文摘

口腔癌(OC),最常见的癌症在头部和颈部,预后不良,增生的组织病理学遵循逐步模式,发育不良,和癌症。阻塞OC在癌前期阶段的发展可以极大地提高生存和治愈率。AKT蛋白起着至关重要的作用在癌症细胞的信号转导,我们发现AKT在人类中OC TCGA样品通过分析数据库。因此,本研究旨在调查chemopreventive效应的一种蛋白激酶抑制剂(MK2206 2盐酸)OC。在活的有机体内,我们建立了一个4-nitroquinoline-1-oxide - (4 nqo)诱导小鼠舌癌形成模型探讨潜在chemopreventive MK2206 2盐酸对老鼠的影响OC造成4 nqo。结果表明,MK2206 2盐酸可以显著降低OC的发病率和经济增长,抑制异生癌症的变换在4 nqo-induced鼠标舌头致癌作用模型,同时显著抑制细胞增殖,血管增生,肥大细胞(MC)渗透在4 nqo-induced鼠标舌癌。在体外,我们的研究结果显示,盐酸MK2206 2也可以抑制口腔鳞状细胞癌(OSCC)细胞恶性生物学行为,包括细胞增殖、集落形成,细胞入侵和迁移,促进细胞凋亡。机械的研究显示,MK2206 2 hcl抑制基质金属蛋白酶9 (MMP-9)和RhoC表达式和促进自噬基因LC3 II表达式。总之,我们的研究结果证明了chemopreventive MK2206 2盐酸对4 nqo-induced鼠标舌头致癌作用模型,它可能有一个潜在的机制由MMP-9 / RhoC信号通路和自噬。

1。介绍

口腔癌(OC),第六届全球最常见的恶性肿瘤的发病率在2020年377713例新诊断病例和177757例死亡(1,2),是主要的公共卫生问题之一。口腔鳞状细胞癌(OSCC)占90%以上的OC,通常开发从口腔白斑等癌前病变和erythroplakia [3]。其组织病理学遵循渐进模式的增生,发育不良,和癌症4]。临床上,尽管手术的进步,放疗和化疗,OSCC患者的五年存活率只有大约50% (5,6]。值得注意的是,化学预防是一个方法来防止,慢下来,或逆转癌症发展的早期阶段的过程,从而减少癌症的发病率和死亡率。因此,它是非常重要的制定OC化学预防策略。

AKT(蛋白激酶B), PI3K / AKT信号轴的关键因素,作用于调控生存、增长和转移的肿瘤细胞(7]。研究表明,过度激活的一种蛋白激酶是一种常见的人类恶性肿瘤的分子特性(8),在大约40%的乳腺癌、卵巢癌、OC,胰腺癌和超过50%的前列腺癌(9,10]。此外,AKT的超表达也与细胞耐药(11,12),癌细胞的分化程度(13),和患者生存率11,14,15]。因此,我们的研究目的是探索chemopreventive AKT抑制剂对OSCC的影响。

MK2206 2 hcl是口服变构AKT抑制剂(16]。在临床前模型中,盐酸MK2206 2增强的活动分子靶向药物(抗拉帕替尼和埃罗替尼)和常规化疗药物(多烯紫杉醇,卡铂、阿霉素和吉西他滨)在乳腺癌、肺癌、卵巢癌、肝癌细胞系(16,17]。尽管MK2206 2盐酸对晚期实体肿瘤患者抗肿瘤活性,其副作用主要是疲劳,三年级皮疹,1 - 2年级恶心和呕吐,嗜中性白血球减少症(18- - - - - -20.),这限制了MK2206 2盐酸在癌症治疗上的应用。然而,没有报道chemopreventive MK2206 2盐酸对癌症的癌前阶段。

4-Nitroquinoline 1-oxide (4 nqo),合成水溶性的致癌物,能诱导肿瘤主要发生在舌(21]。在这项研究中,4 nqo-induced鼠标舌头致癌模型成立调查chemopreventive MK2206 2 hcl OC的效果。我们也探讨了抑制MK2206 2盐酸对OSCC细胞株的影响在体外。机械的研究也进一步深入研究底层机制。

2。材料和方法

2.1。细胞培养

的CAL27 OSCC细胞线被武汉大学提供作为礼物。SCC25细胞从美国购买类型文化集合(写明ATCC马纳萨斯,弗吉尼亚州)。所有在杜尔贝科修改鹰的培养基培养细胞(DMEM /高葡萄糖、Gibco大岛,纽约)补充10%胎牛血清(的边后卫,Gibco), 100年μg / mL链霉素和100 U /毫升青霉素和孵化37°C公司为5%2。

2.2。实时聚合酶链反应

从细胞总RNA提取使用试剂盒(ComWin生物技术有限公司、北京、中国)。互补脱氧核糖核酸合成的逆转录工具包(ComWin)。rt - pcr分析,基因表达与1执行μL (cDNA, SYBR混合物(ComWin)。rt - pcr结果表达的2- - - - - -ΔΔCt方法。特定的引物集如下:MMP-9(向前,5 - - - - - -3 TGTACCGCTATGGTTACACTCG;相反,5 - - - - - -3 GGCAGGGACAGTTGCTTCT)、RhoC(向前,5 - - - - - -3 GGAGGTCTACGTCCCTACTGT;相反,5 - - - - - -3 CGCAGTCGATCATAGTCTTCC)和GAPDH(向前,5 - - - - - -3 CATGGGTGTGAACCATGAGAAGTAT;相反,5 - - - - - -3 GACTGTGGTCATGAGTCCTTCCA)。

2.3。西方墨点法

细胞被里帕缓冲细胞溶解。随后,蛋白质是量化和变性。西方墨点法是根据标准协议执行。蛋白质样品(25μg / sds - page)分离10% (Bio-Rad大力神,CA)和electroblotted PVDF膜(Bio-Rad),然后封锁与5%脱脂奶和孵化主要抗体(ab32505 anti-AKT, 1: 5000年,Abcam,剑桥,马;anti-phospho-AKT (S473), 1: 5000年,ab81283, Abcam;anti-MMP-9 1: 1000年,ab137867 Abcam;anti-RhoC 1: 1000年,ab180785 Abcam;中科anti-p-Rb, 1: 1000年,9307年代;anti-p21 1: 1000年,10355 - 1 - ap, Proteintech,芝加哥,;anti-LC3 1: 1000年,A7198 ABclonal,武汉,中国;M121107 anti-GAPDH, 1: 2500年,HuaAn生物技术,杭州,中国)。蛋白质的乐队是用一个化学发光(ECL)试剂(Bio-Rad)。

2.4。扩散分析

OSCC细胞(6000 /)被播种在96 -孔板,和盐酸MK2206 2 (2、4、6、8、10μ米)添加(Selleck化学品,休斯顿,德克萨斯州)。治疗后2 MK2206 hcl 24 h, 48 h,和72 h, MTT (Sigma-Aldrich、圣路易斯、钼)解决方案(5毫克/毫升,20μL)添加到细胞和培养在37°C, 5%的公司24 h。最后,紫水晶被治疗200年解散μL DMSO(σ)。反应物的吸光度被记录在490 nm使用标(分子器件、桑尼维尔CA)。

2.5。集落形成实验

治疗后2 MK2206盐酸(6μ米和10μ米)24 h, OSCC细胞被播种在60毫米直径板块(500 /板)。培养12天后,甲醇被用来修复10分钟的殖民地,和结晶紫染色的解决方案(Beyotime、厦门、中国)被用来染色30分钟的殖民地。

2.6。细胞迁移试验

细胞被镀成6-well盘子。这时,一个200μL吸管直接被用于制造伤口,和细胞碎片被PBS移除。最后,MK2206 2盐酸(2μ米,6μ10 M,μ米)添加到细胞。获得的照片(0)在显微镜下24小时和48小时(奥林巴斯、IX71、东京、日本)。测量划痕区域是我们的方法来评估迁移率。

2.7。Transwell入侵检测

首先,细胞治疗MK2206 2盐酸(2μ米,6μ10 M,μ米)24 h。Transwell入侵检测,人工基底膜(纽约康宁)加载Transwell膜(8μ米孔隙大小;康宁公司)。随后,OSCC细胞( 在无血清DMEM /)接种前室。中含有10%的边后卫被添加到室底部。48 h后的文化、棉花球被用来去除顶部的细胞保持膜。最后,甲醇和结晶紫染色溶液(Beyotime)是用来固定和染色的细胞通过膜。通过细胞的数量是在显微镜下计数(奥林巴斯,IX71)。

2.8。免疫荧光分析

治疗后2 MK2206盐酸(6μ米和10μ米)24 h, OSCC细胞与甲醇固定15分钟和孵化主要抗体LC3B (A7198 ABclonal 1: 100)和p62 (A7758、ABclonal 1:200)一夜之间在4°C。随后,样本二次抗体孵育(A11035,热费舍尔,沃尔瑟姆,妈,1:500)为30分钟,然后用DAPI孵化(σ)5分钟。最后,积极信号被显微镜(奥林巴斯,BX61)收购。

2.9。细胞周期分析

治疗后与不同浓度的盐酸MK2206 2 (6μ米和10μ米)24 h,细胞被收获,一夜之间固定,放置在4°C。最后,细胞核染色溶液含有核糖核酸酶(100μg / mL) (Solarbio,北京)和propidium碘(10μg / mL) (Solarbio)在黑暗中30分钟。流式细胞分析仪(BD Accuri C6,富兰克林湖,NJ)被用来分析10000染色细胞核。细胞周期结果评估使用Modfit LT软件(,Topsham真实软件我)。

2.10。细胞凋亡检测

细胞凋亡被流仪分析评估使用PE-Annexin V和7-AAD染色。简单,细胞被free-EDTA-trypsinization收获(Gibco)和resuspended 1 x崭露头角的缓冲区(BD)。在室温下,我们培养的细胞PE-Annexin V (BD) 20分钟。然后,这些细胞被孵化与7-AAD (BD)在黑暗中20分钟。最后,这些细胞被评估通过流式细胞术(BD, Accuri C6)。

2.11。建立4 nqo-induced鼠标舌癌形成模型

57 C57BL / 6小鼠(6 - 7周;平均体重20.5克)购买的SPF(北京)生物技术有限公司有限公司(中国,北京)。specific-pathogen-free动物设施维护后一周,所有的小鼠被分为三组:a组小鼠(20/57:空白对照组)收到正常的水;B组(18/57:4 nqo + captisol)和C组(19/57:4 nqo + MK2206 2盐酸)老鼠收到4 nqo (100μg / mL,σ)的水每天10周。从11周,B组老鼠强饲法15% captisol (AbMole,休斯顿,德克萨斯州)和C组老鼠强饲法2 MK2206盐酸(谢立克,50毫克/公斤,溶解在15% captisol)为5周每周两次。所有老鼠的身体重量测量一周一次。所有小鼠安乐死在24周的腹腔内注射戊巴比妥钠(默克公司,达姆施塔特,德国,100毫克/公斤)。舌组织保存在4%多聚甲醛进行组织病理学分析。

2.12。组织病理学和免疫组织化学

小鼠舌组织被沾染了)和分析显微镜(奥林巴斯,BX61)。免疫组织化学(包含IHC)、节与0.01 mol / L柠檬酸缓冲(孵化 )20分钟后在微波炉抗原检索deparaffinization。部分是孵化主要抗体phospho-AKT (S473) (ab81283 Abcam, 1: 1000), p21 (10355 - 1 - ap Proteintech 1: 200), MMP-9 (ab137867 Abcam 1: 500), RhoC (ab180785 Abcam 1: 200), Ki67 (A00052208, DAKO,丹麦,1:200),CD31 (ab76533 Abcam 1: 1000)和LC3 (A7198 ABclonal 1: 100)。样本然后孵化与二次抗体(kit - 5020, Maixin) 20分钟。使用Image-Pro + 6.0软件,我们分析了包含IHC平均光密度的结果 值(22]。

2.13。肥大细胞(MC)染色

正常deparaffinization后,甲苯胺蓝染色溶液(Solarbio)被用来染色样品20分钟。一个大功率的目标领域(×400)被用来计算MC的显微镜(奥林巴斯,BX61)。

2.14。生物信息学分析

我们分析了一种蛋白激酶的表达在OC TCGA数据库(https://www.cancer.gov/about-nci/organization/ccg/research/structural-genomics/tcga)。30 OC参数搜索后,341 OC和正常组织的原始数据。TPM值标准化,和R v3.6.1被用来画出情节。

2.15。统计分析

肿瘤发病率由确切概率法进行了分析。通过单向方差分析比较在多个组进行评估。 被认为是阈值的意义。

3所示。结果

3.1。一种蛋白激酶表达TCGA OC组织评估的数据集

我们分析了一种蛋白激酶的表达在OC TCGA数据库。从TCGA的评价数据集,AKT OC组织中的表达明显高于( )比正常组织( )(图1(一))。这一结果表明,AKT在OC组织中。

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图1
评估一种蛋白激酶表达的口腔癌患者TCGA分析数据集。(一)AKT在口腔肿瘤组织的表达水平高于正常组织TCGA分析数据集。 与正常组织相比。(b)蛋白表达的一种蛋白激酶和p-AKT CAL27 SCC25 MK2206 2 hcl治疗24小时后细胞免疫印迹。

MK2206 2 hcl,一个特定AKT抑制剂,随后被用于动物和在体外研究。首先,我们发现MK2206 2的抑制作用hcl AKT在OSCC细胞。正如预期的那样,免疫印迹结果表明p-AKT表达减少,但AKT表达式仍然几乎不变的CAL27 SCC25细胞治疗后2 MK2206盐酸(6μ米和10μ米)24 h(图1 (b))。

3.2。Chemopreventive MK2206 2盐酸对4 nqo-induced鼠标舌癌形成模型

在这项研究中(图2(一个)),所有老鼠的身体重量相似,20周之前没有显著差异。然而,与空白对照组相比,身体重量的4 nqo-drinking老鼠从21周开始显著下降,这可能与口腔肿瘤(图的开发和发展2 (b))。肿瘤和病变总值鼠标舌头的最后24日星期如图2 (c)。空白组小鼠正常舌粘膜粉红色,柔软,光滑和弹性的舌头,无白色斑点和大规模的形成。然而,舌头粘膜4 nqo-drinking老鼠略白,粗糙,其中显示,1 - 2毫米白色斑点和/或外生乳头状肿块。比4 nqo + captisol组(94.4%)、盐酸MK2206 2显著降低可见肿瘤发生率(57.9%),4 nqo +盐酸MK2206 2组(表1)。从4.05毫米意味着肿瘤体积也减少了34 nqo + captisol组的3.01毫米34 nqo +盐酸MK2206 2组,在总考试(表1)。

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图2
的应用和影响MK2206 2盐酸在4 nqo-induced老鼠口服致癌作用模型。(a) chemopreventive效应的实验协议MK2206 2 hcl nqo-induced老鼠口服4日致癌作用模型。(b)小鼠体重。 与空白组相比。总值(c)肿瘤和病变在鼠标的舌头24日结束的一周。肿瘤是由箭头表示。 厘米。
表1
Chemopreventive MK2206 2盐酸对4 nqo-induced老鼠口服致癌作用。

代表图像的舌粘膜上皮的空白,4 nqo + captisol和4 nqo盐酸+ MK2206 2组数据所示3(一个)- - - - - -3 (d)他走时染色。图3(一个)是正常的舌粘膜上皮。饮用水中的老鼠管理4 nqo 10周表现出角化过度,轻度至中度发育不良(图3 (b)),严重发育不良(图3 (c)),入侵OSCC(图3 (d))。短暂,总发育异常率从27.8%增加4 nqo + 4 nqo captisol集团63.2%盐酸+ MK2206 2组(表1)。然而,鳞状细胞癌发病率4 nqo-induced鼠标OC 4 nqo + captisol组从72.2%下降到36.8% 4 nqo +盐酸MK2206 2组,如图所示)染色(表1)。

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图3
小鼠舌粘膜组织学检查:(a)正常小鼠舌粘膜上皮;(b)小鼠舌粘膜上皮轻度至中度发育不良;(c)小鼠舌粘膜上皮严重发育不良;(d)小鼠舌粘膜上皮浸润性鳞状细胞癌。放大×100;×400。

这些结果表明MK2206 2 hcl的chemopreventive效果通过抑制OC的发病率和经济增长,同时极大地抑制异生癌症的变换在4 nqo-induced鼠标舌癌形成模型。

3.3。MK2206 2盐酸的作用在癌症细胞增殖4 nqo-induced鼠标舌癌形成模型

首先,p-AKT表达4 nqo-induced鼠标舌肿瘤是通过包含IHC检测的。结果表明,p-AKT表达式4 nqo +盐酸MK2206 2组明显降低的价格相比(图4 nqo + captisol组4(一))。4日之后,MK2206机制2 hcl nqo-induced上皮增殖是调查。Ki67核染色标记的细胞增殖,并发现Ki67表达式4 nqo +盐酸MK2206 2组相比显著降低的4 nqo + captisol通过包含IHC染色(图组4 (b))。此外,p21,细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂的家庭之一,是细胞周期密切相关。我们包含IHC染色结果表明p21表达4 nqo +盐酸MK2206 2组明显增加的价格相比(图4 nqo + captisol组4 (c))。

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图4
MK2206 2 hcl抑制癌症细胞增殖4 nqo-induced小鼠舌肿瘤。(一)MK2206 2 hcl抑制p-AKT表达4 nqo-induced鼠标舌肿瘤。(b)细胞增殖抑制了盐酸MK2206 2所显示的Ki67阳性细胞。(c) MK2206 2 hcl提升p21表达舌肿瘤。所有的数据呈现的 与空白组相比,# # 与4 nqo + captisol组。放大×400。

这些结果证实了chemopreventive MK2206 2盐酸对OC细胞增殖的影响在4 nqo-induced鼠标舌癌形成模型。

3.4。MK2206 2盐酸对血管生成的影响和MC渗透的癌症在4 nqo-induced鼠标舌癌形成模型

肥大细胞,肿瘤侵犯的主要宿主细胞,通过释放血管生成与肿瘤生长和血管生成密切相关的因素。因此,我们发现MC渗透和微血管密度在4 nqo-induced鼠标舌癌。我们的研究结果表明,盐酸MK2206 2可以减少MC渗透每个字段(×400)从29.8数量4 nqo + captisol集团的每个字段(×400)19.3 4 nqo +盐酸MK2206 2组甲苯胺蓝染色(图5(一个))。此外,微血管密度也明显减少了26.7场(×400)4 nqo +盐酸MK2206 2组从39.7 /场(×400)4 nqo + captisol组(图5 (b))。

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图5
MK2206 2 hcl抑制MC渗透和微血管密度在4 nqo-induced鼠标舌肿瘤。(一)MK2206 2 hcl抑制MC由甲苯胺蓝染色渗透。(b) MK2206 2包含IHC hcl抑制微血管密度。所有的数据呈现的 与空白组相比,# # 与4 nqo + captisol组。放大×400。

这些结果证实了chemopreventive MK2206 2盐酸对血管生成的影响和癌症的MC渗透4 nqo-induced鼠标舌癌形成模型。

3.5。MK2206 2 hcl抑制OSCC细胞增殖和集落形成

检测盐酸MK2206 2在OSCC细胞的生物学功能在体外,我们进行MTT和集落形成试验。OSCC细胞系CAL27和SCC25对待MK2206 2盐酸(0、2、4、6、8、10μ米)24、48和72小时。如数据所示6(一)和6 (b),接触MK2206 2 hcl导致剂量和时间的抑制细胞的可行性。一致,集落形成试验表明,盐酸MK2206 2治疗剂量依赖性明显减少的数量殖民地CAL27和SCC25细胞(数字6 (c)和6 (d))。这些数据表明,一种蛋白激酶抑制MK2206 2盐酸可以大大抑制OSCC细胞增殖和集落形成能力在体外。

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图6
Growth-inhibitory MK2206 2盐酸对OSCC细胞株的影响。(一)MK2206 2盐酸处理抑制CAL27细胞增殖,由MTT试验来确定。2 (b) MK2206 hcl治疗抑制SCC25细胞增殖,由MTT试验来确定。(c)集落形成试验表明,盐酸MK2206 2抑制CAL27细胞的集落形成。(d)集落形成试验表明,盐酸MK2206 2抑制SCC25细胞的集落形成。所有的数据呈现的 与对照组相比。
3.6。MK2206 2盐酸诱导OSCC细胞周期阻滞于G2 / M期

MK2206 2盐酸细胞周期进程的影响是由流式细胞术在OSCC细胞系CAL27 SCC25。治疗后2 MK2206在不同浓度盐酸为24小时,结果显示,细胞的百分比是剂量依赖性增加在G2 / M期细胞的数量在G1期相应降低了流式细胞术如图7(一)和7 (b)。p-Rb是一种癌基因,调节细胞周期调节G1期的控制点。与对照组相比,盐酸MK2206 2也抑制p-Rb表达和p21表达增加CAL27和SCC25细胞,免疫印迹如图所示,与细胞周期的结果(图是相一致的7 (c))。

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图7
MK2206 2盐酸诱导细胞周期阻滞于G2 / M在OSCC细胞线。(一)MK2206 2盐酸诱导细胞周期阻滞在CAL27 G2 / M细胞。(b) MK2206 2盐酸诱导细胞周期阻滞在SCC25 G2 / M细胞。(c) MK2206 2 hcl p21蛋白表达增加,抑制p-Rb表达式通过免疫印迹CAL27和SCC25细胞。所有的数据呈现的 与对照组相比。

这些数据表明,一种蛋白激酶抑制盐酸MK2206 2可以通过减少诱导细胞周期阻滞p-Rb表达和p21表达增加。

3.7。MK2206 2 hcl提升OSCC细胞凋亡

检测盐酸MK2206 2对细胞凋亡的影响,膜联蛋白V和7-AAD在OSCC细胞进行染色。治疗后2 MK2206 hcl 24小时,结果表明,早期和晚期CAL27细胞剂量依赖性的细胞凋亡率增加了流式细胞仪,如图8(一个)。同样,SCC25细胞凋亡的检测化验也,结果符合CAL27细胞(图8 (b))。这些结果进一步表明,MK2206 2 hcl扮演一个肿瘤抑制功能通过促进细胞凋亡。

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图8
MK2206 2 hcl提升OSCC细胞的凋亡。(一)MK2206 2 hcl治疗24小时促进了CAL27的早期和晚期凋亡细胞。2 (b) MK2206 hcl治疗24小时促进了SCC25的早期和晚期凋亡细胞。所有的数据呈现的 表明早期凋亡细胞与对照组相比。# # 正如已故凋亡细胞与对照组相比。
3.8。MK2206 2 hcl抑制OSCC细胞迁移和入侵

验证的效果MK2206 2盐酸OSCC细胞migrative和入侵能力,迁移和入侵检测进行。我们的研究结果显示,与对照组相比,盐酸MK2206 2抑制OSCC细胞的迁移线CAL27剂量依赖性的方式(图9(一个))。此外,入侵检测评估MK2206 2 hcl明显减少入侵细胞的数量从52.1每个字段(×400)对照组38.3 (2×400)μ18.4 M组,每个字段(6×400)μ在10 M组,6.8μM组48 h(图10 ())。如数据所示9 (b)和10 (b)、迁移和入侵检测也在OSCC细胞行SCC25发现,这是符合CAL27细胞。这些数据进一步表明,AKT抑制剂MK2206 2盐酸可以抑制OSCC细胞的迁移和入侵的能力。

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图9
MK2206 2 hcl抑制OSCC细胞迁移能力。(一)MK2206 2 hcl抑制CAL27细胞迁移能力的迁移试验。2 (b) MK2206 hcl抑制SCC25细胞迁移能力的迁移试验。所有的数据呈现的 与对照组相比。放大×200。
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图10
MK2206 2 hcl抑制OSCC细胞入侵的能力。(一)MK2206 2 hcl抑制CAL27 Transwell入侵检测细胞入侵的能力。2 (b) MK2206 hcl抑制SCC25 Transwell入侵检测细胞入侵的能力。所有的数据呈现的 与对照组相比。放大×400。
3.9。hcl促进了自噬在OSCC MK2206 2

自从PI3K / AKT信号轴自噬活动有关,它可能是另一个可能的机制MK2206 2 hcl抑制肿瘤的生长。因此,我们探索的影响MK2206 2盐酸在OSCC细胞自噬和4 nqo-induced鼠标舌肿瘤。Microtubule-associated 1蛋白LC3自噬是一个重要的蛋白质。从全长蛋白LC3处理(MAP-LC3 I)裂解和lipidated形式(LC3 II),和LC3二世被认为是一个autophagy-specific标记。转换LC3我LC3 II显示上升趋势显示了我们的免疫印迹结果在OSCC细胞治疗2 MK2206 hcl 24 h(图11 (c))。此外,LC3 II CAL27细胞中表达显著增加,如图所示,国防部价值取决于免疫荧光(图(11日))。我们进一步测试LC3 II表达式在活的有机体内,结果表明,与4 nqo + captisol组相比,盐酸MK2206 2也可以促进LC3 II表达式4 nqo +盐酸MK2206 2组通过包含IHC染色(图11 (d))。LC3 II可以绑定到适配器蛋白质p62 sequestosome,由自噬有选择性地退化。和p62表达显著减少CAL27细胞免疫荧光(图11 (b))。SCC25细胞,也得到了相似的结果,MK2206 2 hcl提升SCC25细胞自噬(补充图1)。

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图11
MK2206 2盐酸诱导LC3二世和p62表达式在OSCC细胞和4 nqo-induced鼠标舌肿瘤。(一)MK2206 2 hcl提升LC3 II CAL27细胞免疫荧光显示的表达式。放大×400。2 (b) MK2206 hcl CAL27细胞中p62表达下降。所有的数据呈现的 与对照组相比。放大×400。(c)水平LC3 II MK2206 2中增加了西方墨点法hcl-treated CAL27细胞。(d) MK2206 2 hcl提升LC3 II表达4包含IHC nqo-induced鼠标舌肿瘤。所有的数据呈现的 与空白组相比,# # 与4 nqo + captisol组。放大×400。

这些数据证明了chemopreventive MK2206 2盐酸对OSCC的影响可能诱发自噬通过调节LC3二世和p62表达式。

3.10。MK2206 2 hcl抑制MMP-9并在OSCC RhoC表达式

chemopreventive效应的进一步检测机制MK2206 2盐酸,我们还发现MMP-9和RhoC OSCC细胞(肿瘤发生的主要监管机构)表达和4 nqo-induced鼠标舌头癌症通过rt - pcr、免疫印迹,包含IHC。在体外,CAL27和SCC25细胞MK2206 2盐酸处理24小时的RNA和蛋白表达下调MMP-9 RhoC,实时PCR(如图所示的数据12 (c)和12 (d))和免疫印迹(图12 (e))。此外,与4 nqo + captisol组相比,盐酸MK2206 2也显著降低MMP-9 RhoC表达4 nqo-induced鼠标舌癌4 nqo +盐酸MK2206 2组通过包含IHC染色(数字12(一个)和12 (b))。

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图12
AKT抑制剂的抑制影响MMP-9 / RhoC表达式。(一)MK2206 2 hcl抑制MMP-9表达4 nqo-induced舌肿瘤。(b) MK2206 2 hcl抑制RhoC表达4 nqo-induced舌肿瘤。所有的数据呈现的 与空白组相比,# # 与4 nqo + captisol组。放大×400。(c) MK2206 2 hcl抑制RNA的表达MMP-9和RhoC CAL27细胞。(d) MK2206 2 hcl抑制RNA的表达MMP-9和RhoC SCC25细胞。所有的数据呈现的 与对照组相比。盐酸(e) MK2206 2抑制MMP-9和RhoC在OSCC细胞的蛋白表达。

这些结果表明,MK2206 2 hcl的chemopreventive效应可能是通过调节MMP-9并在OSCC RhoC表达式。

4所示。讨论

OSCC是癌前病变的一种高级形式,早期的化学预防可能提供最好的策略来抑制癌症的发展。据报道,大多数癌症hyperactivation AKT,成为一个有吸引力的目标分子。通过TCGA数据库分析,我们发现,AKT OC中高度表达。研究表明,盐酸MK2206 2是为数不多的一种蛋白激酶抑制剂用于治疗头颈肿瘤(23),但其剂量毒性限制了其应用范围。在这项研究中,我们第一次发现的潜在chemopreventive效应MK2206 2盐酸在4 nqo-induced鼠标舌癌形成模型。我们的研究结果表明,盐酸MK2206 2可以明显降低OC的发病率和增长和抑制异生癌症的变换在4 nqo-induced鼠标舌头致癌作用模型,和所有老鼠容忍在整个治疗。此外,我们的研究结果还表明,MK2206 2盐酸可以抑制增殖,集落形成,入侵,OSCC细胞的迁移能力在体外。

MK2206 2 hcl抑制舌粘膜上皮的发育不良4 nqo-induced鼠标舌癌形成模型。p21是一种细胞周期逮捕蛋白,与细胞增殖的能力。p-Rb是细胞周期检查点。和Ki67称为扩散指数代表活跃程度的细胞增殖。包含IHC结果表明MK2206 2 hcl的表情抑制p-AKT Ki67和提升p21的表达在小鼠舌癌。此外,MK2206 2盐酸诱导细胞周期阻滞在OSCC细胞在体外,进一步的检测表明,MK2206 2 hcl抑制p-Rb的表达,促进了p21的表达。具体来说,MK2206 2 hcl抑制OSCC细胞增殖,与G2 / M细胞周期相关积累。据报道,细胞凋亡可能杀死错位的细胞。因此,细胞凋亡是抑制转移和扩散的一个重要过程24]。我们的研究结果发现,盐酸MK2206 2提升在OSCC细胞凋亡。研究表明,盐酸MK2206 2可以促进mcl1和cleaved-caspase 3通过抑制一种蛋白激酶磷酸化(25]。mcl1和cleaved-caspase 3细胞凋亡过程中起着重要的作用[26]。因此,细胞增殖与细胞周期和细胞凋亡密切相关。

在我们的研究中,盐酸MK2206 2提升LC3 II表达式。高表达的LC3被认为是最可靠的自噬(标记之一27]。值得注意的是,自噬,一个重要的过程,可以促进正常细胞的生存和触发有害细胞的死亡28]。促进自噬的发生在结肠直肠癌能抑制癌细胞的扩散,这是与我们的结果一致29日]。研究表明,抗癌药物的抗癌活性是由于引发自噬和凋亡30.]。有趣的是,PI3K / AKT信号通路中起着举足轻重的作用在调节细胞凋亡和自噬(之间的交互31日]。针对GSK3 PI3K / Akt通路可以促进自噬和对癌细胞凋亡的敏感性32]。p-AKT表达可以诱导自噬和凋亡抑制人类OC细胞(33]。复杂的细胞凋亡和自噬是由ATG5之间的串扰,bcl - 2,和beclin - 130 - 3234,35]。在这项研究中,我们还发现MK2206 2盐酸可以减少p-AKT表达式和促进自噬和凋亡。因此,我们推测chemopreventive MK2206 2盐酸对4 nqo-induced鼠标舌头致癌模型可能与促进自噬和凋亡有关。

此外,我们发现,盐酸MK2206 2也可以抑制血管生成和MC渗透在4 nqo-induced鼠标舌癌。控制细胞的生长和转移是恶性肿瘤的重要特征,这些过程与血管生成密切相关。研究发现,AKT1击倒的老鼠可能影响内皮细胞迁移和没有释放,导致VEGF-mediated减少血管生成(36]。MMP-9还与血管新生有关通过调节肿瘤血管生成因素的沉积和proangiogenic因素,导致血管内皮细胞的招聘(37]。此外,MC是先天免疫细胞固有的组织,可促进血管生成和加快发展恶性肿瘤通过释放不同的趋化因子(如肿瘤坏死因子-α和IL-1b)和炎性细胞因子(38]。

尽管许多报道的肿瘤抑制机制MK2206 2 hcl已经出版,目前尚不清楚如何MK2206 2盐酸调节OC的发展在鼠标4 nqo化学预防模式。除了自噬的发生,我们还发现tumorigenesis-related因素(MMP-9和RhoC基因)表达减少在体外和4 nqo-induced鼠标舌头癌症在这项研究。首先,MMP-9可以促进肿瘤发生降解细胞外基质和基底膜。其启动子区域包含激活蛋白AP-1 [39]。研究表明,PI3K / AKT信号轴激活可以激活AP-1和诱导MMP-9的表达,最终促进肿瘤细胞增殖,入侵,和迁移40- - - - - -42]。此外,RhoC也是一个关键的中介在肿瘤细胞的扩散和转移,和AKT可以调节RhoC表达式(43]。缺乏RhoC可以抑制肿瘤细胞的转移通过调节肿瘤细胞和内皮细胞之间的交互44]。有趣的是,在我们之前的研究中,MMP-9提升OSCC细胞增殖和转移通过调节RhoC表达式(45]。

各种研究发现自噬起着直接作用在肿瘤细胞入侵和运动通过调节细胞外基质蛋白(46]。自噬调节焦点粘附动力学在细胞迁移和入侵47]。粘着斑激酶(FAK)导致SRC激酶的活化和桩蛋白底物,抑制自噬在细胞分离,从而促进细胞转移(48,49]。我们之前的研究还发现,MMP-9积极调节RhoC的表达,和ρRac1调节细胞活性,促进细胞膜突起的形成,板状伪足,丝状伪足。还有一个细胞迁移和自噬的调节之间的关系由ρ的家庭。ρ诱导血液细胞迁移能力的果蝇取决于autophagy-related基因1和p62 [50]。

基于上述情况,我们初步推测chemopreventive MK2206 2盐酸对4 nqo-induced鼠标舌头致癌模型也可能MMP-9 / RhoC相关信号通路和自噬。

5。结论

总之,我们的研究首次证明了chemopreventive AKT抑制剂的效果MK2206 2 hcl 4 nqo-induced鼠标舌癌形成模型,这可能是由抑制肿瘤生长,血管生成,并通过抑制MC渗透和MMP-9 / RhoC信号通路,自噬和凋亡。这些研究结果初步的发展提供基本的支持MK2206 2盐酸作为OC chemopreventive药物。

缩写

度: 口腔癌
OSCC: 口腔鳞状细胞癌
4 nqo: 4-Nitroquinoline-1-oxide
主持人: 柱状细胞
包含IHC: 免疫组织化学。

数据可用性

本研究中所有生成的数据或分析包括在发表的这篇文章。

伦理批准

动物保健和实验性的协议都是动物伦理委员会批准北京口腔医院,首都医科大学(许可数量:kqyy - 201708 - 004)。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

PY执行主要的实验和数据分析和写的手稿。XZ本研究设计和指导实验。JC, YW, FG, JW, WZ, y进行一些实验。XZ修订后的手稿。阅读和批准所有的作者都最后的手稿。

确认

本研究的研究经费支持北京市自然科学基金(中国)(7202057)和中国国家自然科学基金(81772868)。我们感谢Zhenchuan田从北京口腔医院,首都医科大学,他的帮助在动物实验。

补充材料

补充图1:MK2206 2盐酸诱导LC3二世和p62在OSCC细胞中表达。(一)MK2206 2 hcl提升LC3 II SCC25细胞免疫荧光显示的表达式。放大×400。2 (b) MK2206 hcl SCC25细胞中p62表达下降。所有的数据呈现的 与对照组相比。放大×400。(c)水平LC3 II MK2206 2中增加了西方墨点法hcl-treated SCC25细胞。(补充材料)