文摘
目的。YAP信号通路的改变和涉及致癌人类乳腺癌症。然而,角色的狂吠声信号调控乳腺肿瘤血管生成有仍然难以捉摸。肿瘤血管生成是协调的肿瘤细胞和血管内皮细胞的激活。YAP信号通路是否可以调节癌症细胞和内皮细胞之间的细胞间相互作用本质上是未知的。方法。YAP在肿瘤血管生成的影响,移民和扩散的血管内皮细胞在体外进行评估。表达的蛋白质磷酸化的蛋白质参与狂吠,G13-RhoA, PI3K / Akt信号通路是评估使用西方墨点法,免疫荧光染色和免疫组织化学分析。此外,YAP对乳腺癌的影响血管生成被肿瘤异种移植小鼠体内评价。结果。我们这里显示的媒体从YAP乳腺癌细胞过表达(CM-YAP +)可以促进血管生成,伴随着增加管形成,移民,和人类脐静脉内皮细胞的增殖(HUVECs)。下降的监管YAP HUVECs逆转CM-YAP +诱导血管生成。CM-YAP +时间激活YAP HUVECs通过脱去磷酸YAP和增加核易位。我们还发现,G13-RhoA和PI3K / Akt信号通路是必要CM-YAP +诱导激活狂吠。此外,结缔组织生长因子(CTGF)和angiopoietin-2 (ANG-2)作为加YAP HUVECs促进血管生成。此外,裸小鼠皮下肿瘤模型表明,肿瘤中YAP透露更多的新血管形成体内。结论。对乳腺癌细胞和内皮细胞之间的相互作用可以促进肿瘤血管生成,支持,YAP是一个潜在的标志和目标对乳腺癌发展新的治疗策略。
1。介绍
尽管取得了巨大进步在乳腺癌的治疗在过去的十年里,转移性肿瘤患者的预后仍然很差(1]。由于肿瘤血管生成是一个关键的过程在癌症的转移和发展,这是至关重要的调查乳腺癌肿瘤相关的血管生成的机制。
Yes-associated蛋白质(笨蛋),负受Hippo-pathway激酶,最初确定的功能器官发展随后被证明参与肿瘤发生[2]。Hippo-YAP途径改变,涉及致癌在多种人类癌症,包括人类乳腺癌[3]。先前的研究已经集中在直接影响乳腺癌细胞的狂吠,比如癌症细胞增殖,迁移和入侵。(3]。然而,效果和机制proangiogenic YAP在乳腺癌的效果仍不完全理解4]。
事实上,YAP激活癌细胞之前一直显示促进血管生成在胆管癌和胰腺导管腺癌通过直接调节分泌细胞因子(5- - - - - -8)增强扩散、迁移、入侵和管内皮细胞的形成。在乳腺癌中,YAP参与维护癌相关成纤维细胞的表型和肿瘤促进功能(保护),最终鼓励肿瘤血管生成,也被提到[9]。
肿瘤血管生成是由静止和动态协调激活内皮细胞(ECs)为了应对multiple-growth由肿瘤细胞分泌的因子和炎性细胞因子,间充质细胞,或/和ECs (10,11]。激活的内皮细胞,如增殖,迁移,入侵,管形成血管再生的特点。先前的研究表明河马/ YAP信号调节EC生存是至关重要的,扩散和迁移12,13]。激活激活VE-cadherin造成的狂吠,PI3K / Akt信号,actin-binding蛋白质EPS8导致管网络的形成(10,14]。
考虑的重要性YAP激活肿瘤细胞和内皮细胞可以调节血管生成,预计对bc之间的交互和ECs可能发挥重要作用在肿瘤相关的血管生成调节电子商务功能。这里,我们首次展示YAP超表达在乳腺癌细胞可以激活YAP ECs。因此,YAP激活导致ECs的迁移和管式网络的形成,这可能促进血管生成。
2。材料和方法
2.1。试剂
下面的抑制剂或试剂被用于这项研究:LY294002(美国恩佐生命科学),mk - 2206(美国表达载体),C3胞外酶(细胞骨架、美国),和百日咳毒素(PTX;英杰公司、美国)。YAP和phospho-YAP (Ser127)购买的细胞信号(细胞信号技术,美国)。CTGF、ANG-2 GAPDH抗体来自圣克鲁斯生物技术(圣克鲁斯,美国)。美国Alexafluor二级抗体来自生活的技术。
2.2。细胞系和文化
mda - mb - 231细胞和人类脐静脉内皮细胞从中国获得(通过传代形成细胞类型文化中心集合(CCTCC,中国)。细胞系都保持在湿润的气氛中在37°C公司为5%2。mda - mb - 231细胞在DMEM / F12和HUVECs培养(美国GIBCO)的边后卫(美国GIBCO)和100年的15%μg / mL青霉素和链霉素(P / S)。血清饥饿,细胞培养生长培养基中没有的边后卫和抗生素。
2.3。质粒和RNA转染
建立稳定的细胞与不同YAP表达式,6-well盘子被播种 cell /在转染前2毫升媒体24小时;细胞汇合的80% - -90%。细胞转染与YAP CRISPR / Cas9 KO质粒和YAP CRISPR激活质粒用UltraCruz®转染试剂(美国圣克鲁斯)根据制造商的指示。转染48小时后,选择稳定的细胞嘌呤霉素。对慢病毒粒子转导,聚凝胺®(美国圣克鲁斯)试剂用于逆转录病毒载体引入HUVECs根据制造商的指示。CRISPR质粒和shRNA慢病毒粒子都是购自圣克鲁斯生物技术(圣克鲁斯,美国)。
2.4。条件培养基的制备
mda - mb - 231细胞与不同YAP表达融合性的培养达到80% -85%。原始的介质和细胞被PBS洗了三次。然后,mda - mb - 231细胞培养的边后卫和P / S DMEM自由。24小时后,上层清液是收集并贴上YAP中也是中等(CM-YAP +), YAP击倒介质(CM-YAP -),和控制介质(CM-Ctrl)用于未来的研究。
2.5。免疫印迹
免疫印迹分析进行了使用标准程序,并使用初级抗体和荧光蛋白质检测二次抗体(IRDye800CW-conjugated或IRDye680-conjugated antispecies免疫球蛋白)(美国LI-COR生物科学)。荧光信号被捕获在一个奥德赛红外成像系统(美国LI-COR生物科学)和700 - 800 nm频道。盒子是手工放置在每个感兴趣的乐队,和原始的软件返回的近红外荧光值强度与背景减法(奥德赛3.0分析软件,LI-COR生物科学,美国)。
2.6。管形成分析
60 -μl人工基底膜基质(美国康宁公司)被转移到一个96孔板,然后在37°C孵化器孵化了30分钟。HUVECs ( 细胞/)被播种在基底膜基质矩阵与不同条件培养液(CM),在37°C和孵化12小时。管状结构拍摄下打印大师Retiga 2000 r相机(萨里,加拿大)100倍放大,和管总长度和总分支长度从6代表领域每组J软件分析图像。
2.7。平板克隆形成实验
HUVECs消化和300个细胞的每一组被播种到6-well盘子。24小时后,附着细胞条件培养基和培养基培养每天都改变了。细胞培养时表现为2 - 3周宏观隆起中发现了盘子。细胞被洗和固定20%甲醇,持续15分钟。然后,固定细胞被染色和染色40分钟的解决方案。克隆拍摄并使用图像J软件计算。克隆形成率 。
2.8。定量实时聚合酶链反应
转染后48小时,细胞被洗冷PBS和收集的试剂盒RLT裂解缓冲(美国试剂盒)。RNA提取的RNeasy迷你包(美国试剂盒)和反向转录M-MLV逆转录酶。定量实时PCR进行光周期计480(美国罗氏)SYBR绿色我主人混合(美国罗氏公司)。信使rna丰富GAPDH规范化。消极的控制中不含成绩单或逆转录酶。RNA从三个独立的细胞颗粒预处理进行了分析。相对基因表达是计算方法在应用生物系统公司用户公告2号。(P / N 4303859 b),不属预定目标的RNA-treated细胞作为控制在每一个数据集。引物对用于本研究如下:GAPDH: F, 5 - - - - - -GAAGGTGAAGGTCGGAGT-3/ R, 5 - - - - - -GAAGATGGTGATGGGATTTC-3 ;CTGF: F, 5 -CTAAGACCTGTGGAATGGGC-3 / R, 5“-CTCAAAGATGTCATTGTCCCC-3”;ANG-2: F, 5 -ATCTTCCTCCAGCCCCTACAT-3 / R, 5 ' -GCTTCCACATCAGTCAGTTTCC-3 。
2.9。免疫荧光染色
HUVECs被播种在室幻灯片。治疗后,细胞被固定为4% paraformaldehyde-PBS 15分钟。阻塞后5%山羊血清0.3% Triton x - 100在PBS 60分钟,细胞被孵化YAP主要抗体(1:100稀释)一夜之间在4°C。与PBS三洗后,细胞被孵化与Alexa萤石488或555共轭二次抗体(1:500稀释,英杰公司、美国)在室温下2小时。幻灯片洗了三次,然后安装。免疫荧光检测使用打印大师Retiga 2000 r相机(萨里,加拿大)40×放大。
2.10。细胞迁移实验
迁移进行了分析使用Transwell板块和8μ米孔径膜(美国康宁公司)。孵化后12小时,剩余细胞上的过滤器和棉签被移除。下表面上的细胞连接固定和染色用结晶紫和用水洗。细胞数与五个大功率领域/膜,结果平均数量的细胞迁移/场/膜。所有实验进行了一式三份。
2.11。肿瘤异种移植实验
所有机构批准的体内实验研究委员会XXX (2020 - 45)。所有小鼠获得人道关怀符合指南发表的实验动物保健和使用由美国国立卫生研究院。mda - mb - 231细胞( )混合在一个1:1 (v: v)比例与生长因子减少人工基底膜(美国BD生物科学)和混合皮下注入左(控制癌症细胞)和右(YAP过度癌细胞)侧翼的6 - 7-week-old BALB / cν/ν裸体小鼠。老鼠被颈椎错位40天牺牲了。植入肿瘤提取和体积(以毫米3)确定使用卡尺和使用修改后的椭圆公式计算: 。
2.12。免疫组织化学(包含IHC)分析
的formalin-fixed石蜡包埋部分(5μ米厚)的肿瘤组织进行了分析包含IHC使用主狂吠或CD31抗体(1:100)和biotin-conjugated二级抗体。四个随机选择的区域拍摄40×放大使用打印大师Retiga 2000 r相机(萨里,加拿大)。分析了图像使用Image-Pro +图像分析软件(美国媒体控制论)。
2.13。统计分析
学生的 - - - - - -测试是用来评估统计学意义的两种治疗方法的区别。两组之间的肿瘤体积和CD31阳性细胞被配对分析t以及。一个值小于0.05被认为是显著的。
3所示。结果
3.1。超表达狂吠的乳腺癌细胞促进血管生成
虽然YAP以前显示调节血管生成在其他肿瘤5,6),尚不确定是否YAP在调节血管生成的作用在人类乳腺癌。地址是否YAP乳腺癌细胞中表达(BCs)对血管生成的影响,我们建立了狂吠,抑制mda - mb - 231细胞(图1(一))。人类脐静脉内皮细胞培养条件媒体(通过传代形成细胞(CM)从BCs不同表达式的狂吠。如图1 (b),管总长度和总分支长度增加在CM YAP过度mda - mb - 231细胞(CM-YAP +)。因为涉及到内皮细胞迁移在血管生成15],我们分析了狂吠的影响表现在BCs HUVECs迁移。结果,CM-YAP +显著提升HUVECs迁移(图1 (c))。此外,扩散HUVECs增加培养时CM-YAP +(图1 (d))。
(一)
(b)
(c)
(d)
3.2。YAP表达HUVECs参与调停CM-YAP +诱导血管生成
Hippo-YAP信号已成为一个关键通路调节内皮细胞的激活被认为是重要贡献肿瘤相关血管生成(10,13,16- - - - - -17]。因此,我们测试了是否YAP HUVECs介导CM-YAP +诱导血管生成。YAP HUVECs表达水平是有效地抑制使用成分(图2(一个))。CM-YAP +诱导形成capillary-like结构和封闭的循环(图2 (b)),以及迁移(图2 (c)(图)和扩散2 (d))HUVECs明显减少YAP混战,支持的功能角色YAP HUVECs CM-YAP +引起的血管生成。
(一)
(b)
(c)
(d)
3.3。CM-YAP +会引发(dpYAP)脱磷酸化和核易位HUVECs狂吠
我们进一步测试条件是否媒体(CM)与不同表达式的BCs YAP YAP脱磷酸化的影响(dpYAP)在HUVECs ser127。如图3(一个)CM-YAP +诱导dpYAP时间的方式在不影响总狂吠的表达式。与此同时,CM-YAP +诱导YAP核易位HUVECs(数字3 (b)和3 (c))。
(一)
(b)
(c)
3.4。CM-YAP +诱导dpYAP HUVECs G13-RhoA和PI3K / Akt依赖
YAP激活内皮细胞是通过G protein-RhoA监管,和/或PI3K / Akt通路(10,18]。选择性药理抑制剂、竞争抑制剂结合可逆的激酶结构域蛋白质而不影响其表达(19- - - - - -21),和试剂用于解剖的信号通路导致CM-YAP +诱导YAP激活。CM-YAP +诱导dpYAP完全废除了ρC3转移酶抑制剂,以及由PI3K抑制剂LY294002和Akt抑制剂mk - 2206年HUVECs(图4(一))。百日咳毒素(PTX,特定抑制剂的Gi蛋白质)和G的shRNA慢病毒颗粒蛋白被用来确定哪些三聚物的(大)和小G蛋白参与。CM-YAP +诱导dpYAP对PTX(图4(一)),这表明胃肠道蛋白质没有涉及。结果细胞转染不同shRNA慢病毒颗粒的G蛋白质表明,G13和RhoA CM-YAP +诱导dpYAP(图的必要条件4 (b))。
(一)
(b)
3.5。结缔组织生长因子和HUVECs YAP加Angiopoietin-2充当促进血管生成
由于结缔组织生长因子(CTGF)和angiopoietin-2 (ANG-2),自分泌调节血管生成的因素,被证明是笨蛋加(10,22,23]。我们测试的影响CM-YAP + CTGF的表达和HUVECs ANG-2。如数据所示5(一个)和5 (b)信使rna和蛋白质水平的CTGF和ANG-2 CM-YAP +和处理时显著增加可能会抵消这些影响YAP核。此外,转录抑制CTGF和ANG-2 siRNA显著抑制CM-YAP +诱导血管生成(图5 (c)),展示CTGF的关键作用,在血管生成ANG-2 YAP目标。
(一)
(b)
(c)
3.6。YAP超表达的乳腺癌细胞促进体内血管生成
调查的体内功能YAP在血管生成,我们生成的皮下肿瘤在BALB / cν/ν裸体小鼠使用mda - mb - 231细胞与不同YAP表达式。肿瘤启动后的40天,肿瘤被删除,YAP表达式包含IHC(图证实了6(一))。宏观上,肿瘤高YAP表达式没有统计学意义(图略大于控制6 (b))。然而,包含IHC显示,YAP CD31阳性细胞的数量较低的超表达肿瘤明显高于YAP表达式(图6 (c))。这一结果初步表明,过度的狂吠乳腺癌细胞可以促进体内血管生成。
(一)
(b)
(c)
4所示。讨论
血管生成在肿瘤的发展都是至关重要的。在乳腺癌中,血管生成在肿瘤的发展和转移的重要性也建立了(24]。大量研究表明许多血管生成活化剂和途径参与乳腺癌的发展。此外,抗血管新生药物的使用显示了潜在的治疗乳腺癌的治疗效果。然而,使用这些药物的临床显著的好处并没有证实为乳腺癌的异质性的原因(18]。换句话说,全面、系统地了解乳腺癌癌症相关的血管生成的机制有助于发现新的生物标记物用于治疗乳腺癌。在此,我们建立了新的血管生成信号通路的超表达在乳腺癌细胞激活YAP YAP内皮细胞导致迁移和管形成通过G13/ RhoA和VE-cadherin / PI3K / Akt途径。
狂吠,转录辅活化因子,通常成为一个致癌因子通过调节多个目标基因在乳腺癌,导致癌细胞扩散和转移3,25]。然而,更少的研究表明血管生成的角色YAP乳腺癌直到最近表明,YAP时被激活在乳腺癌症相关成纤维细胞的表型和维护战乱国家促进血管生成(9][26,27]。在本研究中,我们确定了直接YAP激活诱导乳腺癌癌症相关的血管生成的作用。事实上,许多目标基因YAP已经证明通过激活ECs参与癌症相关的血管生成,尤其是细胞因子如CTGF、cyr61, MFAP5, angiopoietin-2,可能由肿瘤细胞分泌的10,28,29日,5,30.]。在内皮细胞,这些细胞因子可以刺激多个信号通路影响静止的动力学和激活内皮细胞。
血管生成是由ECs之间的动态联系和连接。最近研究,VE-cadherin-dependent YAP激活是证明细胞连接和血管生成活性的动态调整ECs体外和体内10,14]。考虑到proangiogenic狂吠的属性激活肿瘤细胞和内皮细胞,预计YAP激活在BCs将激活YAP ECs促进癌症相关的血管生成。最后,这一假设在本研究中得到证实。ECs YAP激活是受机械应力和/或G-protein-coupled受体信号(13,17,31日]。我们的研究结果显示,机械应力和G-protein-coupled受体信号参与YAP激活在ECs条件处理媒体BCs过度狂吠。除此之外,我们还发现,CTGF和angiopoietin-2 YAP加在ECs促进血管生成,按照先前的研究[10,32]。
虽然对激活乳房癌症相关的血管生成的重要作用已经被识别,细胞间信号分子BCs和ECs之间导致ECs YAP激活尚未定义。先前的研究证明,YAP互联与多个信号通路由可溶性生长因子、转化生长因子等(TGF -β),骨形成蛋白(bmp),刺猬(Hh)和表皮生长因子受体通路(33]。最有趣的是,TGF -β信号通路可以调节YAP激活(34,35]。与此同时,TGF -β信号也可以被激活(YAP监管36,37]。此外,interleukin-mediated gp130信号可以诱导激活狂吠,和增加YAP活动可以通过转录上调gp130信号机制,导致一个放大循环(38,39]。我们先前的研究发现,YAP激活可以提高细胞外表达amphiregulin(沙土荒漠)[2),激活表皮生长因子受体(EGFR)信号通路。表皮生长因子受体信号也可以调节YAP活化,促进细胞增殖和迁移。因此,我们测试了水平的变化及与沙土荒漠条件培养基从乳腺癌不同YAP表达式。结果表明,沙土荒漠的水平明显高于在YAP +厘米,但鉴定及没有(补充图3)。我们相信,越来越多的细胞因子参与了这一过程,这需要进一步的研究。
总之,尽管YAP激活已被证明作为一个关键乳腺癌致癌物质在推动增长,入侵和转移(40],公元前YAP通路的血管生成作用本质上是未知的。当前的研究不仅代表的第一个示范YAP信号促进血管生成BC还透露一个创新方面的信号。YAP超表达在公元前细胞可以激活ECs YAP信号,因此促进肿瘤血管生成通过G13-RhoA和PI3K / Akt信号通路。加CTGF和ANG-2 YAP效应调节肿瘤血管生成的ECs(图7)。
数据可用性
作者确认数据支持本研究的发现可用的文章。
的利益冲突
作者没有利益冲突的声明。
确认
这项研究得到了国家自然科学基金的资助中国(没有。81502295)和国际科技合作与交流项目的陕西(2015 kw - 052)。一个预印本曾发表(41]。
补充材料
补充图1:原始的照片YAP污点在乳腺癌与蛋白质标记大小。补充图2:原始图片的shrna转染结果图4。补充图3:表达及(a)和沙土荒漠(b)在乳腺癌细胞上清液与不同YAP表达式。(补充材料)