MMP-9击倒抑制口腔鳞状细胞癌的淋巴结转移裸鼠Tongue-Xenografted模型通过RhoC / Src通路

文摘

口腔鳞状细胞癌(OSCC)是最常见的一种类型的癌症在发展中国家。OSCC的高死亡率的主要原因是口腔癌细胞转移的趋势在头部和颈部淋巴结在癌症发展的早期阶段。基质金属蛋白酶9 (MMP-9)、肽链内切酶可以降解细胞外基质和基底膜和肿瘤浸润和转移中起着关键作用。在体外是由抓化验、细胞迁移能力。我们也调查了OSCC细胞和血管内皮细胞之间的交互能力(ECs)附着力的测定和transendothelial迁移试验。我们建立BALB / c裸小鼠tongue-xenografted转移模型探讨MMP-9的作用,探索其潜在的机制在OSCC增长潜力,淋巴结转移和血管生成在活的有机体内。结果表明,击倒MMP-9可以显著抑制OSCC细胞迁移、增殖,内皮细胞之间的相互作用,异种移植肿瘤的生长,同时,血管生成和显著抑制OSCC细胞转移鼠标lymphonodi宫颈表面,腋窝淋巴结,甚至遥远的腹股沟淋巴结。机械的研究也显示,击倒的MMP-9导致RhoC的表达减少,Src,通过rt - pcr和f -肌动蛋白,蛋白免疫印迹和免疫组织化学。和生物信息学分析表明,MMP-9 RhoC, Src mRNA表达呈正线性相关在OSCC TCGA数据库。在一起,我们的研究结果表明,MMP-9在OSCC增长起着非常重要的作用,迁移、血管生成和淋巴结转移,其潜在的机制可能是由RhoC和Src基因表达。

1。介绍

口腔鳞状细胞癌(OSCC)是最常见的头颈部恶性肿瘤,占300000例(占世界总数的2.1%)和145000例死亡(占世界总数的1.8%)在2012年,据统计从国际癌症研究机构(IARC) (1]。尽管积极的治疗,OSCC患者的五年生存率仍然是大约50%。OSCC与死亡率的增加与高度的进取型增长模式局部侵袭性和转移区域淋巴结(2]。

Epithelial-mesenchymal过渡(EMT)被认为是一个转换过程,使肿瘤细胞获得积极的特点,如侵袭性和转移能力。在许多类型的恶性肿瘤,如OSCC、基质金属蛋白酶(MMPs)在肿瘤微环境中发挥作用诱导变化EMT和促进EMT通过入侵和转移的行为。中基质金属蛋白酶,基质金属蛋白酶9 (MMP-9)、基质金属蛋白酶参与转移的主要蛋白水解酶的形成,能降解各种细胞外基质(ECM)蛋白质成分,破坏肿瘤细胞入侵的组织障碍,导致加速肿瘤转移(3]。MMP-9多种肿瘤组织中高度表达,包括胃癌、乳腺癌、前列腺癌、骨肉瘤、非小细胞肺癌,并与临床分类、淋巴结转移和总体生存率(4- - - - - -8]。尽管MMP-9高表达的肿瘤相关临床研究被认为是入侵,更远在活的有机体内和体外研究仍需要确认MMP-9在OSCC中的作用。

我们初步数据发现,击倒的MMP-9斑马鱼模型中可以抑制OSCC细胞转移(9]。进一步确认MMP-9在转移中的作用,探索其潜在的潜在机制,我们建立了一个舌头BALB / c裸小鼠原位OSCC细胞异种移植模型。与斑马鱼异种移植模型相比,鼠标的舌头原位异种移植模型具有更大的优势,因为它允许更好的理解MMP-9基因击倒在肿瘤的生长的影响,血管生成,局部淋巴结转移,有助于进一步探索其潜在机制。具体来说,我们调查的击倒MMP-9抑制OSCC的恶性生物学行为可能由RhoC和Src表达式。

2。材料和方法

2.1。建立在OSCC细胞MMP-9的可拆卸的模型

OSCC细胞行CAL27是来自武汉大学作为礼物,和SCC15从美国购买类型文化集合(写明ATCC马纳萨斯,弗吉尼亚州)。细胞在DMEM培养高葡萄糖或DMEM / F12培养基(英杰公司生命科学,卡尔斯巴德,CA)补充10%胎牛血清(HyClone的边后卫,洛根,UT), 100 U /毫升青霉素,100μ克/毫升链霉素。人类脐静脉内皮细胞来自北京协和医学院(通过传代形成细胞的医院和培养VascuLife基础培养基(生命线细胞技术,弗雷德里克博士)。所有的细胞都在37°C和5%孵化有限公司₂。稳定转染OSCC细胞行CAL27 MMP-9 /成分和SCC15 / MMP-9 /成分及其控制细胞转染与先前建立的控制向量基于慢病毒转染[艾滋病毒9]。

2.2。裸鼠肿瘤发展Tongue-Xenografted模型

所有动物保健条件和实验协议动物伦理委员会批准北京口腔医院,首都医科大学(批准号kqyy - 201708 - 004)。实验进行的实验动物中心北京牙科研究所、北京口腔医院,首都医科大学。老鼠被安置和维护在一个特定的无菌动物设施在12 h光/暗周期,和免费的食物和水。动物没有在任何阶段的实验经历不必要的痛苦。35 BALB / c裸小鼠(男性,年龄6周,平均体重19.5克)买来SPF(北京)生物技术有限公司有限公司(中国,北京),随机分为三组:A组(11/35):空白对照组,B组(12/35):接种CAL27 / MMP-9 shRNA细胞,和c组(12/35):接种CAL27 /控制细胞。裸体小鼠麻醉用1%戊巴比妥钠(默克公司,达姆施塔特,德国,50毫克/公斤,IP)和接种CAL27-transfected OSCC细胞(25μL在PBS, )在外侧区域的鼠标的舌头。裸体小鼠的身体重量测量每三天,和小鼠戊巴比妥钠腹腔注射安乐死37天(100毫克/公斤)接种后OSCC细胞。舌头和淋巴结样本在中立的福尔马林固定的苏木精和伊红())和免疫组织化学染色。类似的舌头还建立了原位异种移植模型使用SCC15 OSCC细胞系(SCC15 / MMP-9 /成分)。所有实验都按照制度执行的指导方针的动物保健和福利委员会北京口腔医院,首都医科大学。

2.3。组织病理学和免疫组织化学

肿瘤组织是嵌入在石蜡,切成5μ米厚片,然后沾)和评估在光学显微镜下观察(奥林巴斯、BX61、东京、日本)。免疫组织化学(包含IHC)执行每个抗体根据制造商的指示。简单地说,与10%山羊血清阻断后,一夜之间,部分被孵化在4°C主要抗体MMP-9 (ab19906 Abcam,剑桥,妈,美国1:200),RhoC (ab180785 Abcam 1: 200), Src (ab109381 Abcam 1: 100), Ki67 (A00052208, DAKO,丹麦,1:200)、血管性血友病因子(VWF) (A00042568, DAKO, 1: 200)和CK (kit - 009, Maixin、福州、中国)然后用相应的二次孵化抗体(kit - 5020, Maixin)。免疫组织化学染色法测定和平均光密度(MOD)值通过使用Image-Pro + 6.0软件( )。

2.4。免疫细胞化学

我们使用甲醇修复细胞种植在13毫米直径为10分钟,用玻璃10%山羊血清(ZSBiO,北京)阻止细胞为60分钟37°C。然后,一夜之间,样品被孵化在4°C主要抗体RhoC (ab180785 Abcam 1: 200),然后用二次孵化抗体(kit - 5020, Maixin) 30分钟。安装介质(Beyotime、厦门、中国)被用来挂载的样品到幻灯片,和图片是用显微镜(奥林巴斯,BX61)。

2.5。实时聚合酶链反应

试剂盒试剂(ComWin生物技术有限公司,北京,中国)被用来提取总RNA转染OSCC细胞,和超级RT cDNA合成装备(ComWin)被用来执行反转录反应。PCR进行使用ULtraSYBR混合物(低火箭)(ComWin)。人类RhoC底漆集(目录号:QRP20382)是由GeneCopoeia(罗克维尔市,医学博士,美国)。引物组GAPDH(向前,5CATGGGTGTGAACCATGAGAAGTAT-3 ;相反,5GACTGTGGTCATGAGTCCTTCCA-3 ),MMP-9(向前,5TGTACCGCTATGGTTACACTCG-3 ;相反,5GGCAGGGACAGTTGCTTCT-3 ),和Src(前锋,5ATCACCGCAAGAGCTACCAT-3 ;相反,5TGACGGTGTCCGAGGAGTTG-3 )被Sangon提供生物技术有限公司(上海,中国)。PCR结果分析使用方法。

2.6。西方墨点法

总蛋白提取转染OSCC细胞变性和加载在4 - 20%的丙烯酰胺凝胶(Bio-Rad大力神,CA)。电泳的蛋白质分离和转移到硝酸纤维素(Bio-Rad)。与5%脱脂牛奶阻塞后,膜是初级抗体孵育RhoC (ab180785 Abcam 1: 1000), Src (ab109381 Abcam 1: 25000), MMP-9 (ab137867 Abcam 1: 600),或GAPDH (M121107, HuaAn生物技术,杭州,中国,1:2000)。蛋白质乐队被检测到化学发光使用ECL试剂(热费希尔科学、沃尔瑟姆,MA)。

2.7。细胞迁移试验

转染细胞被播种在6-well板( )。达成的细胞融合后,我们使用了200年μL吸管提示做出直接在每个好伤口,然后删除了所有与PBS细胞碎片。细胞培养介质中含2%的边后卫在37°C公司5%₂。我们使用显微镜(奥林巴斯IX71) 40 x放大评估伤口关闭或填充在24小时和48小时。

2.8。内皮细胞粘附试验

CAL27 / MMP-9 shRNA细胞和CAL27 /控制细胞( )被添加到支流HUVECs ( )是生长在96 -菜37°C 5%股份有限公司₂。90分钟后,我们用PBS洗unadhered细胞。我们分析了用标贴壁细胞(分子器件、桑尼维尔CA)激发的580 nm和630 nm的发射滤波器。

2.9。Transendothelial迁移分析

HUVECs放入参议院(8μ米孔隙大小;康宁,康宁,纽约)的培养板插入。HUVECs达到融合之后,我们添加了( )CAL27 / MMP-9 shRNA细胞和CAL27 /控制细胞在37°C到参议院5%的股份有限公司₂。90分钟后,我们把细胞仍由棉花球上膜。我们统计的细胞通过众议院的HUVECs荧光显微镜(奥林巴斯,IX71)。

2.10。免疫荧光

我们使用的甲醇修复细胞种植在13毫米直径的玻璃10分钟。然后,细胞被封锁10%山羊血清(ZSBiO) 60分钟37°C。的f -肌动蛋白标记FITC-phalloidin (3.5μL (14μ500年M f -肌动蛋白稀释μL PBS)(丹佛市细胞骨架)被用来孵化样本30分钟,然后,样本与DAPI染色(Sigma-Aldrich、圣路易斯、钼)5分钟。安装介质(Beyotime)被用来挂载的样品到幻灯片,和图片是使用荧光显微镜(奥林巴斯,BX61)。

2.11。生物信息学分析

RhoC分析MMP-9的相关性,并在OSCC Src, TCGA数据分析(https://www.cancer.gov/about-nci/organization/ccg/research/structural-genomics/tcga)。341年OSCC原始数据下载,标准化数据TPM log2转换后的值。标准化的数据被应用于计算MMP-9, RhoC, Src OSCC mRNA水平。与R v3.6.1情节进行。

2.12。统计分析

所有实验数据进行了分析使用单向方差分析和卡方检验通过SPSS 25.0统计(IBM,阿蒙克,纽约)。数据被表示为 三个单独的实验。统计学意义是 。

3所示。结果

3.1。击倒MMP-9抑制肿瘤生长和扩散的裸鼠Tongue-Xenografted模型

进一步证实MMP-9 /成分的转移抑制作用并探索其潜在机制在活的有机体内,我们建立了裸鼠tongue-xenografted模型与CAL27 / MMP-9 /成分或SCC15 / MMP-9 shRNA细胞和各自的控制细胞。和MMP-9击倒效率/ shRNA-transfected细胞已经验证了实时聚合酶链反应和免疫印迹(图S1)。数据1(一)和1 (e)显示鼠标舌黏膜的组织学结构(圆)染色)。与空白对照组相比,注入CAL27 MMP-9 /成分或SCC15 / MMP-9 /成分细胞导致轻度至中度小鼠舌粘膜上皮发育不良。然而,与矢量控制细胞组相比,上皮细胞发育不良的程度减少MMP-9 / shRNA集团(数字1(一)和1 (e))。肿瘤细胞地区CAL27 / MMP-9 / shRNA或SCC15 / MMP-9 shRNA细胞组相比,在减少对照组)染色(图如图所示1 (b),1 (c),1 (f),1 (g))。此外,空白组的小鼠体重保持稳定(平均体重约为22 g CAL27-transfected细胞空白组和SCC15-transfected 24 g细胞空白组),和身体重量的裸体小鼠注射CAL27——或者SCC15-transfected细胞减少(平均体重约为17 g和18 g)与空白相比控制,但没有显著区别MMP-9 /成分和控制向量组(数字1 (d)和1 (h))。

我们还测试了MMP-9击倒的影响在异种移植肿瘤细胞增殖。首先,在CAL27 MMP-9 / MMP-9 /成分的表达和SCC15 / MMP-9 / shRNA tongue-xenografted肿瘤是通过包含IHC检测的。MMP-9的表达显著降低MMP-9 / shRNA组与shRNA相比对照组(数字2(一个)和2 (b))。此外,我们评估的影响MMP-9击倒在OSCC细胞增殖通过Ki67包含IHC染色。MMP-9击倒CAL27下降和SCC15细胞增殖(数字2 (c)和2 (d))。

这些数据表明,击倒MMP-9可能减少OSCC细胞增殖和tongue-xenografted肿瘤的生长在活的有机体内。

3.2。击倒的MMP-9抑制OSCC细胞内皮细胞之间的相互作用和异种移植肿瘤血管生成

为了检测MMP-9击倒对血管生成的影响,我们研究了之间的交互OSCC细胞和血管内皮细胞的粘附试验和transendothelial迁移试验在体外首先,检查了微血管形成的裸鼠tongue-xenografted模型。

OSCC细胞和血管内皮细胞之间的相互作用在肿瘤微环境进行调查的过程中通过添加转染CAL27细胞汇合的HUVECs。90分钟后,我们洗了独立的细胞;然后,我们在荧光显微镜观察到的细胞转染CAL27细胞HUVECs。简单地说,细胞的荧光值,坚持HUVECs比对照组下降到74.3%通过附着力测定内皮细胞(图3 (b))。

此外,我们添加了转染细胞的HUVECs附加到transwell上院。24小时文化之后,我们摧毁了所有的细胞都在参议院;然后,我们观察到荧光显微镜的细胞转染细胞HUVECs传递给下议院。细胞的数量通过HUVECs 24 h内显著降低从65.1 /字段(×400)对照组30.0场(×400)MMP-9 / shRNA集团通过transendothelial迁移试验(图3 (c))。

此外,我们也评估MMP-9击倒在OSCC细胞血管生成的影响通过VWF包含IHC染色在OSCC细胞异种移植肿瘤。结果表明,MMP-9击倒OSCC细胞减少血管生成(图3(一个))。

这些数据表明,击倒MMP-9可以减少OSCC细胞粘附的内皮细胞和内皮细胞之间transendothelial迁移和抑制OSCC细胞异种移植肿瘤血管生成,也证实了在SCC15细胞系(图S2)。因此,需要MMP-9 OSCC细胞穿过内皮完整的肿瘤微环境和血管生成。

3.3。建立OSCC细胞裸鼠Tongue-Xenografted淋巴结转移模型

由于口腔的特殊的解剖结构,丰富的血液供应,和淋巴回流,口腔癌症细胞迁移和入侵能力强,尤其容易早期淋巴结转移区域,导致低生存率和患者的不良预后。在我们的舌头小鼠OSCC细胞原位异种移植模型中,OSCC细胞CAL27 SCC15转染与MMP-9成分能够转移淋巴结在口腔附近,颈部和腋窝淋巴结,甚至远至腹股沟淋巴结。但是,没有转移OSCC细胞被发现在遥远的固体器官如肺、肝、肾脏。小鼠淋巴结很小,所以我们用反潘细胞角蛋白抗体(CK,上皮细胞的特征标记)来检测OSSC细胞转移到lymphonodi宫颈表面,腋窝淋巴结,并通过包含IHC腹股沟淋巴结。

3.4。击倒MMP-9抑制OSCC细胞迁移在体外

为了验证是否击倒MMP-9 OSCC细胞转移能力的影响,我们做了迁移试验在体外首先。我们发现击倒MMP-9可能减缓CAL27对照组细胞相对迁移率从24.8%到13.2% MMP-9 / shRNA组24小时,从49.1%到35.2%(图48 h4(一))。此外,细胞迁移试验也发现SCC15细胞系,结果是与CAL27细胞系(图一致4 (b))。这些数据进一步证明了MMP-9可能促进OSCC细胞的迁移和入侵的能力。

3.5。击倒MMP-9抑制OSCC细胞转移到Lymphonodi宫颈表面

此外,为了检测转移MMP-9 / shRNA-transfected细胞裸鼠tongue-xenografted模型,我们首先检查lymphonodi宫颈表面通过细胞角蛋白包含IHC)染色。转移的数量OSCC细胞lymphonodi宫颈表面的CAL27 MMP-9 /成分和SCC15 / MMP-9 / shRNA组与对照组相比显著降低如图所示通过国防部价值包含IHC染色(数字5(一个)和5 (b))。)染色显示肿瘤转移的lymphonodi宫颈表面。这种转移区域lymphonodi宫颈表面显著降低CAL27 / MMP-9 /成分的47.2%组和减少到60.5 SCC15 / MMP-9 shRNA组与对照组相比,分别为(数字5 (c)和5 (e))。此外,转移率也显著降低68.0% CAL27 / MMP-9 shRNA集团从对照组的97.2%减少到72.4%,SCC15 / MMP-9 / shRNA集团从对照组的96.7%(数据5 (d)和5 (f))。

3.6。击倒的MMP-9抑制OSCC细胞对腋窝淋巴结转移

接下来,我们检查了鼠标腋窝淋巴结转移。腋窝淋巴结的转移率显著降低MMP-9 /成分的72.0%组与对照组(100%)(图6 (b))。此外,腋窝淋巴结的转移性OSCC细胞数量显著减少从92.7到34.4(在控制MMP-9 / shRNA集团通过国防部价值包含IHC染色(图所示6(一))。推倒MMP-9基因表达shRNA也显著下降的存在SCC15腋窝淋巴结转移性细胞(图6 (c)(图)和转移率6 (d))。

3.7。击倒MMP-9抑制OSCC细胞转移到腹股沟淋巴结

我们检查了MMP-9基因击倒的影响不仅在附近的淋巴结转移方面而且在遥远的腹股沟淋巴结转移淋巴结。符合上述数据,腹股沟淋巴结的转移率显著降低到62.5% MMP-9 / shRNA组与对照组(91.7%)(图7 (b))。此外,腹股沟淋巴结的转移性CAL27细胞数量也显著减少MMP-9 / shRNA组与对照组相比,如国防部所示值取决于包含IHC染色(图7(一))。类似的结果也取得SCC15细胞tongue-xenografted模型(数据7 (c)和7 (d))。

总的来说,数据表明,击倒MMP-9抑制淋巴结转移的地方和遥远的地区通过抑制转移率和转移性OSCC细胞的数量。

3.8。击倒的MMP-9抑制OSCC细胞RhoC Src, f -肌动蛋白的表达在体外和在活的有机体内

上述结果表明,击倒MMP-9基因能有效抑制OSCC细胞迁移、增殖,内皮细胞之间的交互能力和抑制遥远和附近的淋巴结转移。进一步研究这种现象的潜在机制,我们评估RhoC的表达,Src,和f -肌动蛋白(肿瘤细胞转移的主要监管机构)在MMP-9 / shRNA-transfected OSCC细胞实时PCR,免疫印迹,包含IHC。我们发现击倒MMP-9可能下调RhoC Src RNA和蛋白质表达的实时PCR(图8(一个),图S3 (a)),免疫印迹(图8 (b),图S3 (b)),和免疫细胞化学(图8 (c),图S3 (c))在体外。此外,f -肌动蛋白表达也显著减少MMP-9 / shRNA组与对照组相比如图所示通过免疫荧光染色(图国防部价值8 (d),图S3 (d))。

CAL27或SCC15 / MMP-9 shRNA tongue-xenografted肿瘤,RhoC和Src的表达也减少MMP-9 / shRNA组与对照组相比,观察到包含IHC染色(数字9(一个)- - - - - -9 (d)),这是一致的在体外数据。

这些数据表明,击倒MMP-9表达可能下调RhoC, Src,在OSCC f -肌动蛋白的表达。

3.9。MMP-9、RhoC和Src在OSCC积极和线性相关

TCGA在肿瘤研究中最丰富的和权威的数据库。为了进一步探索MMP-9的相关分析,RhoC, Src表达式,我们分析了MMP-9的相关性,RhoC, Src mRNA表达TCGA根据OSCC样本数据库。在OSCC,积极和线性MMP-9 RhoC协会(图10 ()),MMP-9和Src(图10 (b)),和RhoC Src(图10 (c))观察mRNA的表达。在一起,我们的研究结果表明,MMP-9起着非常重要的作用在OSCC入侵和淋巴结转移,和其潜在的机制可能是由RhoC和Src基因表达。

4所示。讨论

MMP-9癌症发展和发展中扮演着重要角色,在许多类型的肿瘤转移相关的恶性肿瘤(10- - - - - -14]。此外,删除MMP-9基因的报道推迟肿瘤发病或抑制肿瘤恶化在许多癌症的转基因小鼠模型15- - - - - -19]。这些研究结果与我们的数据是一致的。MMP-9起着关键作用的早期阶段肿瘤入侵,退化的主要功能和重塑ECM的体内平衡。ECM的降解是一个重要的肿瘤转移的机制。OSCC容易发生颈部淋巴结转移,发生在大约40%的情况下,即使在早期阶段(20.]。在这些裸鼠tongue-xenografted模型,击倒MMP-9可以显著抑制OSCC细胞转移lymphonodi宫颈表面,腋窝淋巴结,甚至腹股沟淋巴结。我们的数据证实,MMP-9在OSCC进展中起着关键作用在淋巴结转移的早期阶段。

血管生成是一个主要的机制参与肿瘤转移。MMP-9通常是表达血管生成地区(21],它可以刺激肿瘤血管生长因子的释放和/或激活沉积proangiogenic因素(如VEGF),从而招募血管内皮细胞(22和周23,24血管生成所需),导致在肿瘤血管生成。我们的研究显示,击倒的MMP-9会抑制OSCC细胞与血管内皮细胞之间的交互在体外和抑制血管生成在裸鼠tongue-xenografted肿瘤。我们的研究间接证实了促进MMP-9对肿瘤血管生成的影响。

MMP-9击倒抑制口腔癌细胞浸润和转移不仅通过抑制OSCC细胞增殖、迁移、血管内皮细胞粘附和肿瘤血管生成也通过抑制其他metastasis-related因素,如RhoC和Src基因。我们进一步的机械的研究表明,击倒MMP-9抑制RhoC, Src基因的RNA和蛋白质表达在活的有机体内和在体外。此外,生物信息学分析表明,MMP-9 RhoC, Src mRNA表达积极和线性相关性在OSCC TCGA数据库。RhoC, Rho-GTP家族的一员,是一个关键的中介的肿瘤细胞迁移和入侵。据报道,RhoC过度可能预测淋巴结转移和预后不良。其他研究已经表明,删除RhoC减少肿瘤细胞的能力遵守内皮细胞的能力,抑制肿瘤细胞诱导内皮细胞连接口(25]。Src家族激酶广泛表达于人类细胞,激活Src异常的蛋白质能促进肿瘤细胞增殖和转移的重组和影响癌症细胞的细胞骨架。MMP-9击倒抑制不仅Src的表达,而且f -肌动蛋白的表达,细胞骨架蛋白。

肿瘤细胞转移是一个多步骤的过程涉及到ECM的降解,细胞迁移和入侵,癌细胞粘附内皮细胞,血管生成和转移病灶的形成(26,27]。我们的研究结果提供了令人信服的证据表明,击倒MMP-9在OSCC具有肿瘤抑制作用,特别是MMP-9施加一个明确的抑制作用在小鼠淋巴结转移。MMP-9的潜在机制可能与抑制一个多步过程涉及多个途径,如RhoC和Src信号通路。尽管我们发现RhoC、Src和f -肌动蛋白作为MMP-9的潜在目标,仍需要进一步的研究来阐明如何MMP-9调节其下游基因表达级联。

5。结论

总之,我们的研究暗示击倒的MMP-9可以显著抑制OSCC细胞的恶性生物学行为,如移民、转移能力,和ECs通过多个途径或机制之间的相互作用。此外,击倒MMP-9可以显著抑制OSCC细胞异种移植肿瘤的生长,增殖,淋巴结转移、血管生成在裸鼠tongue-xenografted模型。和机械的进一步研究发现,击倒的MMP-9可能由RhoC和Src信号通路的表达。

缩写

MMP-9:	基质金属蛋白酶9
OSCC:	口腔鳞状细胞癌
EMT:	Epithelial-mesenchymal过渡
ECs:	血管内皮细胞
ECM:	细胞外基质
HUVECs:	人类脐静脉内皮细胞
包含IHC:	免疫组织化学
VWF:	血管性血友病因子
CK:	反人类细胞角蛋白。

数据可用性

所有必要的材料可以在文本或补充材料。

伦理批准

所有涉及实验动物进行通过制度准则的动物保健和福利委员会北京口腔医院,首都医科大学实验动物中心,开展北京牙科研究所、北京口腔医院,首都医科大学。动物保健和协议都是动物伦理委员会批准北京口腔医院,首都医科大学(批准号kqyy - 201708 - 004)。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

PY执行主要的实验和数据分析和写的手稿。XZ本研究设计和指导实验。y、SC JW, FG, YW执行的一些实验。XZ修订后的手稿。所有作者贡献的解释结果,编辑和批准最后的手稿。

确认

这项工作得到了国家自然科学基金的研究资助中国自然科学基金(81772868)和北京(中国)(7202057)。我们感激地承认的专家帮助Zhenchuan田在动物实验中从北京口腔医院和口腔学学院,首都医科大学。

补充材料

在OSCC细胞图S1: MMP-9基因击倒。(一)MMP-9 / shRNA转染抑制通过rt - pcr MMP-9 mRNA的表达。 ,与对照组相比。(b) MMP-9表达的蛋白质水平被免疫印迹检测。图S2:击倒MMP-9抑制OSCC细胞之间的相互作用的ECs和异种移植肿瘤血管生成。(一)MMP-9 /成分包含IHC转染抑制微血管密度(MVD)。(b)击倒MMP-9可以减少细胞transendothelial ECs之间的迁移。(c)击倒MMP-9可以减少细胞粘附ECs的附着力试验。所有的数据都显示为 。 ,与对照组相比。图S3: MMP-9抑制RhoC击倒,Src, f -肌动蛋白的表达在体外。(一)RNA的表达RhoC和Src SCC15-transfected rt - pcr的细胞。(b)蛋白表达的RhoC和Src在SCC15-transfected细胞免疫印迹。(c)击倒MMP-9抑制RhoC表达的免疫细胞化学。(d) MMP-9 / shRNA转染减少phalloidin通过免疫荧光染色。所有的数据呈现的 。 ,与对照组相比。(补充材料)

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