糖尿病肾病的MRC2促进增殖和抑制细胞凋亡

文摘

糖尿病肾病(DN)是一个重要的微血管并发症的糖尿病终末期肾病的主要原因。2型甘露糖受体C (MRC2)是甘露糖受体蛋白家族的一员,已被证实能够促进细胞迁移信号通路和入侵。通过互补DNA芯片的筛选和分析,我们发现MRC2的表达调节与糖尿病肾病小鼠的肾脏。然而,MRC2在糖尿病肾病中的作用尚不清楚。本工作研究了MRC2对糖尿病肾病的影响。后验证芯片结果定量实时聚合酶链反应和免疫印迹(存在),我们使用小干扰rna (siRNAs)击倒MRC2在小鼠系膜细胞的表达(间),分析了使用免疫印迹细胞增殖和细胞凋亡,细胞计数Kit-8,流式细胞术。结果表明,MRC2击倒抑制MMC增殖和诱导细胞凋亡。这些结果表明,MRC2可能是一个分子标记和糖尿病肾病的治疗目标。

1。介绍

糖尿病肾病(DN)是一个重要的微血管并发症的糖尿病终末期肾病的主要原因。DN患者糖尿病的患病率是20% - -40%1]。大约30%的1型糖尿病患者和20%的2型糖尿病患者开发DN,终末期肾病占大约50%的死于慢性肾脏疾病的主要原因2]。其发病机制复杂,许多因素密切相关,如氧化应激、细胞增殖,炎症反应,葡萄糖和脂质代谢紊乱和遗传易感性3,4]。系膜细胞是最影响细胞在DN三角high-glucose条件下增殖。同时,他们分泌大量的细胞因子,合成大量的系膜增殖,导致肾小球肥大,肾小球基底膜增厚,细胞外基质(ECM)的积累,最终导致肾小球硬化症(5]。目前,DN治疗主要是控制低血糖,血压、血脂调节,但其疗效是有限的;因此,探索肾小球系膜细胞增殖的分子机制了解DN和发展非常重要,这将有利于寻找潜在的治疗靶点。

2型甘露糖受体C (MRC2),也称为uPARAP / Endo180,属于甘露糖受体家族。其细胞外域分为三部分,包括cysteine-rich域,一个II型纤连蛋白(FnII)领域,从氨基和8 c -型lectin-like域6,7]。研究表明,氨基cysteine-rich MRC2领域可能调解protein-carbohydrate或蛋白质-蛋白质之间的关系。FnII域通常是与胶原蛋白绑定。MRC2包括的主要角色造成的ECM重塑其FnII域之间的交互和胶原蛋白,能够促进细胞迁移信号通路和入侵8]。一些研究表明,胶原蛋白三维矩阵的流动率是肿瘤细胞增殖的关键调节器9]。MRC2胶原蛋白的中心组件销售量是由许多间充质细胞。研究发现,MRC2调节在神经胶质瘤的表达,乳腺癌,前列腺癌和其他癌症组织(10]。然而,很少有研究和报告在DN的监管。之前我们小组研究了MRC2表达式在DN小鼠模型使用排序(11),结果表明,在DN MRC2老鼠的表达明显高于正常小鼠。因此,我们推测,MRC2可能影响DN的发生和发展。

2。材料和方法

2.1。化学药品和试剂

胎牛血清,杜尔贝科修改鹰的媒介,penicillin-streptomycin溶液,0.25%胰蛋白酶买来Gibco(马、美国)。Lipofectamine™2000和试剂盒获得表达载体(马、美国)。qPCR HiScript三世RT SuperMix (+ gDNA雨刷)是获得Vazyme生物技术(中国南京)。抗体如下:anti-GAPDH抗体(1:5000年,ab8245 Abcam) anti-tubulin抗体(1:2000;ab7291 Abcam) anti-cyclin D1抗体(1:2000;26939 - 1 - ap Proteintech) anti-proliferating细胞核抗原(PCNA)抗体(1:1000;ab29 Abcam)和anti-MRC2抗体(1:2000;热费希尔pa5 - 50956)。辣根peroxidase-conjugated anti-rabbit免疫球蛋白G(免疫球蛋白;1:10000年,Proteintech)和anti-mouse免疫球蛋白g(1: 10000年,Proteintech)被用作二次抗体。 A protein extraction kit was from Beyotime Biotechnology (Beijing, China). Cell Counting Kit-8 was purchased from Dojindo (Tokyo, Japan).

2.2。病人和临床标本

怀安的患者第一人民医院隶属于南京医科大学从2019年11月到2020年9月被分成两组。第一组由21个DN患者(13个男性和8个女性,平均年龄 岁)。此外,21个健康受试者接受了体检同时被选为健康对照组(12男性和9个女性,平均年龄 岁)。剩下的两组外周血样本收集。根据指示,从样本中提取总RNA使用试剂盒(表达载体、马、美国),和互补脱氧核糖核酸合成使用HiScript三世RT SuperMix qPCR (Vazyme生物技术,南京,中国)和存储在-80°C。这项研究是经医院伦理委员会批准(伦理批准文号yx - 2020 - 004 - 01)。

2.3。动物模型

八周大具体的无菌,肥胖,2型糖尿病动物模型BKS-Leprem2Cd479 / Gpt老鼠和BKS-Leprem2Cd479 / Gpt控制老鼠购自南京大学模式动物研究中心(中国南京)。老鼠一周允许适应,和参数如血糖、体重、尿液体积和24小时尿白蛋白测定。小鼠的肾组织被移除和苏木精和伊红染色())来确认DN的诊断。项目批准的动物保健和怀安第一人民医院伦理委员会,南京医科大学(伦理批准文号dw - p - 2020 - 002 - 01),和所有过程坚持动物保健指南。

2.4。细胞培养和转染

小鼠系膜细胞(间)购买从中国科学院上海细胞库。模拟非糖尿病患者和糖尿病条件下,间质在杜尔贝科修改鹰的培养介质(DMEM) / F-12(3: 1)完全培养基的葡萄糖浓度5更易/ L(低糖组)和25更易/ L (high-glucose组)含5%胎牛血清,100 U /毫升青霉素,100μg / mL链霉素(12]。3 - 8通道的实验进行了well-growing间。

小干扰rna (siRNAs)对MRC2 (si-MRC2 1和si-MRC2 2)和消极的控制(si-NC)设计并合成了RiboBio(广州)。间被接种到6-well文化在密度板 细胞/。根据制造商的指示,siRNAs和si-NCs转染到细胞Lipofectamine 2000(英杰公司)在无血清培养基和孵化6 h;然后转染是通过改变完全培养基终止。文化,48 h后收集细胞进行进一步分析。

2.5。他染色和免疫组织化学

鼠标控制的肾组织和DN组与4%多聚甲醛固定石蜡和嵌入。蜡块切成薄片,每5 - 8μ米厚。片在二甲苯脱蜡和乙醇,然后沾)。免疫组织化学,切割片与二甲苯脱蜡和乙醇,洗干净的水一段时间,然后阻止抗原,抗体和血清封闭,浸泡在一个主和二次抗体最后显色剂。随后,幻灯片用干净的水清洗,浸泡在苏木精染色,清洗和干燥。准备的幻灯片被使用显微镜观察和分析。

2.6。免疫荧光分析

间被接种到24-well文化在密度板 细胞/。间和4%多聚甲醛固定,特里同x - 100处理0.1%,封锁在5%山羊血清的解决方案。然后,细胞主要抗体孵育MRC2一夜之间在4°C,然后孵化与二级抗体标记cy3室温1 h。电影是密封与DAPI染色后(4 ,6-diamidino-2-phenylindole)。

2.7。RNA分离和定量实时PCR

间被接种到6-well文化在密度板 细胞/。根据制造商的指示,siRNAs si-NCs转染到细胞。总RNA提取的MMC细胞系,临床血液样本,小鼠肾组织使用试剂盒试剂(英杰公司)根据制造商的指示。被用来获得的RNA合成互补DNA(互补)的第三HiScript RT SuperMix qPCR (+ gDNA雨刷)(Vazyme生物技术,南京,中国)。的ChamQ SYBR qPCR主混合(没有火箭;Vazyme生物技术)是用于执行定量实时聚合酶链反应(存在)使用罗氏LightCycler 480(瑞士罗氏公司)。使用的引物如下(h表示人类,和m表示鼠标):

GAPDH-F (h): 5 - - - - - -AAGACGGGCGGAGAGAAACC-3

GAPDH-R (h): 5 - - - - - -CGTTGACTCCGACCTTCACC-3

MRC2-F (h): 5 - - - - - -CCGAAACCGGCTATTCAACCT-3

MRC2-R (h): 5 - - - - - -CGGTCACACTCATACATGCCC-3

β-Actin-F (m): 5 - - - - - -GTGACGTTGACATCCGTAAAGA-3

β-Actin-R (m): 5 - - - - - -GCCGGACTCATCGTACTCC-3

MRC2-F (m): 5 - - - - - -TCTCCCGGAACCGACTCTTC-3

MRC2-R (m): 5 - - - - - -AACTGGTCCCCTAGTGTACGA-3

2.8。细胞增殖实验

间有不同的治疗被播种在96 - 2000孔板的密度/,和三个复制井用于每组。细胞培养在孵化器(5%股份有限公司₂在37°C)为0,24日,48岁,72年,和96 h,细胞增殖是用细胞计数Kit-8 (CCK-8;Dojindo分子技术,东京,日本),根据制造商的指示。

2.9。细胞周期实验

治疗细胞接种到six-well板的密度 细胞/。经过24小时的文化,收集细胞悬液,用75%乙醇固定,存储在一个流管在-20°C。ethanol-fixed细胞悬液然后在350 g离心5分钟。上层清液被免职,颗粒与磷酸盐清洗三次。使用碘化propidium细胞被染色。染色细胞的一部分(0.5毫升)的解决方案是远离光1 h在室温和过滤使用300μ米网过滤膜的细胞群。每个实验重复三次。从20000个细胞的荧光数据收集和分析使用FlowJo V10。

2.10。蛋白质的提取和免疫印迹分析

间有不同的治疗被播种在6-well板的密度 /好。提取总蛋白的小鼠肾组织和间质用冰冷的radioimmunoprecipitation化验(里帕)裂解缓冲含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂(Beyotime生物科技、上海、中国)严格按照制造商的协议。每车道(16 - 20毫克)等量的蛋白质被加载到10%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳根据不同分子量和转移到聚偏二氟乙烯膜。抗体如下:anti-GAPDH抗体(1:5000年,ab8245 Abcam) anti-tubulin抗体(1:2000;ab7291 Abcam) anti-cyclin D1抗体(1:2000;26939 - 1 - ap Proteintech) anti-proliferating细胞核抗原(PCNA)抗体(1:1000;ab29 Abcam)和anti-MRC2抗体(1:2000;热费希尔pa5 - 50956)。辣根peroxidase-conjugated anti-rabbit免疫球蛋白G(免疫球蛋白;1:10000年,Proteintech)和anti-mouse免疫球蛋白g(1: 10000年,Proteintech)被用作二次抗体。 The sizes of the protein bands were quantified using the ImageJ software.

2.11。细胞凋亡检测

间有不同的治疗被播种在6-well板的密度 /好。进行细胞凋亡测定用FITC膜联蛋白V凋亡检测设备(BD生物科学、钙、美国)。检测到凋亡细胞的比例在每个阶段使用FACSCalibur (BD生物科学)。

2.12。统计分析

使用SPSS 22.0软件对实验数据的统计分析,提出 。学生的 - - - - - -测试应用于分析实验涉及两组,而单向方差分析申请试验不少于三组。 被认为是具有统计学意义。

3所示。结果

3.1。MRC2是DN患者的外周血样本中高度表达的DN

研究MRC2的差异表达,没有DN患者,我们在外围血液样本中存在进行化验。结果表明,表达MRC2 DN患者的外周血中显著高于健康受试者( ;图1(一))。

3.2。MRC2在DN小鼠模型

探索的表达MRC2 DN肾脏的老鼠,我们进行免疫组织化学染色。结果表明,老鼠的肾脏MRC2 DN的表达明显高于对照组( ;图2(一个))。西方墨点法和存在实验被用来检测MRC2水平正常小鼠和DN模式。结果表明,小鼠肾组织的表达MRC2 DN显著高于对照组( ;数据1 (d)和1 (e))。

3.3。MRC2表达在高Glucose-Induced间调节

间被培养在低葡萄糖(5.5更易/ L)和高葡萄糖(25更易/ L)来模拟正常和糖尿病生理环境。存在试验结果表明,该表达式MRC2显著增加细胞的培养与高葡萄糖。此外,我们发现相同的结果通过西方墨点法提取蛋白质从细胞暴露在低和高葡萄糖( ;数据1 (b)和1 (c))。类似地,上述结果也符合我们的免疫荧光实验( ;图2 (b))。

3.4。MRC2参与间的扩散

我们执行CCK-8试验探索MRC2在细胞增殖的作用。结果表明,MRC2击倒组的细胞增殖率低于对照组( ; ;图3(一个))。此外,我们发现MMC增殖细胞核抗原、细胞周期蛋白D1的表达,这是增殖的指标,减少MRC2击倒后用免疫印迹( ; ;数据3 (b)和3 (c))。上述数据表明MRC2促进细胞增殖,促进DN的发展。

3.5。MRC2改变了细胞周期进程间

分析细胞周期进程的控制和MRC2击倒组织透露,S期细胞的比例(DNA复制阶段)在实验组与对照组相比显著升高( ),在G0 / G1期细胞的比例(完成有丝分裂之间的差距和DNA复制)持平( ),和G2 / M期细胞的比例低于对照组( ;图4(一))。这表明,细胞周期进展MRC2击倒后而耽搁了。

3.6。MRC2抑制间的细胞凋亡

流式细胞术结果显示MRC2击倒组的凋亡细胞的数量明显高于对照组( ; ;图4 (b))。因此,西方墨点法是用来检测细胞凋亡的蛋白表达水平caspase-3标志。结果表明,浓度的裂解caspase-3显著高于对照组MRC2击倒后,表明MRC2可能在抑制细胞凋亡中发挥作用。

4所示。讨论

DN是一种常见的临床并发症的糖尿病,DN的早期诊断和治疗是至关重要的。目前,最常用的生物标志物检测的DN是蛋白尿。然而,研究表明,微蛋白尿不能准确反映DN的发生(13];因此,它具有十分重要的意义,进一步探索分子标记和治疗DN的目标。

MRC2,甘露糖受体蛋白家族的一员,主要是表达的间充质细胞如成纤维细胞和成骨细胞,存在于网站显示活跃的组织重构(10]。MRC2可以绑定和内化完好无损,降解胶原蛋白,然后参与胶原蛋白在细胞膜和ECM的更新。它的主要功能是促进成纤维细胞胶原蛋白和加速的初始粘附迁移的成纤维细胞胶原纤维矩阵,从而促进细胞扩散(14]。时至今日et al。15)发现MRC2肝细胞癌的表达显著高于在paracancerous组织。它促进肝癌细胞的迁移和入侵调解细胞内胶原蛋白的降解,可作为肝细胞癌患者的预后指标。董et al。16]发现MRC2的表达增加发展中骨骼和胶原蛋白分解的病原反应步骤的过程中成长。研究发现,MRC2是调节的表达在乳腺癌和前列腺癌等癌症,在骨关节炎和类风湿性关节炎等疾病7,17]。然而,很少有研究在MRC2 DN。前我们组的测序结果表明MRC2 DN肾组织的表达小鼠模型明显高于正常组织(18]。因此,我们推测,这可能是与DN的发生和发展有关。

在这项研究中,我们发现的表达水平MRC2 DN患者的外周血高于健康者。我们培养间高和低葡萄糖模拟生理环境正常和糖尿病的条件。存在和免疫印迹分析表明MRC2的表达在细胞暴露于高葡萄糖调节。在类似的方式,我们发现其控制和DN小鼠肾组织的表达,发现其表达也增加肾组织的DN老鼠。我们进行了免疫组织化学和细胞免疫荧光实验进一步验证这些结果。我们的结果与测序和提到的实验结果一致。

进一步研究MRC2的功能,我们构造的两种类型的siRNAs间击倒MRC2的表达,探讨在DN MRC2对细胞增殖和凋亡的影响。CCK-8结果表明,增长率的间质与MRC2击倒低于对照组。此外,免疫印迹分析表明,细胞周期蛋白D1和PCNA蛋白表达,细胞增殖的标记,减少,酶切半胱天冬酶的表达MRC2击倒后增加。同样,我们使用流式细胞仪检测的影响MRC2间质细胞凋亡和细胞周期。结果表明,MRC2击倒后,凋亡细胞的比例增加,G0 / G1期细胞的比例保持不变,S期细胞的比例增加,和G2 / M期细胞的比例减少,从而导致细胞逮捕。

5。结论

总之,我们的研究表明,MRC2的表达增加DN患者的外周血,间质培养高葡萄糖,和DN老鼠的肾脏。MRC2基因敲除可以抑制间的增殖和诱导细胞凋亡。我们进行了一项初步研究在糖尿病肾病MRC2,这可能提供一种新的分子生物标志物和治疗DN的发生和发展的目标。

缩写

MRC2:	2型甘露糖受体C
DN:	糖尿病肾病
间:	小鼠系膜细胞
DMEM:	杜尔贝科修改鹰的媒介
存在:	定量实时聚合酶链反应
PCNA:	增殖细胞核抗原
里帕:	Radioimmunoprecipitation化验
CCK-8:	细胞计数Kit-8
):	苏木精和伊红。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的结果包括在本文中。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

确认

这项研究得到了国家自然科学基金资助下的中国81800644,江苏卫生委员会授予H201458,怀安格兰特HAA201744下533人才项目。

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