文摘
Tanshinone花絮(TanIIA)的主要活性成分是脂溶性的组件分离丹参邦吉。我们先前的研究令人信服地证明TanIIA是一种有效的药物对人类结直肠癌细胞。为了进一步证明TanIIA对CRC的影响,我们进行了探索性研究体内和体外。结果表明TanIIA显著地比对照组更有效阻止肿瘤的生长,并增加了存活时间。癌细胞生存和增殖是伴随着浓度和时间依赖性与TanIIA下降。我们发现TanIIA改变细胞骨架形态,它可以明显诱导大肠癌细胞的凋亡,阻止细胞G0 / G1期。TanIIA也增加了磷酸化p38MAPK,调节ATF-2表达和表达下调Transgelin-2表达式,可逆转由SB203580 p38MAPK-specific抑制剂。我们的研究结果建议TanIIA可以诱导结肠癌细胞凋亡和阻止细胞G0 / G1期参与表达下调Transgelin-2通过p38MAPK信号通路的表达。
1。介绍
结直肠癌(CRC)是第三个最常见的恶性肿瘤,在2021年在美国,估计有149500新病例被诊断和CRC(52980人死亡1]。目前,主要CRC是手术切除的治疗(2]。病人不能忍受手术或承担高风险的复发和转移,治疗方法包括全身和局部化疗、靶向制剂和免疫治疗(3,4]。更重要的是,很多有效成分提取与传统草药起到明显的抗肿瘤作用,预计开发一些专门针对性的药物在癌症发展,创建一个新的癌症治疗领域(5,6]。
Tanshinone花絮(TanIIA)是一个phenanthrene-quinone导数隔绝Dan-shen的学名丹参Bunge,它已被用于治疗多种疾病,如冠状动脉心脏病(7),代谢紊乱(8),肺纤维化(9[],癌症10),和炎性疾病11),预计是相对安全的对其毒性。丹参Bunge,中药具有促进血液循环的影响和消除血瘀,月经和缓解疼痛12]。丹参Bunge主要有两种活性成分,一个是亲水成分,如Salvianolic酸,另一个是亲脂性的组件,主要tanshinones,比如tanshinone花絮和cryptotansetron (CPT) [13]。目前的研究已经证实,tanshinone关键组成部分丹参邦基集团,有抗癌作用14]。Tanshinone花絮”,作为主要的抗癌成分丹参邦基集团,是丰富的丹参根和含量高于其他组件15]。
我们先前的研究已经坚定地表明TanIIA可以调节epithelial-to-mesenchymal过渡(EMT)抑制转移的CRC (16]。然而,其抗肿瘤活性的分子机制尚未完全理解和值得进一步调查。
Transgelin,一家actin-binding蛋白质,改变细胞骨架的结构和形态17),与细胞生物学相关的癌症,包括细胞周期、形态发生和迁移2]。这些蛋白质调节增殖和凋亡的作用在许多不同的细胞包括结直肠癌细胞癌(18,19]。
在这项研究中,我们进一步证明了细胞凋亡的诱导和增殖抑制人结肠癌细胞SW620是高度相关的表达通过激活Transgelin-2 p38MAPK通路调节细胞周期。这将有助于提供实验依据TanIIA治疗CRC的机制。
2。材料和方法
2.1。实验动物
提供的健康BALB / c裸小鼠实验动物部上海中医药大学进行药效学研究。所有的老鼠都提供了一个标准的饮食和放置在温度控制设施直到研究结束的。所有实验根据当地动物保护立法的建议和批准和伦理委员会负责动物研究。
2.2。细胞系
人类结肠癌细胞系SW620收购上海生物科技有限公司。细胞培养在l - 15(康宁,中国)中补充10%胎牛血清(Gibco生活技术,大岛,纽约)和1%的青霉素和链霉素(Gibco生活技术,大岛,纽约)在5%的碳dioxide-air 37°C湿润孵化器。
2.3。药物
TanIIA,纯度> 98%,从阿拉丁购买生物技术有限公司有限公司;序列号:T109794;SB203580从多国评价购买;序列号hy - 10256 a。
2.4。动物模型
一百名男性裸体小鼠(18 - 20 g, 5周大)皮下注射 SW620细胞。一周后,小鼠随机分为5组,并分别采用生理盐水(NS, 25毫升/公斤)、二甲亚砜(DMSO溶液,0.2%),或TanIIA解决方案在低(0.5毫克/公斤)/中间(1毫克/公斤)/(2毫克/公斤)高剂量,通过尾静脉注射为14天1维克/天。十并观察每组小鼠肿瘤的生长速率。当老鼠牺牲,所有肿瘤切除和检查通过测量最长最短(a)和(b)垂直维度。其他每组10只老鼠被用来观察他们的生存时间,根据伦理要求,老鼠人道死亡肿瘤体积达到2000毫米3。肿瘤大小(V),增长率(GR)和存活率(SR)根据以下公式计算: , ,和 。
2.5。TUNEL分析
TUNEL分析检测与原位检测细胞死亡工具包(瑞士罗氏公司)。肿瘤组织石蜡包埋部分在二甲苯deparaffinized,然后添加到一系列分级的乙醇(绝对,95%,75%,5分钟)和细胞膜破裂0.1% tritonx - 100(国药控股、中国)8分钟。紧随其后,幻灯片在TBS冲洗三次,孵化与平衡缓冲半个小时在室温下。之后,部分与重组TdT)孵化酶(美国热Fisher)在黑暗1小时37°C。孵化后,幻灯片和TBS洗3次(5分钟),然后用DAPI孵化在室温下10分钟,安装不变色的解决方案(Solarbio, S2100,北京),并存储在黑暗中在4°C。照片拍摄在荧光显微镜(德国徕卡)。
2.6。CCK-8化验
人类大肠癌细胞SW620 heat-inactivated保持在l - 15中补充10%胎牛血清。在对数期细胞生长实验。细胞浓度的准备 /毫升,接种在100ul / 96 -孔板,然后要么DMSO溶液处理,或与TanIIA一系列浓度(0、2、4、8、16、32、64μmol / L) 24、48和72小时,每六个复制。一个空白对照组是没有细胞。治疗后细胞的异常被CCK-8评估试验中含有10% CCK-8试剂2 h。标仪测量吸光度在450 nm,细胞生存能力确定的平均阅读善待除以平均阅读的控制。直线相关分析被用来修复剂量和细胞生存能力。
2.7。集落形成实验
SW620细胞被播种在6-well板块每口井的1000个细胞的密度。当细胞连接,他们对待不同浓度的TanIIA (1u摩尔,2u摩尔和4u摩尔)。媒介改变了每4天。10天后孵化,细胞被固定和染色。殖民地由> 50个细胞数和拍照。
2.8。赫斯特33258年染色
细胞培养在一夜之间无菌盖杯子放在6-well盘子。由TanIIA 2天治疗后,固定细胞,洗了两次,然后沾1毫克/毫升赫斯特33258年5分钟在黑暗中在正常温度。之后,洗了两次细胞PBS和拍摄荧光显微镜(德国徕卡,DM2500) 。凋亡细胞被核凝结和/或碎片。
2.9。免疫荧光实验
短暂,当细胞密度在24-well板达到了50%,以4%的多聚甲醛固定,细胞膜破裂TritonX 0.1%和5% bsa的45分钟是密封的,孵化与Phalloidin(美国热费希尔)在黑暗中37°C 1 h,然后由PBS洗3次(3分钟),其次是在黑暗中孵化与DAPI 5分钟。最后,细胞被安装的幻灯片不变色的解决方案。图像是由激光扫描共焦显微镜(德国徕卡)。
2.10。流式细胞术分析
SW620细胞无血清培养系统指数增长阶段和处理培养基12 h到细胞周期同步。然后用不同浓度TanIIA (4umol / L, 8umol / L, 16岁umol / L) 48 h, resuspended成单个细胞悬液,沾anti-Annexin V FITC和π。TanIIA细胞凋亡和坏死率的影响通过流式细胞仪检测。一般来说,早期凋亡细胞出现膜联蛋白+ /π-,晚期凋亡和坏死细胞呈现膜联蛋白+ / PI +,和正常细胞膜联蛋白- /π,分别。
2.11。免疫印迹分析
样本的蛋白质转移到PVDF膜SDS-polyacrylamide凝胶电泳后10%。膜被TBS-T阻断缓冲区中含5%脱脂奶粉(10更易/ L三,pH值7.5,100更易与L氯化钠,和0.1%渐变20)2小时,一夜之间可以孵化之前在4°C与特定的抗体总p-p38MAPK p38MAPK, ATF-2, Transgelin-2, Bcl2,伯灵顿,GAPDH和β肌动蛋白抗体(美国CST)。膜被孵化的二级山羊抗体(beyotime,中国)再加上辣根过氧化物酶(合)在室温下2小时,洗TBS-Tween解决方案三次,并添加AB开发者(1:1,v / v)。
2.12。统计和分析
统计分析使用SPSS 22.0统计软件包(美国芝加哥,IBM IL)。单向方差分析是用于统计分析,然后费舍尔最小显著差异测试。所表达的结果 , ,和一个值的 被认为是显著的。
3所示。结果
3.1。TanIIA抑制大肠癌的生长和诱导细胞凋亡的皮下异种移植小鼠模型
如数据所示1(一)- - - - - -1 (c),肿瘤抑制率与TanIIA的浓度呈正相关,和裸体小鼠结肠直肠肿瘤的重量显著降低大约90% TanIIA高剂量治疗后相比,生理盐水对照组和DMSO组。此外,TanIIA对小鼠的存活时间的影响与结直肠肿瘤也决定(图1 (d))。五十个老鼠最终死于结肠癌。其中,在高剂量TanIIA(2毫克/公斤)显示的最佳前景改善小鼠的存活时间,96天( ),而对照组54天的生存时间。生活方面的延伸率,TanIIA组的有效率(2毫克/公斤)几乎是对照组的两倍。此外,TUNEL分析(图1 (e)染色)显示TanIIA治疗组表现强于控制,这表明TanIIA抑制大肠癌的生长和诱导凋亡的体内。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
3.2。TanIIA抑制人类CRC体外细胞的生长和增殖
所有的曝光时间测试(24小时、48小时和72 h), TanIIA治疗表现出显著的抑制效应SW620细胞增长相比对照组( )剂量依赖性的方式(图2(一个))。50%抑制浓度(IC50) TanIIA 24、48岁和72 h是41.60,11.76和5.289u分别为mol / L(图2 (b))。显然,更高浓度的TanIIA产生显著增长抑制在24 h,也是时间的方式和效果。此外,集落形成试验表明,集落形成的数量减少与TanIIA浓度的增加(数据2 (c)和2 (d))。所有结果表明TanIIA抑制人类CRC体外细胞的生长和增殖。
(一)
(b)
(c)
(d)
3.3。TanIIA诱导结肠癌细胞凋亡和细胞骨架变化
核形态是由膜透性蓝赫斯特33258年评估。在荧光显微镜下,与TanIIA SW620细胞治疗后48小时显示细胞凋亡形态学变化特征(图3(一个))。控制文化,SW620细胞的细胞核出现正常的,圆的,和大的尺寸。相比之下,大多数SW620细胞的细胞核TanIIA对待明亮染色,体积小,染色质浓缩。我们发现含有浓缩的凋亡细胞核染色质数量显著增加,浓度依赖性。进而评估细胞的形态特征,phalloidin标记细胞与激光共焦显微镜观察。图3 (b)表明治疗16umol / L TanIIA 24 h,信息结摔了下去,并且细胞骨架萎缩,细胞体圆形,体积减少,karyopyknosis,核分裂。这是表明TanIIA诱导结肠癌细胞凋亡和细胞骨架改变。
(一)
(b)
3.4。通过激活TanIIA p38 MAPK通路诱导细胞凋亡
细胞死亡的类型分为凋亡细胞死亡或坏死细胞死亡,它可以检测到膜联蛋白V-FITC和propidium碘(PI)染色和流量仪分析。正常细胞被膜联蛋白V - /π,而细胞早期凋亡膜联蛋白V + /π-,和细胞在晚期凋亡/坏死双是积极的。在我们的实验(图4(一)),细胞生存能力的降低引起TanIIA 48 h后治疗结合的细胞数量的增加有经验的早期或晚期凋亡事件,和增加显著控制相比,尤其是仍在G0 / G1期细胞的比例增加,如图4 (b)。细胞凋亡率( )% ( )%,( )%,分别处理4、8、16umol / L的TanIIA 48 h。
(一)
(b)
之后,除了p38MAPK信号通路受阻(p38MAPK对待特定抑制剂SB203580和TanIIA), G0 / G1期细胞的凋亡率和比TanIIA治疗组相比显著降低。的细胞凋亡率和G0 / G1期细胞比率相比没有改变组仅接受SB203580(图4(一))。
结果表明,TanIIA可能诱发显著的结直肠癌细胞凋亡与TanIIA SW620细胞治疗后48 h和阻止细胞G0 / G1期在剂量依赖性的方式。p38MAPK信号通路可能参与TanIIA-induced SW620细胞的凋亡。
3.5。Transgelin-2的表达减少TanIIA p38 MAPK的激活
研究已经证明,Transgelin-2是积极的表达与预后差相关的不同的癌症(20.]。因为我们先前的研究发现,结肠癌细胞SW620细胞凋亡p38 MAPK激活后,我们做了一个点是否Transgelin-2表达式p38 MAPK活性相关。调查的凋亡诱导效应的机理TanIIA SW620细胞,p-p38MAPK的表达,p38MAPK,和ATF-2 Transgelin-2 TanIIA治疗后被免疫印迹分析。正如所料,表达式p-p38MAPK和ATF-2调节,Transgelin-2 TanIIA表达下调的剂量依赖的模式,而平等p38MAPK水平显示(图5(一个)和5 (b))。为了验证Transgelin-2和p38MAPK之间的关系,然后我们检查了SB203580 p38MAPK特定抑制剂治疗后表达水平。数据5 (c)和5 (d)表明,p38MAPK抑制剂Transgelin-2,差别可能扭转对这些p-p38MAPK和ATF-2和相同的性能。此外,抗凋亡蛋白bcl - 2被TanIIA显著下调,还与治疗SB203580逆转,而细胞诱导凋亡蛋白伯灵顿进行反向(数字5 (e)和5 (f))。所有结果支持TanIIA可以诱导的细胞凋亡SW620细胞通过激活p38MAPK信号通路的差别是参与对这些Transgelin-2。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
4所示。讨论
细胞凋亡,高度管制的细胞死亡形式,定义为一系列的形态学和生物化学变化涉及细胞的激活事件,在预防癌症的发展中起着重要作用,损伤细胞凋亡是现在被认为是肿瘤发生的一个里程碑21,22]。细胞凋亡通路的激活细胞毒性药物杀死肿瘤细胞的重要机制(23]。因此,诱导细胞凋亡已被认为是一个重要的评价方法来评价抗肿瘤的药物的临床疗效和一个新的抗肿瘤的药物选择的重要指标(24,25]。
我们的研究提供了证据的潜在的抗癌效果TanIIA人类CRC SW620细胞行,这是通过抑制细胞增殖和诱导细胞凋亡。结果证明TanIIA可以抑制肿瘤的生长,延长生存时间在裸小鼠移植轴承结直肠肿瘤。TanIIA也降低了细胞的生长浓度和时间的方式由CCK-8试验证实。证明是否细胞死亡是由诱导细胞凋亡,赫斯特33258染色,流式细胞仪分析,propidium碘染色进行。的数量与集中染色质在细胞凋亡细胞核TanIIA治疗后显著增加。细胞凋亡的诱导和/或细胞增殖的抑制作用是高度相关的激活多种细胞内信号通路阻断细胞周期在G0, G1, S,或者G2-M阶段。根据我们的结果,推测TanIIA可能诱发明显的结直肠癌细胞和阻止细胞凋亡在G0 / G1期浓度的方式。此外,TanIIA调节p-p38MAPK的表达和ATF-2通过免疫印迹分析。
p38 MAPK proline-directed丝氨酸/苏氨酸激酶,它由多个细胞激活的压力,包括生长因子、脂多糖(LPS)、炎性细胞因子、紫外线,渗透压休克(9,26,27]。激活转录因子2 (ATF2)是下游P38MAPK信号。当p38是激活,p38-ATF2绑定增加,激活p38MAPK信号通路(28]。激活p38MAPK已经证明,它可以使磷酸化,激活MAPKAPK-2并使磷酸化转录因子马克斯,ATF-2, MEF2 [6,29日]。p38 MAPK在炎症愈合中起着重要的作用,组织修复,胚胎发育30.),免疫调节31日),和细胞增殖和细胞凋亡的住宿32]。一些研究报道,p38MAPK信号通路蛋白可能与细胞凋亡基因的调节(33),或在抗肿瘤药物的活动中发挥作用34]。堵塞的p38MAPK通路抑制肿瘤细胞凋亡(35]。然而,没有研究调查了角色p38MAPK在TanIIA-induced人类结直肠肿瘤细胞凋亡。
为了调查TanIIA是否通过p38MAPK信号通路诱导细胞凋亡,我们评估细胞的细胞凋亡率和细胞周期治疗后与SB203580 TSIIA通过流式细胞仪分析。p38 MAPK-SB203580的特定抑制剂。这种化学物质抑制MAPKAPK-2激活p38 MAPK和随后HSP27的磷酸化36]。在我们的研究中,我们发现后块p38MAPK信号通路、细胞的凋亡率和G0 / G1期细胞比例与TanIIA相比明显下降。当他们没有改变控制相比只有SB203580处理。
更重要的是,我们观察到,信息结逐渐消失,减少体积和karyopyknosis TanIIA浓度梯度,导致考虑是否与细胞骨架的改变有关。细胞骨架不仅起着至关重要的作用在维持细胞的形状,承受外力,并保持细胞内部结构的顺序也参与许多重要的生命活动,包括增殖和细胞凋亡。Transgelin-2 actin-binding蛋白质,参与细胞骨架的宪法。在这项研究中,我们发现Transgelin-2监管通过p38 MAPK信号由TanIIA大肠癌细胞的凋亡。
总之,我们的研究证实,TanIIA CRC的抗癌效果,诱导细胞凋亡细胞,阻止细胞G0 / G1期,我们进一步证明,这种效应可能由p38MAPK信号通路和监管Transgelin-2的表达。这些结果表明TanIIA作为潜在的抗肿瘤药物是必要的研究和发展的新前景。
缩写
| TanIIA: | Tanshinone花絮 |
| MAPK: | 增殖蛋白激酶 |
| 儿童权利公约: | 结肠直肠癌 |
| EMT: | Epithelial-to-mesenchymal过渡 |
| PI: | Propidium碘化 |
| 有限合伙人: | 脂多糖。 |
数据可用性
的数据支持本研究的发现可以从相应的作者在合理的请求。
的利益冲突
没有冲突要申报的东西。
作者的贡献
张Yingru参与写作的手稿,初稿,数据整理和调查。益阳赵导致写作和审查,Chunpu李和刘(导致了调查。瀛丰商务和沙沙村江形式分析。Xiaoting太阳和Xueqing胡锦涛导致最后的修订。王阎参与调查,监督资金,收购,和项目管理。Yingru张和赵益阳的贡献同样这项工作。
确认
这项工作得到了国家自然科学基金(82122075、82122075和82122075),上海前沿研究的基础疾病和综合征炎症癌症生物学“(2021 kj03-12),“曙光”项目由上海市教育委员会和上海教育发展基金会(21 sg43),临床研究计划SHDC (SHDC2020CR4043)和上海青年人才支持计划。