的识别5-Gene-Based WGCNA和套索来预测预后评分系统的直肠癌患者

文摘

背景。尽管越来越多的证据表明,分子签名面板可能更有效的预后预测比常规临床特点,目前的研究主要集中在结直肠或结肠癌症。没有专门的报道集中在签名面板直肠癌(RC)。我们目前的研究旨在开发一种新的预后签名面板RC。方法。测序(或微阵列)数据和RC患者的临床病理的细节从癌症基因组图谱检索(TCGA-READ)或基因表达综合(GSE123390 GSE56699)数据库。加权基因coexpression网络用于识别RC-related模块。绝对最小的收缩和选择算子分析屏幕预后签名面板。预后风险评分的性能评估是存活曲线分析。预后基因功能预测的基础上,相互作用蛋白,免疫细胞与肿瘤浸润的关系。人类的蛋白质图谱(HPA)工具是用来验证蛋白表达水平。结果。总共247个差异表达基因(度)通常确定使用,TCGA和GSE123390数据集。棕色和黄色模块(包括77度)被确定为RC被保留下来。五度(ASB2 GPR15、PRPH RNASE7,和TCL1A)在这两个模块构成最优预测签名面板。kaplan meier曲线分析表明,患者在高危人群比低风险组的预后较差。接受者操作特征(ROC)曲线分析表明,这种风险得分为不利预后预测精度高,ROC曲线下的面积为0.915和0.827,TCGA和GSE56699数据集,分别。这five-mRNA分类器是一个独立的预后因素。其预测精度也高于所有临床因素模型。一个预后诺模图是由整合风险评分和临床因素,显示预后最高权力。ASB2、PRPH GPR15 / TCL1A所具有的功能与CASQ2互动/ PDK4 / EPHA67, PTN和CXCL12分别。 TCL1A and GPR15 influenced the infiltration levels of B cells and dendritic cells, while the expression of PRPH was positively associated with the abundance of macrophages. HPA analysis supported the downregulation of PRPH, RNASE7, CASQ2, EPHA6, and PDK4 in RC compared with normal controls.结论。我们的几种签名面板可能是一个有前途的RC预后指标。

1。介绍

此前,结肠癌(CC)和直肠癌(RC)被认为是一个肿瘤实体(称为结直肠癌(CRC)) (1]。然而,最近的研究表明,有显著差异在流行病学、病理学、分子机制和对治疗的反应(1]。发展RC估计的风险高于CC的四倍,和RC患者5年生存率低于CC病人(60%比72%)由于贫穷回应当前的治疗方案1- - - - - -3]。因此,它是特别重要的早期探索方法单独RC患者死亡风险较高,然后提供改进的专业护理,以进一步降低总体死亡率。

测序技术和生物信息学的发展,近年来学者表明,分子签名面板可能更有效的预后预测比常规临床特征(如tumor-node-metastasis (TNM)阶段)(4,5]。李等人发现了一个four-mRNA CRC的签名面板作为一个独立的预后因素。这个four-mRNA签名面板可以有效地预测CRC患者的预后,与接受者操作特征(ROC)曲线下面积(AUC)为0.730。分层分析表明,病人属于相同的T台(T3 + T4), N (N1 + N2)阶段,或者TNM阶段(3 + 4)也可以分层分为高风险和低风险组使用这个4等位基因签名面板(6]。左等人的研究表明,six-mRNA签名面板有一个重要的预后价值区分高危患者的低风险患者,0.711和0.683的AUC为3年和5年生存,分别。这个6-gene签名面板是一个独立因素的操作系统对临床因素调整后,可以预测不同的生存结果(或高级)早期患者TNM阶段(7]。太阳等人开发了一个12基因表达签名面板为CC病人精确预测预后,可以区分穷人和病人预后良好阶段II / III(内8]。陈等人发现签名面板组成的16个基因对由24个基因有更好的预后能力比TNM阶段(AUC: 0.724和0.703;一致性指数(c指数):0.869比小于0.8)在5年9]。虽然也有研究来识别mrna与RC患者的预后相关(10- - - - - -13),没有专门的报道集中在签名面板和比较与临床因素的预后价值。

在目前的研究中,我们的目的是(1)屏幕RC-related基因通过加权基因coexpression网络分析(WGCNA) [14),(2)建立一个可靠的信使rna签名面板预测患者的总生存期(OS)的钢筋混凝土使用至少绝对收缩和选择操作符(套索)方法(15,16),(3)验证其预测性能优越的分层分析和比较各种临床特征AUC c指数,和(4)建立clinicopathologic-mRNA诺模图改善临床预测精度。

2。材料和方法

2.1。数据访问

RNA-seq表达数据(每千碱基的外显子片段映射每百万读取映射,级别3)从癌症基因组图谱检索(TCGA;https://portal.gdc.cancer.gov)数据库使用“TCGA-rectal腺癌(读)”作为关键字。读有177例和10控制在这个数据集。但是,只有162阅读情况下提供临床资料。因此,TCGA数据集(包括162例和10控制)作为训练数据集后对我们的分析。此外,GSE123390(2.0平台:Affymetrix人类转录组数组)和GSE56699(平台:Illumina公司HumanHT-12 WG-DASL V4.0 R2表达式beadchip)也获得的基因表达微阵列数据集综合(地理,http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)数据库使用“直肠癌”作为关键字。GSE123390用于WGCNA模型验证,因为它研究人类RC组织的mRNA表达谱( )和控制( )。GSE56699用于生存模型验证,因为它提供了61 72 RC病例的预后信息。研究流程图如图1。

2.2。识别差异表达基因(度)

TCGA-READ GSE123390数据集,钢筋混凝土之间的度是筛选和控制使用R的limma包(版本3.34.7;https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/limma.html)[17]。 和 被定义为统计阈值。所有度这两个数据集进行层次聚类分析使用R的pheatmap包(版本1.0.8;https://cran.r-project.org/web/packages/pheatmap),生成的热图是用来评估钢筋混凝土之间的基因表达模式的异构性和控制。画维恩图的在线工具(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn)是用来确定TCGA-READ之间的共享度和GSE123390数据集。共同度的函数进行了分析使用gProfiler工具(http://biit.cs.ut.ee/gprofiler/gost)。基因本体论(去),京都基因和基因组百科全书(KEGG),并与一个Reactome通路 被认为是具有统计学意义。

2.3。WGCNA

筛选与钢筋混凝土的发展,相关的基因WGCNA都使用了WGCNA包R(版本1.61;https://cran.r-project.org/web/packages/WGCNA/index.html)[14),高度相关的mrna可以集中到同一个coexpression模块。WGCNA包括六个步骤:(1)计算表达式和连通性mrna TCGA-READ和GSE123390数据集之间的相关性;(2)选择软阈值功率( )根据无标度拓扑标准;(3)计算之间的拓扑矩阵不同重叠基因TCGA-READ构建的系统树图和识别模块( 和 )通过动态树切割方法(18];(4)评估保护( 和 )模块的两个数据集使用modulePreservation统计(19];(5)浓缩度模块使用超几何算法 (20.];(6)协会与临床信息coexpression模块。

2.4。蛋白质相互作用网络(PPI)

PPI对度中关键模块被确定使用搜索工具来检索相互作用基因(字符串;11.0版本;https://string-db.org)数据库(21]。只有相互作用的总和 选择构建PPI网络使用Cytoscape软件(版本3.4;http://www.cytoscape.org/)[22]。基因的功能使用KEGG PPI网络进行了分析,,Reactome实现字符串。重要条款,KEGG通路,Reactome通路选择使用 统计阈值。

2.5。发展预后签名面板

单变量Cox回归分析被用来屏幕OS-associated度的基因保存模块。log-rank的度 在单变量分析输入到多变量Cox回归模型来确定独立的预测因子。L1-penalized(套索)Cox比例风险模型在处罚包(0.9版本5;http://bioconductor.org/packages/penalized/)[15,16进一步应用于这些独立预后度来选择最优的子集签名面板。风险评分模型建立了基于预后度(Exp的表达水平_度)和套索系数( ):

患者分为高危组和低风险组通过使用风险评分中位数作为截止。操作系统之间的差异高危组和低风险组根据kaplan meier存活曲线进行比较分析和生存率较。风险评分的预测精度估计通过AUC ROC曲线的计算。这些分析首次开展GSE56699 TCGA-READ数据集,然后验证的数据集。

此外,单变量和多变量Cox使用TCGA-READ队列应用分析评估风险评分是否独立于其他临床预后的预测变量。kaplan meier存活曲线分析用来确定是否分层的风险评分也是一个有效的工具相同的患者的临床特点。诺模图,结合风险评分及临床预后因素的预测开发3年和5年OS率。列线图的预测能力评估的AUC和c指数(计算survcomp包,http://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/html/survcomp.html)。

2.6。分析免疫细胞浸润

之间的关联选择预后基因的表达和丰富的六个肿瘤浸润免疫细胞TCGA-PRAD (B细胞、CD4 + T细胞、CD8 + T细胞,中性粒细胞,巨噬细胞、树突细胞)估计的肿瘤免疫评估资源(定时器;https://cistrome.shinyapps.io/timer/根据斯皮尔曼相关测试)。 调整后的肿瘤被认为是显著的纯洁。

2.7。验证预后基因的蛋白质的表达

的免疫组织化学结果prognostic-related度及其相互作用的基因在直肠和正常组织被下载从人类蛋白质图谱(HPA)确认其蛋白表达水平。

3所示。结果

3.1。度RC和正常对照组之间

基于阈值的 和 ,1053度(包括830和223年调节使之抑制)筛选控制162 RC组织和正常组织之间,TCGA数据集,在1711度(包括728表达下调和983调节)之间确定了28个RC组织和5 GSE123390正常控制组织的数据集。火山情节和热图的这两个数据集的数据所示2(一个)和2 (b)和数字2 (c)和2 (d),分别。此外,画维恩图在线工具被用来调查度在这两个数据集的交集。因此,268发现重叠度,但是表达趋势直到247年度(图是相一致的2 (e);表S1)。

这些247个基因受到gProfiler在线功能富集分析工具集。结果表明,9去分子功能方面(如粘多糖绑定:核糖核酸酶家族成员7 (RNASE7)), 57生物过程的条件(如反应内源性刺激:隐钙素2 (CASQ2),丙酮酸脱氢酶激酶4 (PDK4)和C-X-C主题趋化因子配体12 (CXCL12);离子运输:CASQ2 CXCL12;对有机物质:CASQ2 TCL1家庭AKT共激活剂(TCL1A),和CXCL12;化学反应:PDK4和弗受体A6 (EPHA6);趋化性:CXCL12和EPHA6;和调节心脏收缩:CASQ2)、7 KEGG途径(如钙信号通路:CASQ2)和5 Reactome途径(如肌肉收缩:CASQ2;GPCR配体结合:CXCL12)丰富(表S2)。

3.2。由WGCNA RC-Related模块的识别

相关分析表明,表达水平有正相关性( , )和连接( , )训练数据集之间的rna, TCGA GSE123390和验证数据集。TCGA使用数据集,软阈值功率10被选为创建与无标度网络的拓扑结构(首次达到了0.9;平均连通性等于1)。基因集群的系统树图显示为9模块TCGA使用数据集(图3(一个))。这些模块的分析也验证了GSE123390数据集(图3 (b))。其中,蓝色,棕色,灰色,红色,绿色,和黄色模块被认为是保留,因为它们 和值< 0.05(表1)。棕色和黄色模块被大大丰富度(浓缩 和值< 0.05),这表明他们可能对RC(表的发展至关重要1)。棕色和黄色的基因模块也发现与病理M显著相关,病理N,病理T,病理阶段,RC患者的生存时间和死亡(图3 (c))。

3.3。PPI网络的建设

77度的棕色和黄色模块上传到数据库的字符串来获得他们的互动关系。结果,281之间的交互作用对69度被确定(如peripherin——(PRPH) PTN锚蛋白重复和soc箱含有2 - (ASB2) CASQ2 / PDK4 / EPHA6,和G protein-coupled受体15 (GPR15) / TCL1A-CXCL12),这是用于构造PPI网络(图S1)。功能富集分析获得30生物过程的条件(如调节心脏收缩:CASQ2;调节离子运输:CASQ2 CXCL12;监管的组织重构:PDK4;负调节白细胞拘束或滚动:CXCL12;和消极的调节树突细胞凋亡过程:CXCL12), 4 KEGG途径(如代谢外源性物质的细胞色素P450和化学致癌),和4 Reactome途径(如肌肉收缩:CASQ2)(表S3)。

3.4。发展预后风险评分

的单变量Cox回归分析确定了35度明显与操作系统有关,包括EPHA6(风险比 ),CASQ2 ( ),和PDK4 ( )(表S4)。八人筛选后作为独立的预后预测多变量Cox回归分析(表S5)。PH值使用LASSO-based Cox模型进一步确认,5度(ASB2, GPR15, PRPH、RNASE7 TCL1A)可能构成最优签名面板预后预测(表2)。

每个病人的预后风险评分估计TCGA训练数据集和验证GSE56699数据集由以下公式: 。基于风险评分的中值,患者分为低风险组和高危人群。kaplan meier曲线分析表明,高危组患者明显较差预后结果比低风险组(TCGA: ,95%置信区间 - - - - - -14.88, ,图4(一);GSE56699: ,95% - - - - - -25.50, ,图4(b))。ROC曲线分析表明,这种风险得分为不利预后预测精度高,AUC的0.915(图4(c))和0.827(图4(d)), TCGA GSE56699数据集,分别。

单变量和多变量Cox回归分析也使用风险评分和其他临床因素进行确认的独立five-mRNA签名面板。结果显示,在多变量调整临床病理的因素,与患者相关的风险评分仍显著OS(表3),暗示这five-mRNA-based分类器是一个独立的预后因素。此外,风险评分被证明有能力进一步分类的人口超过65岁( ),病理M0 ( ),病理N0 ( ),和病理阶段II ( )并预测不同预后结果(图5),表明其预后优于常规临床因素。此外,时间ROC曲线分析还表明,预测风险评分的准确性( ;C - )高于年龄( ;C - ),病理( ;C - ),病理N ( ;C - ),和病理阶段( ;C - )和模型与临床因素( ;C - )(图6(一))。因此,应结合临床风险评分因素更好地预测临床预后,基于一个预后列线图(图发展6 (b))。正如所料,AUC(0.976)和c指数(0.913)的诺模图是高于任何临床因素模型和风险评分模型(图6(一))。

3.5。信使rna水平的预后之间的相关性基因和肿瘤浸润免疫细胞

计时器分析显示,有显著相关性ASB2 / TCL1A表达式和B细胞、CD4 + T细胞和树突细胞;GPR15的表达呈正相关的大量的B细胞和树突状细胞(dc);PRPH的表达与浸润水平呈正相关的CD4 + T细胞和巨噬细胞(图7)。观察无显著关联RNASE7和渗透的表达水平之间的所有六个免疫细胞(图7)。

3.6。验证预后基因的蛋白表达

5签名基因的表达及其相互作用基因从HPA数据库使用免疫染色结果进行验证。结果的差别支持对这些PRPH、RNASE7 CASQ2, EPHA6, PDK4 RC与正常对照组相比(图8)。GPR15 TCL1A, PTN没有检测到RC组织和正常直肠组织。没有证据表明ASB2和CXCL12疣状。没有直肠样本收集调查PDK4在RC的表达。

4所示。讨论

在目前的研究中,我们建立了一个基于五个风险评分模型预后度(ASB2, GPR15, PRPH、RNASE7 TCL1A)。ROC曲线分析表明这个5-mRNA签名面板可以准确地预测患者的预后RC, AUC的0.915和0.827的培训和验证数据集,分别。风险评分的预后表现似乎比之前报道的签名板开发CRC(如4基因: 0.607外部数据集和内部数据集(4];6基因: (7];和9基因: (23])或CC(16基因配对: (9];9基因: (22])。此外,在研究左et al。7),他们进行了亚组分析证实6-gene签名面板是否有效的结肠腺癌(COAD)和阅读。因此,AUC分别是0.653和0.74 COAD和阅读,都是低于我们的签名面板。此外,符合其他签名面板确认CRC或CC患者(6- - - - - -9,24),我们的风险评分被证明是一个独立的预后因素的预测和分层的生存患者TNM阶段相同。此外,AUC的c指数风险评分高于年龄( ;C - ),病理( ;C - ),病理N ( ;C - ),和病理阶段( ;C - )和模型与临床因素( ;C - )。这些发现表明,我们的风险评分可作为一种有效的分子生物标志物与RC预测患者的预后不良。更好地指导预测在临床实践中,一些作者表明分子预后模型和临床病理的模型应该结合(24- - - - - -27),显示最高的预测能力比任何人。同意这些研究,我们的研究结果还表明,集成的列线图five-mRNA分类器和四个临床危险因素(年龄、病理M, N病理和病理阶段)AUC最高(0.976)和c指数(0.913)。

尽管所有的5个签名基因并不包括在之前的签名面板CRC (6- - - - - -9,24),其中一些被发现与CRC的进展和预后有关(包括ASB2 GPR15 TCL1A, PRPH) (28- - - - - -31日]。高ASB2表达式显示预测短期复发存活率CRC患者(28]。删除ASB2在造血细胞抑制的缩短结肠癌和老鼠的肿瘤负荷。函数分析表明ASB2可能产生肿瘤促进角色通过减少Th1, Th17细胞毒性CD8 + T细胞反应,有利于防止肿瘤恶化(28]。符合研究转轮et al。28),我们的研究结果还表明,高水平的患者ASB2可能拥有更大的风险高12.505倍OS率比低表达。也,ASB2预测与chemotaxis-associated EPHA6基因可hypermethylated导致下调EPHA6表达式通过抗炎白细胞介素- 6 (32,33),Th17细胞生物标志物(34]。EPHA6减少前列腺癌的细胞的可拆卸的入侵在体外和减少肺和淋巴结转移在活的有机体内(35]。高EPHA6表达与乳腺癌患者(OS率较低36和我们的RC ( )。除了EPHA6之外,我们也预测,ASB2可能参与RC通过影响CASQ2和PDK4的表达式。高度表达CASQ2 [37]和PDK4 [38)据报道与贫困显著相关操作系统和癌症患者的无病生存。PDK4促进细胞增殖的过度表达,入侵,肿瘤的生长在活的有机体内(38]。这些预测的结论CASQ2 ( )和PDK4 ( )在我们的研究也证实了RC。TCL1A癌症发展是至关重要的表达在一个族群的免疫B细胞(CD3 - / CD19 + / CD10 + / CD34 -)。高TCL1A / CD20 (B细胞)比率或TCL1A表达式被证明与改善生存(39,40]。在协议与其他癌症(39,40),我们的研究还表明,TCL1A生存风险保护的RC患者( )并与大量的B细胞呈正相关。此外,我们预测TCL1A可能与CXCL12交互,趋化因子基因,推测是参与调节树突细胞凋亡过程的功能富集分析。高CXCL12表达式被报道赋予一种对乳腺癌患者的生存优势(41]和III期CC [42]。沉默的CXCL12转化生长因子-β原发肿瘤部位的间充质基质细胞促进肿瘤转移通过增加CXCR7的表达,CXCL12受体(43]。一项荟萃分析表明,免疫疗法与DCs显著提高操作系统在6个月,1年,3年,5年的患者肝细胞癌(44]。Coculture DCs明显抑制肝癌干细胞的生长在体外和在活的有机体内(45]。与这些研究结果一致,我们还发现TCL1A的表达呈显著正相关与DCs的渗透。使用TCGA genotype-tissue表达数据,小王,小王发现GPR15显著低表达与正常组织相比,COAD和阅读(30.),在我们的研究中进行验证。GPR15表达与患者的预后呈极显著的正相关关系,COAD(即高表达有较长的OS) (30.),也在我们的研究中观察到的阅读。王先生和王相信GPR15可能是一个肿瘤抑制基因的调节一个串行浓缩在免疫系统和增加B细胞的渗透(颈部鳞状细胞癌、肺腺癌和胃腺癌),CD4 + T细胞,DCs(颈部鳞状细胞癌和胃里腺癌)30.]。同样地,我们发现GPR15的表达与肿瘤浸润的水平呈正相关免疫B细胞和DCs和预测,GPR15可能与DC-related CXCL12参与RC进展。CD133 +显示促进人脐造血祖细胞的增殖和CRC入侵细胞在体外,提高肿瘤的生长和转移在活的有机体内通过上调PRPH [31日]。然而,在CRC PRPH机制仍不清楚。在这项研究中,我们推测PRPH可能通过与下游PTN交互功能。肿瘤相关巨噬细胞淋巴瘤的癌症干细胞的比例增加分泌PTN [46]。调节PTN促进肿瘤细胞增殖和抑制细胞凋亡,通过激活NF -化学敏感性κB通路(46,47]。PTN的荟萃分析显示,高表达明显相关的一种先进的肿瘤患者TNM阶段和一个贫穷的操作系统(48]。类似于这些研究,我们还报道,PRPH与肿瘤相关巨噬细胞呈正相关。

尽管RNASE7,编码一个抗菌肽,并不证明与CRC,本身及其家庭成员的角色在其他癌症可能间接验证我们的结论。斯科拉等人报道,RNASE7的表达逐渐减少恶性转化过程中,显示出最高的表达健康的皮肤和最低的表达在口腔鳞状细胞癌(49]。核糖核酸酶家族成员的低表达免疫防御细菌感染导致的损失(50- - - - - -53),这是一个重要原因引发的癌症。核糖核酸酶的可拆卸的L增加前列腺癌的细胞迁移(54)和增强肿瘤的生长和转移后植入在鼠标前列腺55)的机制与细胞表面整合素的表达增加有关β1和激活的粘着斑kinase-sarcoma通路和Ras-related C3肉毒杆菌毒素衬底1-guanosine三磷酸酶活性(54]。水平较低的结直肠肿瘤核糖核酸酶H2表现出明显较短的生存时间(56]。与这些研究,我们也证明了RNASE7在RC表达下调,更高层次的患者RNASE7再操作系统与控制。

一些限制应该承认在这个研究。首先,预后签名面板开发和验证基于来自公众的生存信息回顾性收集数据集(TCGA和GSE56699)。前瞻性试验需要在我们医院进行进一步验证这个签名面板的预后价值。第二,这些签名度的表达式也发现使用公共TCGA GSE123390数据集。在这些数据集,样本的数量正常组比癌症组相当小。这种不平衡可能会导致一个统计的问题。一致的样本大小的RC和对照组应该旨在进一步证实他们的表情。第三,临床(PCR,免疫组织化学和皮尔逊相关),在体外(coimmunoprecipitation击倒,过度或coincubation免疫细胞),和在活的有机体内(小干扰rna转染肿瘤移植、模仿、和免疫疗法)应进行实验探索PPI签名基因之间的关系(PRPH-PTN ASB2-CASQ2 / PDK4 / EPHA67和GPR15 / TCL1A-CXCL12)和评估我们的签名的功能基因在钢筋混凝土的发展(尤其是RNASE7,在CRC之前报道)。第四,其他分组变量选择方法(如弹性网和CoxBoost) (57)预后的识别签名面板应单独使用或会同套索RC确定更有效的预后指标。第五,表达式,预测能力,和函数签名的基因应该CC和RC样本之间的比较。

5。结论

我们的研究开发了一种five-mRNA签名面板(ASB2, GPR15, PRPH RNASE7, TCL1A)作为钢筋混凝土的几种预后生物标志物。这个签名面板患者表现出出色的精度等级更高的死亡风险。诺模图,结合风险评分及临床特征(年龄、病理M, N病理和病理阶段)可能更有效地指导个性化治疗的临床决策。

数据可用性

为本研究可以在生成的数据集地理(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/;TCGA GSE123390 GSE56699)和(https://gdc-portal.nci.nih.gov/)。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

HH, XSL, tx, HKP构思。HH和XSL收集数据并进行统计分析。CAD、低频和WJZ参与调查的文献和解释的结果。HH和XSL起草。tx, HKP修订后的手稿。所有作者都阅读和批准的最终版本。他黄和徐Shilei贡献同样这项工作。

补充材料

图S1:蛋白质相互作用网络由关键模块的基因。红色,调节的表情;绿色,表达下调表达。表S1:共同度确定TCGA GSE123390和数据集。表S2:函数浓缩常见的差异表达基因的两个数据集。表S3:浓缩功能基因的PPI网络。度表S4:单变量Cox回归分析与操作系统有关。度表S5:多变量Cox回归分析与操作系统有关。(补充材料)

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