GTSE1促进肺癌细胞的恶性表型通过激活一种蛋白激酶/ mTOR信号

文摘

G2的表达和S phase-expressed-1 (GTSE1)是调节在人类癌症。然而,它的表达和角色在肺癌还没有被确认。在我们的研究中,我们报道了GTSE1肺组织的表达在统计学上高于相邻的非癌变组织中可能的结果hypomethylation GTSE1启动子。调节GTSE1 mRNA的表达预测较弱的肺癌患者的生存。异位表达的GTSE1肺癌细胞显著增加而击倒GTSE1减少细胞增殖,细胞迁移,细胞入侵H460和A549细胞。此外,击倒GTSE1监管H460细胞周期和促进细胞凋亡和A549细胞。最后,我们提出了GTSE1能够激活H460 mTOR / AKT信号和A549细胞。总之,这些结果表明,过表达GTSE1参与了肺癌的进展通过促进扩散迁移和入侵和抑制细胞凋亡的肺癌细胞通过激活一种蛋白激酶/ mTOR信号。

1。介绍

肺癌是世界范围内最常见的和致命的癌症之一(1,2]。肺癌主要是启动多种因素包括吸烟、遗传因素、石棉、氡气、和空气污染3,4]。目前肺癌的治疗方法包括激光消融的恶性病变,手术、化疗、光动力治疗,放射治疗(5]。因此,新目标的识别肺癌预后预测和治疗具有十分重要的意义。

G2和S phase-expressed-1 (GTSE1)在染色体22 q13.2-q13.3表达细胞周期年代和G2阶段(6,7]。它的常见的分子功能是绑定到肿瘤抑制蛋白p53和阻碍p53在癌症的癌症抑制能力8]。一些研究的进一步报道,upregulation GTSE1经常被发现在多种人类癌症9,10]。Upregulation GTSE1促进细胞增殖和细胞迁移和入侵在肝细胞癌的进展11]。在胃癌细胞,GTSE1表达抑制凋亡信号和赋予抵抗顺铂(12]。GTSE1抑制顺铂敏感性通过p53的过度凋亡信号在胃癌(12]。已经证实,GTSE1was增加肺癌的表达,和其高表达的组织学类型有密切的关系(13]。然而,预后和角色GTSE1尚未研究肺癌的发展。

在这项研究中,我们证明了GTSE1调节,在肺癌与更糟的结果。异位表达GTSE1提拔而击倒GTSE1抑制增殖、迁移和入侵肺癌细胞A549和H460。删除GTSE1调节细胞周期,并引发细胞凋亡在A549和H460细胞线。我们认为GTSE1可能会产生上述生物功能通过激活一种蛋白激酶/ mTOR信号通路在肺癌。

2。材料和方法

2.1。组织标本

肺癌组织和邻近的非癌变组织收集肺癌患者从附属杭州第一人民医院、浙江大学医学院。本研究经伦理委员会批准的附属杭州第一人民医院、浙江大学医学院。书面知情同意了所有的参与者。

2.2。数据挖掘和分析

在线癌症基因芯片数据库,Oncomine (http://www.oncomine.orgTCGA),数据库被用来评估肺癌GTSE1转录水平与正常对照组的学生的 - - - - - -测试。

2.3。生存分析

kaplan meier生存曲线与风险比(人力资源),logrank值( ),和95%可信区间(CI)进行了分析和使用kaplan meier绘图仪绘制(http://kmplot.com)平台和Xen平台,集成了基因表达数据,不复发,TCGA(癌症基因组图谱),EGA(欧洲Genome-phenome存档),从地理和整体生存信息(基因表达综合)。

2.4。细胞培养和转染

肺癌细胞系(H146, H82, H460、A549和H460)和人类正常的肺上皮细胞系(Beas-2b)培养RPMI 1600年增加了10%的胎牛血清(的边后卫)湿润孵化器有限公司为5%₂在37°C。

2.5。慢病毒感染

GTSE1过表达和控制使用的慢病毒空载体来自GeneChem(上海,中国),和lenti-shRNA GTES1击倒和争夺成分合成GenePharma(上海,中国)。慢病毒产品是前面描述的14]。

2.6。细胞增殖实验

细胞增殖是评估使用CCK8计算工具包(Promega)。这些细胞被均匀播种在96孔板的密度 ,和的OD值细胞在450 nm波长测量同时连续5天来评估细胞的可行性。

2.7。集落形成实验

细胞数量统计,细胞被播种与300细胞/ six-well板。细胞培养2周后,殖民地固定使用甲醇,与5%结晶紫染色,计数。

2.8。伤口愈合实验

细胞融合在6-well盘子被播种到90%。融合性的层被刮花了200μl吸管产生伤口。PBS的碎片和漂浮细胞被洗。细胞培养24小时和48小时,伤口愈合。照片拍摄在0小时,24小时和48小时。

2.9。Transwell入侵检测

细胞的入侵活动使用transwell迁移试验检测。简单,细胞培养基含有10%的边后卫被添加到众议院。转导后,细胞被播种到transwell的参议院。侵入性细胞在下议院固定使用甲醇,与5%结晶紫染色,在显微镜下成像。

2.10。细胞周期和细胞凋亡分析

根据制造商的指示,细胞周期和细胞凋亡进行了分析通过使用PI染色设备和Annexin-V-FITC / PI染色工具包(表达载体),分别。染色后,分析了细胞用流式细胞分析仪(CytoFlex,贝克曼库尔特,富勒顿、钙、美国)。

2.11。统计分析

所有使用SPSS 22.0统计分析(SPSS Inc .,芝加哥,IL)。给出的值 。组之间的差异被学生的分析 - - - - - -测试或单向方差分析。值< 0.05被认为是具有统计学意义。

3所示。结果

3.1。GTSE1 mRNA水平肺癌的预后价值

通过咨询Oncomine数据库,我们发现GTSE1的mRNA水平在肺癌组织中高于正常肺组织。GTSE1的mRNA水平升高在鳞状细胞肺癌和肺腺癌与正常肺组织(褶皱变化:分别为6.204和3.068,)(图1(一))。从TCGA数据库,我们证明GTSE1增加的水平相比,肺癌组织与正常肺组织。TCGA数据库显示,GTSE1表达式也增加了在肺肿瘤样本(图1 (b))。通过TCGA数据库,我们还发现,GTSE1启动子的甲基化水平显著降低(图1 (c))。我们认为的hypomethylation GTSE1启动子可能是负责其高表达。kaplan meier绘图仪分析数据库显示,高GTSE1表达预测贫穷的肺癌患者的总生存期(图1 (d))。因此,GTSE1 mRNA表达可以作为肺癌患者预后的标志。

3.2。GTSE1调节肺癌样本和细胞系

调查GTSE1在肺癌细胞系的表达,每样的信使核糖核酸(mRNA)水平GTSE1肿瘤样本和相应的正常组织被rt - pcr检测。的mRNA水平GTSE1显示显著upregulation肺癌细胞系(H146, H82, H460、A549和H460)与Beas-2b细胞系。依照mRNA水平变化,免疫印迹试验表明GTSE1的蛋白质含量显著增加在这些细胞系(H146, H82, H460、A549和H460)而Beas-2b细胞系(图2 (b)),特别是在A549和H460细胞。此外,我们发现了GTSE1 mRNA表达水平在肺癌肿瘤组织。从图可以看出2 (c),GTSE1的mRNA水平显著增加3配对癌症组织与非癌变组织。一致,蛋白免疫印迹分析还揭示了蛋白质含量的显著增加GTSE1(图2 (d))。所有这些数据表明GTSE表达调节肺癌细胞系和组织样本。

3.3。异位表达GTSE1促进增殖、入侵和肺癌细胞A549和H460的迁移

探索功能GTSE1肺癌细胞系,lentivirus-mediated表达系统采用稳定GTSE1 A549和过表达H460细胞。我们两个细胞系验证GTSE1的过度使用世行分析(图3(一个))。CCK8试验表明,细胞增殖是由GTSE1超表达(图3 (b))。集落形成试验的结果表明,过度的GTSE1 A549的菌落数量增加和H460细胞系(图3 (c))。伤口愈合试验表明,过度的GTSE1促进了A549和H460细胞的迁移(图3 (d))。transwell入侵分析表明,过表达GTSE1显著增加A549和H460细胞入侵(图3 (e))。这些结果表明GTSE1可以促进扩散,集落形成,在肺癌细胞迁移和入侵。

3.4。击倒的GTSE1抑制增殖、入侵和肺癌细胞A549和H460的迁移

为了进一步证实GTSE1的癌基因作用,GTSE1 shrna由慢病毒基因沉默的H460和A549细胞株。我们验证的寂静GTSE1 A549和H460细胞系利用世行分析(图4(一))。CCK8试验的结果表明,细胞增殖抑制(图差别GTSE1对这些4 (b))。集落形成试验,低表达GTSE1抑制A549的菌落数量和H460细胞(图4 (c))。伤口愈合试验表明,低表达GTSE1 A549和H460细胞的迁移能力下降(图4 (d))。transwell入侵分析提出,沉默GTSE1显著地抑制A549的入侵和H460细胞(图4 (e))。这些结果表明,沉默GTSE1表达抑制增殖,集落形成、入侵和肺癌细胞的迁移。

3.5。删除GTSE1监管H460细胞周期和诱导细胞凋亡和A459细胞系

接下来,我们探讨了GTES1对细胞周期和细胞凋亡的影响H460 H460细胞线。如图5、细胞周期和细胞凋亡被流仪测量分析。沉默的年代GTSE1抑制细胞周期,抑制H460细胞周期和A549细胞(数字5(一个)和5 (b))。沉默的GTSE1 H460和A549细胞的诱导细胞凋亡(数字5 (c)。这些结果表明,沉默GTSE1表达调控细胞周期和诱导细胞凋亡在H460和A549细胞株。

3.6。GTSE1抑制p53表达和AKT激活/ mTOR信号H460 A459细胞系

调查潜在的分子机制GTSE1调节肺癌细胞的恶性表型,我们发现肿瘤信号通路的激活。我们的数据显示,过度的GTSE1显著下调p53蛋白水平和促进了一种蛋白激酶的磷酸化和mTOR H460 A549细胞株(图6(一))。因此,沉默GTSE1显著上调p53蛋白水平和抑制一种蛋白激酶的磷酸化和mTOR H460 A549细胞株(图6 (b))。这些结果表明,GTSE1能够抑制p53表达和激活一种蛋白激酶/ mTOR在肺癌细胞信号。

4所示。讨论

不同基因的异常表达在许多癌症类型和探索发挥重要作用在癌症发展15- - - - - -18]。在这项研究中,我们报告的表达GTSE1在肺癌组织和细胞,增强我们认为的hypomethylation GTSE1启动子可能是负责其高表达。调节GTSE1是离不开肺癌的预后。此外,扩散,入侵,H460的迁移和A549肺癌细胞得到异位表达GTSE1 GTSE1而被击倒的抑制。我们的研究结果表明,GTSE1可能函数作为一个致癌引发肺癌的开发和发展,这可能是有用的作为肺癌的治疗目标。

GTSE1 microtubule-localized蛋白质,据报道过表达在多种人类癌症和负调控p53的功能(19,20.]。据报道,高GTSE1表达导致人类癌症的恶性行为(10,21]。在神经内分泌肿瘤,过度GTSE1可以增加积极的表型(22]。符合这些结果,我们的结果表明,GTSE1表达增加肺癌组织和细胞系,这结果是与肺癌患者的总生存期12]。总之,GTSE1可以起到至关重要的作用在肺癌的开发和发展。

GTSE1也与肿瘤进展(12]。GTSE1施加重大影响克隆形成和直接与促进肝细胞癌(HCC)的增殖细胞(23]。此外,我们的研究结果还表明,GTSE1击倒抑制A549细胞增殖和克隆形成和H460细胞,符合数据在肝细胞癌和乳腺癌。以前的研究也表明GTSE1调节细胞周期通过促进p53本地化细胞质。A549和H460细胞,GTSE1击倒导致了增加G0 / G1期,同时减少G2 / M期,这表明GTSE1的异常表达细胞周期分布的影响。

在乳腺癌中,蛋白质含量GTSE1的确定的迁徙能力是非乳腺癌细胞系(24]。调节GTSE1阶段,与肿瘤侵袭性的潜力,和远处转移25]。符合这项研究中,我们报道了在肺癌细胞入侵和迁移是依赖于GTSE1表达水平。的异位表达GTSE1提升细胞入侵和迁移,GTSE1抑制细胞能力的差别而对这些入侵和迁移。

此外,我们表明,GTSE1能够抑制p53表达,促进一种蛋白激酶的磷酸化和mTOR然后AKT激活/ mTOR在肺癌细胞信号。p53是一个著名的肿瘤抑制基因可以抑制许多致癌信号通路包括一种蛋白激酶的激活信号(26]。因此我们认为GTSE1 p53表达下调可能促进一种蛋白激酶的磷酸化。一种蛋白激酶,也被称为蛋白激酶B,是一种已知的致癌基因。其异常的超表达或激活被报道在许多癌症和癌症细胞增殖密切相关,生存,入侵,和迁移27,28]。mTOR是对丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶AKT的下游信号(29日- - - - - -31日]。mTOR通过一种蛋白激酶激酶和磷酸化在Ser2448 autophosphorylated Ser2481 [29日- - - - - -31日]。一种蛋白激酶/ mTOR信号在促进恶性癌症的过程中发挥着关键作用(27- - - - - -31日]。所以,我们认为GTSE1也可能促进肿瘤细胞增殖,迁移和入侵并通过激活一种蛋白激酶抑制细胞凋亡信号在肺癌。

我们承认,这项研究没有包括体内试验,这是本研究的限制。我们将进一步研究GTSE1在肺癌动物模型的作用。

总之,我们高GTSE1表达式定义为一个更糟糕的预后引发肺癌患者和报道,GTSE1作为癌基因通过激活一种蛋白激酶/ mTOR肺癌的信号。因此,GTSE1可以作为治疗目标和小说在肺癌预后标记。这项研究中,据我们所知,是第一个显示阐述GTSE1蛋白质的细胞功能。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的结果包括在本文中。

的利益冲突

所有作者没有利益冲突声明。

作者的贡献

风扇张和Jingfei孟贡献同样这项工作。

确认

这项研究受到了中国浙江省自然科学基金(没有。LY15H160009)、浙江省科技项目(2014号c33116)、浙江省卫生医疗卫生科技项目委员会(2014号kya173)和浙江省科技计划中医(2012号zb125)。

引用

1. b·f·f·Nasim Sabath, g . a . Eapen“肺癌”北美的医疗诊所,卷103,不。3、463 - 473年,2019页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
2. s . Wang s·齐默尔曼,k·帕里克说,a·s·曼斯菲尔德和a . a . Adjei”目前的小细胞肺癌诊断和管理”,梅奥诊所的公报,卷94,不。8,1599 - 1622年,2019页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
3. a . e . Dutkowska和a . Antczak”在肺癌并存病,”Pneumonologia我Alergologia波兰,卷84,不。3、186 - 192年,2016页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
4. a·g·Pallis和k . n . Syrigos”从未吸烟者肺癌:疾病特点和危险因素,”肿瘤学和血液学的关键评论,卷88,不。3、494 - 503年,2013页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
5. n .杜马r . Santana-Davila和j·r·莫利纳“非小细胞肺癌:流行病学、筛查、诊断、治疗,”梅奥诊所的公报,卷94,不。8,1623 - 1640年,2019页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
6. r . Utrera l . Collavin d . Lazarevićd·迪莉娅和施耐德,“小说p53-inducible基因编码与G2-phase-specific microtubule-localized蛋白表达,“在EMBO杂志,17卷,不。17日,第5025 - 5015页,1998年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
7. d . r . Bublik m . Scolz g . Triolo m·蒙特和施耐德,“人类GTSE-1调节p 21 (CIP1 / WAF1)稳定赋予耐紫杉醇治疗,”《生物化学》杂志上,卷285,不。8,5274 - 5281年,2010页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
8. f . Lin y . j .谢x k . Zhang et al .,“GTSE1参与乳腺癌进展在p 53 mutation-dependent方式,“实验和临床癌症研究杂志》上,38卷,不。1,p。152年,2019。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
9. y, y, s . Yu et al .,“GTSE1, CDC20、PCNA和MCM6协同影响细胞周期规定,表明在肝癌预后不良,”分析细胞病理学ID 1038069条,卷。2019年,13页,2019。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
10. a .刘曾,x陆et al .,“过度的G2和S phase-expressed-1导致细胞增殖,迁移,并通过调节p53 / FoxM1 / CCNB1入侵途径和预测膀胱癌预后不良,”国际期刊的生物大分子卷,123年,第334 - 322页,2019年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
11. 吴x, y连et al ., h . Wang”GTSE1促进细胞迁移和入侵通过调节EMT在肝细胞癌和与不良预后相关,”科学报告,7卷,不。1,p。5129年,2017。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
12. 诉诉Subhash, s . h . Tan w . l . Tan et al。”GTSE1压制表达凋亡信号和授予顺铂耐药性在胃癌细胞,”BMC癌症,15卷,不。1,2015。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
13. t .田,大肠,范f . et al ., "老年病GTSE1缺乏肺癌与临床资料之间的关系,“亚洲太平洋癌症预防杂志》上,12卷,不。8,2039 - 2043年,2011页。视图:谷歌学术搜索
14. 肖张x, y Ning, y et al .,“MAEL有助于胃癌进展通过促进ILKAP退化,“Oncotarget,8卷,不。69年,第113344 - 113331页,2017年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
15. h·a·Bircan n . Gurbuz a pata et al .,“延伸因子2激酶(eEF-2K)表达与病人生存和促进细胞增殖,入侵和肺癌肿瘤生长,”肺癌卷。124年,39,2018页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
16. r·张f·张,z太阳et al .,“1号线retrotransposition促进发展和进展破坏肺鳞状细胞癌的肿瘤抑制基因FGGY,”癌症研究,卷79,不。17日,第4465 - 4453页,2019年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
17. m .曾y熊:Safaee et al .,“探索有针对性的致癌喀斯特退化策略^G12C”,细胞化学生物学,27卷,不。1,胜38负页。。e6, 2020年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
18. w·郭黄h . d . Wang庄x, y .他,“相关低IGF2BP1 FOXM1表达预测肺腺癌的预后良好,”病理学、研究和实践,卷215,不。7,152433年,页2019。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
19. a·r·蒂普敦j·d·雷恩j·r·多姆·j·c·谢菲特和g . j . Gorbsky”GTSE1调节纺锤体微管动力学控制极光激酶B和Kif4A chromokinesin染色体臂上,“《细胞生物学》杂志上,卷216,不。10日,3117 - 3132年,2017页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
20. s . Bendre a . Rondelet c霍尔et al .,“GTSE1曲调微管稳定染色体定位和隔离通过抑制微管解聚酶MCAK,”《细胞生物学》杂志上,卷215,不。5,631 - 647年,2016页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
21. h·金,g . y .康美国全et al .,“识别的分子签名参与放射性肺纤维化,”分子医学杂志,卷97,不。1,37-47,2019页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
22. c . o . j . Lee Sung e·j·李et al .,“神经内分泌肿瘤的转移具有增加细胞增殖和减少的ATM基因的表达,”《公共科学图书馆•综合》,7卷,不。4篇文章e34456 2012。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
23. m·蒙特r·他·g·巴斯米,p .桑迪·g·德尔·萨尔,施耐德,“人类GTSE-1控制细胞cycle-regulated蛋白DNA损害细胞凋亡影响p53功能,“《生物化学》杂志上,卷278,不。32岁,30356 - 30364年,2003页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
24. m . Scolz p . o . Widlund s广场et al .,“GTSE1是一种微管左端的跟踪蛋白调节EB1-dependent细胞迁移,”《公共科学图书馆•综合》,7卷,不。12篇文章e51259 2012。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
25. l .郭张,b . Zhang et al .,”沉默GTSE-1表达抑制增殖和入侵肝癌细胞,”细胞生物学和毒理学,32卷,不。4、263 - 274年,2016页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
26. m·f·Ladelfa m·f·托莱多j . e . Laiseca和m .蒙特”p53肿瘤抑制和致癌信号通路相互作用来控制细胞活性氧的生产,”抗氧化剂和氧化还原信号,15卷,不。6,1749 - 1761年,2011页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
27. a·c·谭”,针对mTOR / PI3K / Akt通路在非小细胞肺癌(NSCLC),“胸癌,11卷,不。3、511 - 518年,2020页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
28. j·李,c . Kim J.-Y。嗯,g·塞提,k .安“Casticin-induced抑制细胞的生长和存活通过双重调制的一种蛋白激酶/ mTOR信号级联,”癌症,11卷,不。2,p。254年,2019年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
29. m .歌曲,a . m .预示z盾,和m·h·李,“一种蛋白激酶作为癌症治疗的目标,“癌症研究,卷79,不。6,1019 - 1031年,2019页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
30. 戴x p s Ong l z . Wang, s . j .厕所,s·h·曾和g·塞提,“明智地切换mTOR活动对抗胰岛素抵抗和癌症:现有的证据和观点,“在药理学领域,7卷,p。395年,2016年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
31. k . Chen z商,a . l .戴和p . l .戴“小说mTOR / PI3K / Akt通路抑制剂+放射治疗:非小细胞肺癌的策略与RAS基因突变基因,”生命科学,第255卷,第117816页,2020年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索

版权

版权©2021粉丝Zhang et al。这是一个开放访问分布在条知识共享归属许可,它允许无限制的使用、分配和复制在任何媒介,提供最初的工作是正确引用。