文摘

汉(春节),一种化合物中发现传统的中药,礼物肾功能的保护作用。我们的研究旨在阐明春节在足细胞损伤的有效性和潜在机制。在这项研究中,足细胞损伤是诱导大鼠阿霉素(ADR),和MPC5足细胞是由TRPC6超表达。我们发现,春节治疗蛋白尿的水平降低,血清肌酐和血尿素氮和血浆白蛋白水平增加ADR-induced老鼠。春节降低细胞内钙^{2 +}MPC5足细胞和凋亡涌入overexpressing TRPC6。春节表达下调肾TRPC6的表达、RhoA ROCK1和调节synaptopodin的表达式;与此同时,它减少了钙调磷酸酶活动在活的有机体内和在体外。总之,春节预防足突细胞影响TRPC6及其下游RhoA / ROCK1信号通路。

1。介绍

足突细胞功能起着重要的作用在肾脏疾病的发病机制。足突细胞损伤可引起细胞外基质的增加,基底膜增厚,upregulation纤维化因素,和肾功能衰竭1- - - - - -3]。足突细胞形态和功能的保护对维护健康的肾脏功能是至关重要的。

Fangji黄芪汤(FHD)的经典处方中药用于治疗肾病综合症,已经证明了它对保护的影响足突细胞(4- - - - - -6]。汉(春节)是一个方霁的主要活性成分(野生抚育FHD(中)7,8),尽管renoprotection春节的确切作用和机制尚不清楚。春节是一个非选择性Ca^{2 +}l型钙拮抗剂的块^{2 +}渠道,从而降低血压(9,10]。春节还有一个antifibrotic对肾脏的影响由于其上调表达的能力矩阵metallopeptidase 13转化生长因子激活β/ Smads信号通路,从而减少下游结缔组织生长因子表达(10]。足细胞损伤是经典的多种肾小球疾病的病理过程,导致肾脏功能障碍(11]。基于上述背景,我们推测,春节可能在肾脏疾病预防足细胞损伤。

瞬时受体电位阳离子通道6 (TRPC6)是一个著名的足突细胞缝隙隔膜组件,它与podocin和nephrin维持正常足突细胞形态和功能12- - - - - -14]。TRPC6超表达在收购和遗传肾病和与蛋白尿和肾功能受损密切相关12]。TRPC6向Ca有很大的贡献^{2 +}流入到足细胞,进一步促进activitity RhoA [15- - - - - -18]。RhoA异常激活,其下游效应器Rho-associated盘绕coil-containing蛋白质kinase1 (ROCK1)的肌动蛋白细胞骨架紊乱密切相关,收缩,足细胞的凋亡16,19- - - - - -22]。因此,抑制TRPC6表达保护足突细胞可能是一个重要方法。与此同时,我们倾向于探索春节是否通过调节TRPC6减轻足细胞损伤。

当前研究决定在体外和在活的有机体内通过评估蛋白尿疗效的春节足细胞损伤,血液肾功能指标,足突细胞形态,细胞内Ca^{2 +}涌入。同时,春节对足细胞损伤的分子机制中涉及TRPC6-mediated RhoA / ROCK1信号通路被揭露出来了。完成实验的流程图设计提出了补充图1。

2。材料和方法

2.1。动物分组和治疗

48八周旧Sprague-Dawley (SD)大鼠( )重约200克,从常州卡文购买实验动物有限公司有限公司老鼠被随机分成以下六组( 每组):对照组(正常),阿德里亚组(模型),Tet-low剂量(Tet-LD)集团Tet-medium剂量(Tet-MD)集团Tet-high剂量(Tet-HD)组和环孢霉素(CsA)组。为了获得一个理想的肾病大鼠模型在很短的时间内,我们使用单侧肾切除术结合ADR感应建立肾病模型(23,24]。每个大鼠的左肾摘除后腹腔内注射满50毫克/公斤氯胺酮麻醉的25]。在第一次手术后14天,阿德里亚所有SD大鼠,Tet-LD, Tet-MD, Tet-HD, CsA组通过尾静脉注射阿霉素(ADR)的用量4毫克/公斤体重(26]。对照组的老鼠注射同样体积的生理盐水。建模后,老鼠在Tet-LD、Tet-MD Tet-HD,和CsA组有4毫克/公斤/天春节(美国Sigma-Aldrich), 8毫克/公斤/天春节,16毫克/公斤/天春节,和30毫克/公斤/天CsA (Sigma-Aldrich)填喂法,分别。春节的剂量和CsA在这项研究中的应用是基于我们的以前的报告27]。老鼠在控制和阿德里亚组收到同样体积的蒸馏水。动物实验机构批准的动物保健和使用委员会中医医院隶属于浙江杭州中国医科大学(没有。20210927 - 25)。

2.2。检测尿蛋白、血清肌酐、血浆白蛋白、血尿素氮

收集血液样本和24小时尿后大鼠治疗12周。血液生化指标(血清肌酐、血浆白蛋白和血尿素氮)、24小时尿蛋白定量自动生化分析仪。

2.3。足突细胞形态的识别

如前所述(执行足突细胞形态学鉴定25]。简单地说,肾组织收集大鼠治疗后12周。组织用3%戊二醛和4%多聚甲醛固定在0.1 mol / L磷酸盐缓冲剂。固定后,组织与梯度脱水乙醇(50%,70%,95%,和100%)最后嵌入Durcupan树脂。足细胞在肾组织形态学决心在透射电子显微镜下(美国JEOL)。

2.4。细胞转染和治疗

为了构建一个TRPC6超表达慢病毒质粒,全长编码序列的鼠标TRPC6基因被克隆到EcoRI / BamHI限制网站使用基因合成(上海GeneChem pcDH-GFP-PURO向量。有限公司,中国)如前所述28]。TRPC6超表达质粒被打包成慢病毒(lev-TRPC6)然后转染MPC5足细胞。空白和lev-negative控制(lev-NC)使转染成MPC5足细胞被用作控制。随后,MPC5足细胞转染与lev-TRPC6处理10μM U73122 (TRPC6通道开放)的抑制剂28为10分钟),2μM CsA 48 h, 40岁μM春节48 h。细胞培养在37°C公司为5%₂。春节的药物浓度和CsA MPC5足细胞治疗依赖于CCK-8试验在我们之前的研究27]。

2.5。中存在

MPC5足细胞和肾组织收集到的老鼠,和RNA提取试剂盒(试剂盒)如前所述28]。ROCK1 TRPC6, RhoA, synaptopodin检测使用之前报道引物(28]。

2.6。免疫印迹分析

总蛋白提取MPC5足细胞和大鼠肾组织。足够的细胞裂解,里帕裂解缓冲(Beyotime,中国)补充道,然后,上层清液提取后离心10分钟的12000 rpm。蛋白质样本有10% sds - page分离和转移到PVDF膜。膜被封锁与脱脂奶粉,然后孵化主要抗体anti-TRPC6 (1: 1000;美国圣克鲁斯)、RhoA (1: 1000;Proteintech,武汉,中国),ROCK1 (1: 3000;Proteintech), synaptopodin (1: 1000;Santa Cruz), GAPDH (1: 10000;英国Abcam)。膜被孵化与驴anti-mouse免疫球蛋白(H + L; Jackson ImmunoResearch Laboratories, USA) secondary antibody. ECL system (Sharebio, China) was used for band detection and protein bands were analyzed by the Tanon Image software (Tanon, China).

2.7。细胞内钙^{2 +}分析

Ca^{2 +}如前所述(执行涌入化验29日]。检测细胞内钙水平的^{2 +}10,MPC5足细胞孵化μM Fluo-3AM (Donjindo实验室、日本)在37°C为30分钟,用PBS三次,和孵化10μM Fluo-3AM 10分钟前荧光检测。Ca^{2 +}相关凋亡的评估是通过共焦成像和分析了蔡司共焦成像系统(美国蔡司)。

2.8。钙调磷酸酶(可以)活性测定

可以活动测量MPC5足细胞和肾组织使用一个可以活动的装备(南京建成生物技术,中国)后,制造商的协议。

2.9。流式细胞术

与300年MPC5足细胞涨跌互现μL绑定缓冲,然后贴上AnnexinV-FITC /π(美国BD生物科学)。流式细胞术(BD生物科学)是用于分析细胞凋亡率(如前所述)(28]。

2.10。统计分析

所有的数据显示为 。SPSS和GraphPad棱镜6用于单向方差分析的统计分析。阈值的显著差异 所有的测试。

3所示。结果

3.1。汉复苏与肾病大鼠的肾脏功能

肾病大鼠模型(ADRIA)建立了ADR感应,和模型大鼠服用不同剂量的春节。蛋白尿、血清肌酐、血浆白蛋白、血尿素氮足细胞损伤的重要指标。模型大鼠表现出肾功能受损,增加尿蛋白、血清肌酐、血尿素氮,以及降低血浆白蛋白与compard控制大鼠( )(图1(一))。与中期和高剂量治疗后春节或CsA(积极的药物),阿德里亚大鼠尿蛋白的水平显著降低,血清肌酐和血尿素氮和血浆白蛋白水平增加( )(图1(一))。

3.2。汉改善足细胞损伤大鼠肾病

调查春节是否能改善足细胞损伤,我们从大鼠足细胞的超微结构发现孤立的电子显微镜。广泛的足细胞融合过程(80 - 100%)在肾组织中发现的阿德里亚老鼠组相比,在控制老鼠。融合过程中大大减少足细胞提取ADRIA老鼠对待春节或CsA。高剂量春节或CsA治疗显示更明显的效果(30 - 40%),其次是中等剂量组(50 - 60%),然后低剂量组(70 - 80%)(图1 (b))。

3.3。汉会使肾TRPC6的表达,ROCK1, RhoA和移植在ADR-Induced Synaptopodin肾病大鼠的水平

瞬时受体电位通道,TRPC6在足细胞和足细胞的调节损伤(30.]。mRNA和蛋白表达TRPC6在阿德里亚显著增加大鼠相比,在控制大鼠( )(数据2(一个)和2 (b))。春节(中等或高剂量)或治疗CsA的表达减少TRPC6在老鼠阿德里亚( )(数据2(一个)和2 (b))。此外,synaptopodin,足细胞的成熟的标志,是密切相关的肉瘤和足突细胞特异表达表型和限制TRPC6足细胞表面表达(31日]。ADRIA小鼠表现出明显减少的mRNA和蛋白表达synaptopodin相比,控制大鼠( )(数据2(一个)和2 (b))。阿德里亚synaptopodin增加大鼠的水平中等或高剂量的春节或治疗CsA ( )(数据2(一个)和2 (b))。此外,据报道,TRPC6可以激活RhoA / ROCK1信号,从而导致足细胞损伤(28]。如数据所示2(一个)和2 (b),RhoA和ROCK1表情高架ADRIA老鼠相比,在控制老鼠,而春节(中等或高剂量)或治疗CsA的水平降低RhoA和ROCK1 ADRIA老鼠( )。

3.4。汉减轻了足细胞损伤和细胞内钙^{2 +}通过堵塞涌入TRPC6-Mediated RhoA / ROCK1通路

进一步解释春节是否对足细胞损伤的保护作用,当时TRPC6 MPC5足细胞中过表达对待U73122 TRPC6通道开放(抑制剂),CsA,或者春节。RT-qPCR和免疫印迹显示TRPC6过度TRPC6的表达增加,RhoA, ROCK1和减少MPC5 synaptopodin水平足细胞相比lev-NC ( )(数据3(一个)和3 (b))。然而,治疗U73122、CsA或春节表达下调的表达TRPC6, RhoA, ROCK1和调节MPC5 synaptopodin水平足细胞转染lev-TRPC6 ( )(数据3(一个)和3 (b))。

此外,钙^{2 +}据报道在足细胞信号导致蛋白尿和足细胞损伤(32]。细胞内钙^{2 +}涌入MPC5足细胞与TRPC6超表达显著高于lev-NC集团( )(图4(一))。管理U73122, CsA,春节显著抑制细胞内钙^{2 +}涌入MPC5足细胞转染lev-TRPC6 ( )(图4(一))。此外,我们发现可以活动明显高于阿德里亚比控制老鼠,老鼠被高剂量抑制春节(16毫克/公斤/天)或治疗CsA ( )(图4 (b))。与此同时,可以活动与TRPC6 MPC5足细胞进行靶向治疗明显高于lev-NC组,减少U73122治疗,CsA,或者春节( )(图4 (c))。

3.5。汉抑制的足突细胞通过堵塞Apopotosis TRPC6-Mediated RhoA / ROCK1通路

足细胞凋亡是一个关键机制,导致蛋白尿在各种慢性肾脏疾病(33]。流式细胞仪显示TRPC6过度增加MPC5足细胞的凋亡比例与lev-NC相比( )(图5)。U73122、CsA、春节治疗显著降低了TRPC6 overexpression-mediated足细胞凋亡的增加( )(图5)。

4所示。讨论

汉(春节)是一种从中医草药bisbenzylisoquinoline生物碱野生抚育,拥有有前途的抗癌、抗炎和antiproteinuric属性(27,34,35]。足细胞损伤是proteinuric肾脏疾病的主要病理特征,和潜在的治疗靶点的识别对减轻足细胞损伤临床重要性36]。在这里,一个肾病大鼠模型(ADRIA)建立了单侧肾切除术结合ADR感应来确定春节在足细胞损伤的治疗效果。蛋白尿、血清肌酐和血尿素氮升高,血浆白蛋白减少的主要临床特征是podecyte损伤(37),在阿德里亚老鼠展出。我们的研究发现,春节治疗unrine蛋白质的水平降低,血清肌酐、血尿素氮和增加了阿德里亚的大鼠血浆白蛋白水平,确认春节在足细胞损伤的治疗效果。此外,透射电子显微镜显示,足突细胞融合提高ADRIA大鼠肾组织,由春节减轻治疗。

TRPC6已成为一个重要的目标podocyte-associated肾病的治疗(12]。TRPC6表达的增加会导致足细胞损伤(38]。我们的研究显示,春节对足细胞损伤有保护作用通过抑制TRPC6超表达。ADR-induced肾病大鼠呈现TRPC6表达的增加和广泛的足细胞的融合过程,伴随着大量的蛋白尿和肾功能障碍。此外,足细胞overexpressing TRPC6胞内钙浓度增加^{2 +}和细胞凋亡。这些恶性特征ADRIA足细胞损伤的老鼠被春节减毒治疗。

此外,我们发现RhoA / ROCK1和表达的增加可以活动ADRIA老鼠和TRPC6中足细胞受到春节的逆转。激活RhoA Ca^{2 +}依赖和被治疗BAPTA-AM,一种Ca^{2 +}螯合剂(20.]。TRPC6过度增加Ca^{2 +}流入,进一步影响RhoA激活,从而激活RhoA / ROCK1信号通路。RhoA / ROCK1通路密切相关复合足细胞的微管和肌动蛋白丝。异常激活RhoA / ROCK1可能诱导肌动蛋白细胞骨架的障碍,收缩,足细胞的凋亡16,19- - - - - -22]。可以是另一个由Ca effctor激活^{2 +}涌入引起TRPC6 [12]。这是一个Ca^{2 +}端依赖磷酸酶导致synotopodin脱磷酸作用和激活核转录因子的激活T细胞(NFAT),这是足细胞损伤和肾脏疾病密切相关39]。Synaptopodin作为actin-binding蛋白质,维持细胞骨架的足细胞过程中起着重要作用[40,41]。

CsA,著名的钙调磷酸酶抑制剂,广泛用于治疗肾病综合症。先前的研究表明,CsA的肾保护作用与免疫调节NFAT的激活有关。最近的研究表明,CsA也直接作用于足细胞通过抑制synaptopodin的去磷酸化和退化和减少可以活动31日,41]。在我们的研究中,春节抑制可以增加活动引起的ADR在活的有机体内和lev-TRPC6在体外。

根据上面的数据,我们推测,春节可能保护足细胞的影响表达TRPC6-mediated RhoA / ROCK1信号通路。我们的研究表明,春节可以改善足细胞损伤的治疗效果。

5。结论

我们的研究证实,春节对足细胞有保护作用。不同于CsA,春节可能保护足细胞主要是通过影响TRPC6-mediated RhoA / ROCK1信号通路。应该进行进一步的研究来确定这些药物协同工作或有任何副作用和复发率。

数据可用性

的数据支持本研究的发现可以从相应的作者在合理的请求。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

确认

我们感谢红玉陈医生有用的评论的手稿。这项工作得到了杭州农业和社会发展研究项目)(批准号2019120 b136)和浙江医疗卫生技术项目(批准号2017 ky549)。

补充材料

数字S1:完成实验设计的流程图。(补充材料)