA和DHA预处理2小时:10μg / mL, 25岁μ50 g / mL,μg/mL，再用刀豆蛋白A (ConA)刺激。收集细胞上清，检测MMP-9水平和MMP-9活性。油酸(OA)是一种单不饱和脂肪酸，用于控油。对照PBMC在以下浓度下与OA孵育2小时:10μg / mL, 25岁μ50 g / mL,μg/mL，再用ConA刺激。以ConA刺激未处理的PBMC作为参照对照(定义为100% MMP-9活性)。

2．3.MMP-9水平和MMP-9活性的测量

采用酶联免疫吸附法(R&D Systems Inc, Minneapolis, MN)测定MMP-9水平。明胶底物酶谱法测定细胞上清MMP-9活性[25］．

2．4．Jurkat细胞培养和转运试验

人CD4+ T细胞系(Jurkat克隆E6-1;CD4+ T细胞与MS发病机制有关。这些分析是基于我们实验室之前描述的[25］．Jurkat细胞在添加10%热灭活胎牛血清、2 mM l -谷氨酰胺、青霉素-链霉素(100 U/mL和100μg/mL，相对)，1 mM碳酸氢钠，25 mM HEPES在37°C和5% CO₂．

细胞添加到3μm纤维连接蛋白涂层transwells (VWR International, Bridgeport, NJ细胞每毫升200μL 1%胎牛血清培养基。600年μ将L培养液单独加到下腔。环保署分别在10,30和100μDHA浓度分别为10、30和100μg/mL，对照孔与OA共孵育30℃μ克/毫升。所有试剂都以相等的最终浓度加入到上室和下室。在37°C下进行20小时的迁移。然后摇板10分钟，从横切孔底部移走粘附细胞。取出transwell，加入最终浓度为50 mM的Calcein AM, 37℃孵育45分钟。在Cytofluor 4000(485)上读取荧光励磁535发射)。迁移试验分别进行了三次;有代表性的实验值用盐水处理井的细胞荧光百分比表示。

2．5．数据分析

在相同的实验条件下，对三个不同的健康对照受试者的数据进行了分析。采用SPSS 14.0进行统计学分析。未处理的对照细胞的迁移能力(以下房钙素am阳性细胞的百分比表示)定义为100%;以不同浓度DHA、EPA和OA培养的细胞迁移能力作为对照井的百分比进行计算。同样，不同浓度DHA、EPA和OA处理后的MMP-9活性百分比以相对于未处理对照(定义为100%)的百分比表示。采用方差分析比较MMP-9蛋白水平和活性百分比。Tukey的HSD用于比较DHA、EPA和OA各浓度与未处理对照组之间的差异。标准误差(SE)由三个健康对照对每个omega-3浓度(SD/)的平均值得出的标准偏差(SD)确定√3）.T-试验用于比较各浓度与未处理对照的活性百分比和迁移百分比。意义被定义为．

3.结果

3．1.Omega-3脂肪酸对PBMC分泌MMP-9水平的影响

数字1显示DHA、EPA和控油OA对MMP-9蛋白水平的影响。DHA在10μg/mL降低MMP-9平均水平至85.5 ng/mL (SE±10.9;),在25岁μg/mL降低MMP-9水平至41.5 ng/mL (SE±7.5;)， 50岁μg/mL死亡MMP-9水平至无法检测(）.环保署在10μg/mL降低MMP-9平均水平至50.9 ng/mL (SE±9.2;),在25岁μg/mL降低MMP-9平均水平至4.4 ng/mL (SE±4.4;)， 50岁μg/mL降低MMP-9水平至检测不到(）.所有OA浓度的MMP-9水平均无显著下降(对于所有浓度)。

3．2．-3对PBMC分泌MMP-9活性的影响

数字2显示DHA、EPA和OA对MMP-9平均活性的影响。DHA在10μg/mL使MMP-9活性平均降低21.5% (SE±8.0;),在25岁μMMP-9活性降低29.0% (SE±7.5;)， 50岁μg/mL使MMP-9活性降低51.4% (SE±20.1;）.环保署在10μMMP-9活性降低9.6% (SE±6.0;),在25岁μMMP-9活性降低29.0% (SE±11.0)()， 50岁μg/mL使MMP-9活性降低69.0% (SE±11.0;）.OA 10点μg/mL降低至9.0% (SE±6.0;),在25岁μg/mL降低14.6% (SE±13.0;)， 50岁μg/mL平均活性降低29.0% (SE±13.0;）.

3．3.Jurkat细胞迁移试验

人Jurkat T细胞与DHA和EPA共孵育降低了它们通过假血脑屏障的迁移能力(图)3(一个)和3 (b)）.DHA在30μg/mL降低Jurkat细胞迁移率46.2%μg/mL比83.9% (两个)。迁移期结束时收集的培养上清进行电泳和明胶底物酶谱检测MMP-9活性。相应的对迁移能力的影响，DHA在30μg/mL时MMP-9活性降低36.3%μg/mL比[两个;数字3(一个)］．同样，EPA处理Jurkat细胞培养物显著降低Jurkat细胞穿过纤维连接蛋白屏障的能力，相应降低MMP-9活性。环保署在10μg/mL使Jurkat细胞迁移率降低46.9%μg/mL增加51.8%，在100μg/mL提高83.1% (对于所有)。环保署在30μg/mL时MMP-9活性降低69.6%μg/mL, 88.3% [两个;数字3 (b)］．油压30μg/mL降低Jurkat细胞迁移5.5% ()， MMP-9活性在OA处理的细胞中未被评估。

4.讨论

研究表明，DHA和EPA，单独或在体外较低浓度时，有能力减少健康对照组PBMC中MMP-9的产生和活性。此外，两种类型的omega-3脂肪酸都能够以浓度依赖的方式抑制T细胞通过纤维连接蛋白屏障的迁移。所有体外试验都检查了细胞活力，所有浓度测试的细胞活力保持在68-84%之间，表明观察到的影响不是细胞死亡的结果。

MMP-9介导的血脑屏障破坏是炎症细胞进入MS CNS的一种机制。与健康对照组相比，MS患者MMP-9 mRNA水平显著升高。免疫细胞(PBMC)中MMP-9表达的增加可能使这些细胞更容易越过血脑屏障进入中枢神经系统[26，27］．Stüve等人观察到，从未经治疗的MS患者中分离出来的活化t淋巴细胞，由于MMP-9活性增加，能够通过纤维连接蛋白屏障迁移。经ifn - β处理的t淋巴细胞降低了这些细胞的迁移能力[18］．Dressel等人观察到，与对照组相比，未经治疗的MS患者中CD4+ T细胞通过纤维连接蛋白屏障的迁移增强，而不是CD8+细胞，并且IFN-beta治疗减少了CD4+细胞迁移和MMP-9生成[16］．降低t淋巴细胞MMP-9表达和MMP-9蛋白水平是IFN-beta治疗MS的治疗作用机制之一[17］．

在本研究中，我们证明了EPA和DHA能够在相对较低的浓度下降低MMP-9蛋白水平和活性。用DHA和EPA孵育健康对照的PBMCμg/mL将MMP-9水平降低到检测不到的水平，并将MMP-9活性分别降低51%和69%。油酸(一种单不饱和脂肪酸)作为控油，并没有显著降低MMP-9水平或活性(图)1和2）.此外，EPA最低为10μg/famL和DHA 30μg/mL显著抑制T细胞通过纤连蛋白屏障的迁移，这种抑制与MMP-9活性降低有关[图]3(一个)和3 (b)］．油酸对T细胞迁移无明显抑制作用。这些结果表明，omega-3脂肪酸、DHA和EPA具有降低免疫细胞MMP-9蛋白分泌并降低其活性的能力;综上所述，这些对MMP-9的调节作用可能会阻碍细胞穿过中枢神经系统基底膜的迁移。

的意思是每日口服3.0克鱼油(含0.57克EPA和0.45克DHA)后，血浆中EPA和DHA的含量分别为7.7毫克/分升和9.8毫克/分升[28］．在本研究中，EPA和DHA的体外浓度为5 mg/dL (50μg/mL)显示MMP-9水平和活性降低，T细胞迁移减少。研究结果表明，服用omega-3脂肪酸可以降低MMP-9水平，而omega-3脂肪酸的剂量仅为报告中MS受试者MMP-9水平降低剂量的三分之一[24］．目前评估omega-3脂肪酸补充对多发性硬化症的影响的研究有限，只有一项研究评估omega-3脂肪酸对多发性硬化症疾病活动的影响。一项双盲安慰剂对照试验随机化MS患者()到每天20粒鱼油胶囊或橄榄油安慰剂的研究报告显示，在2年多的时间里，与对照组相比，鱼油治疗组的疾病严重程度(扩大残疾状态量表)有改善趋势() [29］．橄榄油安慰剂含有72%的油酸，鱼油含有EPA 1.71克/天和DHA 1.41克/天。一项研究报告，促炎细胞因子白细胞介素-1 (IL-1)的水平较基线显著下降β） （)、肿瘤坏死因子(TNF-α） （)、2 ()和干扰素-γ（)，由MS受试者和健康对照者的未受刺激和受刺激PBMC补充鱼油而产生[19］．在一项开放标签研究中，我们小组报告了MMP-9水平较基线水平有所下降，10名复发缓解型多发性硬化症患者在3个月的时间里每天服用8克鱼油浓缩物(2.9克EPA和1.9克DHA)。在所有10名受试者中观察到MMP-9水平的降低，无论他们是否服用MS疾病改善药物[24］．从有限的临床试验报告中，有一些建议，omega-3脂肪酸具有免疫调节特性，可能对MS有益。需要进一步探索omega-3脂肪酸在MS中的最佳剂量。

5.结论

体外研究和MS开放标签研究的联合结果表明DHA和EPA -3 FA可能在抑制激活的免疫细胞迁移到中枢神经系统中有作用，进一步研究-3 FA在MS中的作用是有必要的。

致谢

本文由美国国立卫生研究院P50 AT00066-01、退伍军人事务部生物医学实验室研发服务部和南希·戴维斯无墙中心资助。L. Shinto和G. Marracci对这篇论文贡献相同。

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