负责的分子与细胞机制的有益作用的间充质干细胞产品“Exo-d-MAPPS”衰减的慢性气道炎症

文摘

间充质干细胞(msc),因为他们可能分化成肺泡上皮细胞和免疫抑制特性,被认为是一种新的治疗在细胞治疗炎症性肺疾病,包括慢性阻塞性肺病(COPD)。因为大多数MSC-mediated慈善的影响是他们的旁分泌作用的结果,因此,我们调查的影响新设计MSC-derived产品“Exosome-derived多个同种异体蛋白质旁分泌信号(Exo-d-MAPPS)”衰减的慢性气道炎症通过动物模型的慢性阻塞性肺病(引起慢性暴露于香烟烟雾中(CS)和临床数据来自Exo-d-MAPPS-treated慢性阻塞性肺病患者。Exo-d-MAPPS含有高浓度的免疫调节因子能够衰减慢性气道炎症,包括可溶性肿瘤坏死因子受体I和II, il - 1受体拮抗剂,为先进的糖化结束产品可溶性受体。因此,Exo-d-MAPPS显著改善呼吸功能,下调血清炎性细胞因子(TNF -水平α,il - 1β、白介素、干扰素-γ)、血清免疫抑制il - 10浓度增加和减毒的慢性气道炎症CS-exposed老鼠。肺的细胞组成显示Exo-d-MAPPS治疗减毒lung-infiltrated巨噬细胞炎性细胞因子的产生,中性粒细胞,自然杀伤细胞和自然杀伤T细胞和缓解的抗原递呈性质lung-infiltrated巨噬细胞和树突状细胞(dc)。此外,Exo-d-MAPPS促进免疫抑制的扩张IL-10-producing或者激活巨噬细胞,监管DCs、CD4 + FoxP3 + T调节细胞在肺发炎导致慢性气道炎症的衰减。以类似的方式,因为它在一个动物模型,观察Exo-d-MAPPS治疗显著改善肺地位和慢性阻塞性肺病患者的生活质量。重要的是,Exo-d-MAPPS容忍因为没有Exo-d-MAPPS后30 COPD患者报告任何不利影响。在总结中,我们相信Exo-d-MAPPS可以被视为一个潜在的新治疗剂治疗慢性炎症性肺疾病的功效应该进一步探讨在大型临床试验。

1。介绍

慢性阻塞性肺病是一种常见的、进步的,炎性疾病的特点是持久的和不完全可逆的气流限制与异常和管制相关的慢性炎症反应的有害颗粒或气体(1- - - - - -3]。早期慢性阻塞性肺病的特征包括装修的小航空公司引起的持续激活先天免疫细胞(肺泡巨噬细胞、中性粒细胞、自然杀伤(NK)和DCs),而严重的慢性阻塞性肺病阶段的特点是肺淋巴滤泡的发展由于增强激活CD8 +细胞毒性T淋巴细胞(ctl)和CD4 +辅助T细胞与B细胞(和他们的相声4- - - - - -8]。持续激活居民和lung-infiltrated免疫细胞导致结构和功能变化的肺部发炎,包括小航空公司的缩小,粘液hyperproduction,纤毛功能障碍,和破坏的肺实质9]。因此,慢性阻塞性肺病是通过持续和进行性呼吸困难(通常是更糟糕的是在体育活动),慢性咳嗽、痰液的正常生产(在三个或更多个月连续两年期间),喘息、胸闷(严重的慢性阻塞性肺病的迹象)9]。

以类似的方式,因为它是人类病理学观察,香烟烟雾暴露(CS)导致小鼠的慢性阻塞性肺病的发展(10]。因此,小鼠模型通常用于阐明分子和细胞机制的开发和发展人类慢性阻塞性肺病(10]。重要的是,有strain-dependent易感性的差异COPD-related受伤BALB / c和C57BL / 6小鼠之间。BALB / c小鼠更敏感比C57BL / 6小鼠COPD-related肺气肿,CS-induced慢性阻塞性肺病的主要组件之一(11]。体重下降程度明显高于死亡率,更大,更大的肺功能的下降,和更大的损失的肺泡组织注意到在BALB / c小鼠C57BL / 6小鼠相比(11]。重要的是,免疫细胞发挥至关重要的致病作用发展的香烟烟雾诱发慢性阻塞性肺病(TNF -α第,经典激活巨噬细胞和中性粒细胞(M1),以及IL-17-producing淋巴细胞)被发现在受伤的人数明显高于肺BALB / c小鼠C57BL / 6小鼠相比,表明使用BALB / c小鼠的优势在COPD-related动物研究10- - - - - -12]。

可用的药物(抗炎药,β2受体激动剂、抗胆碱能类)有效地减少气流限制和改善COPD患者的生活质量,但他们无法阻止疾病进展和死亡率(13]。由于慢性阻塞性肺病预计将成为全球疾病死亡的第三大主因,到2020年(1,2),迫切需要新的治疗方法以防止慢性阻塞性肺病的进展和恶化。

msc是self-renewable多功能细胞,可以分化成肺泡上皮细胞能够调节扩散,激活,和效应功能的免疫细胞,发挥重要作用的发展,发展和恶化的慢性阻塞性肺病(14]。因此,一些实验研究证明了msc的有利影响治疗慢性阻塞性肺病(15- - - - - -18]。气管内的静脉注射,intrabronchially注入msc设法显著减弱气性变化和明显改善COPD肺功能在动物模型(19]。msc的有利影响主要是归因于MSC-derived产品的活动(条件培养液(MSC-CM)和液(MSC-Exos)):纳米尺度的细胞外囊泡,以旁分泌和内分泌的方式交付的蛋白质、脂质、DNA片段,和免疫信使rna,内皮细胞和肺泡上皮细胞调节其功能(20.]。几行证据表明msc来源于胎盘组织(PL-MSCs)优越的生物属性与msc源自成人组织(21- - - - - -24]。符合这些发现,最近我们开发了“Exosome-derived多个同种异体蛋白旁分泌信号(Exo-d-MAPPS),“PL-MSC-derived产品的活动是基于液,生长因子,免疫调节细胞因子的能力衰减炎症,促进受伤组织的再生25]。在这里,我们描述的分子和细胞机制负责Exo-d-MAPPS-based衰减BALB / c小鼠和气道炎症的病人患有慢性阻塞性肺病。

2。材料和方法

2.1。Exo-d-MAPPS样本采集

无菌Exo-d-MAPPS是转基因生物产品获得PL-MSCs以前收集从人类健康的捐赠者。PL-MSC样本得到病人同意制度伦理批准以及保持在4°C到处理。之前所有捐助者或集合的时候被实验室测试认证在美国临床实验室改进修正案(CLIA)和被发现-使用美国(美国)食品和药品管理局(FDA)批准测试的检测至少,乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、人类免疫缺陷病毒类型1/2,梅毒螺旋体。

Exo-d-MAPPS样本用于本研究在特定的条件下才能生产适用于生物利用度测试和为不同的治疗用途。Exo-d-MAPPS样本被改造为无菌产品,生产根据现行良好生产规范(cGMP)监管和食品药品监督管理局审查的。无菌Exo-d-MAPPS样本包含再生加工厂的(RPP)专有专利灭菌过程提供一个安全的无菌产品(25]。短暂,PL-MSCs生长在完成MSC杜尔贝科修改鹰的介质(DMEM)。低(< 5)通过PL-MSCs增长到60% -80%融合在multiflasks隔离。新鲜PL-MSC媒体分层和收集后48 - 72 h(条件培养液)。房屋被超速离心法分离协议(100000 g在4°C 70分钟)。挂式的隔离是由积极的选择使用μ格拉德巴赫Bergisch mac™分离器(Miltenyi研究,德国;猫。130-042-602号)和外来体隔离套装锅,人类(Miltenyi研究,Bergisch格拉德巴赫,德国;猫。130-110-912号),包含一个微共轭的鸡尾酒tetraspanin蛋白质CD9、CD63、研究。短暂,挂式磁标记和加载到一个μ列,放置在磁场的μmac™分隔符。磁标记挂式留存在列,而无标号囊泡和电池组件通过列运行。将列从磁场后,完整的收集洗脱。挂式储存在−70°C到使用[25]。

2.2。动物

动物研究,8 - 12个雄性BALB / c小鼠。老鼠维持在动物医学科学学院的设施,塞尔维亚Kragujevac大学。所有的动物收到人道关怀,所有的实验都通过,按照指南进行动物伦理委员会的医学科学学院Kragujevac大学。老鼠被安置在12小时的光暗周期温度控制的环境中,与标准的实验室管理食物和水随意。

2.3。动物研究协议

动物被随机分为实验组和对照组( 老鼠每组)。从实验组小鼠接受全身暴露在CS 5香烟的CS与每隔30分钟的无烟室,每天4周(26,27]。烟雾暴露实验箱,适用于一群老鼠,包括盒体和盖。CS是通过负压曝光室使用提取泵。之间的CS,室内空气是通过商会不断吸引的。smoke-to-air比例是1:12保护小鼠免受急性烟雾毒性和死亡。

CS治疗4周后,小鼠随机分为两组,车辆或Exo-d-MAPPS(0.1毫升/腹腔内/三周每周5天)。

对照组的老鼠暴露在空气中,收到车辆或Exo-d-MAPPS。

2.4。组织病理学分析

所有老鼠都牺牲了8周后最初的CS暴露,和肺部孤立的组织病理学分析。孤立的肺在10%福尔马林固定,石蜡嵌入式,连续4μm组织部分是安装在幻灯片。部分被苏木精和伊红染色())和低功耗下检查(100 x)光microscope-equipped数码相机(蔡司Axioskop 40,耶拿,德国)28]。

2.5。血气分析

为了探索Exo-d-MAPPS治疗是否设法改善CS-exposed老鼠的细胞外酸碱状态和气体交换,血液气体参数(动脉血液中的氧气分压(PaO₂),二氧化碳分压(帕科₂)在动脉血液氧饱和度(圣₂)和pH值)进行了分析。为此,动脉血液样本得到控制和实验动物和分析在几分钟之内使用一个测试筒血液分析系统(3500年总理的宝石,仪器实验室,贝德福德,马萨诸塞州,美国)(29日]。

2.6。隔离Lung-Infiltrated免疫细胞

肺部,从控制和获得CS-exposed老鼠,用无菌磷酸盐(PBS)洗净,放置在培养皿DMEM补充10%的边后卫。解剖肺组织培养在培养基中含有胶原酶IV型(0.5毫克/毫升)和IV型牛胰脏DNAse(罗氏诊断;1毫克/毫升)37°C 45分钟。这些细胞被过滤100μm细胞尼龙滤网清洁50毫升锥形管。然后,细胞颗粒状,使离心10分钟300 g×10°C。耗尽了红细胞裂解缓冲(NH4Cl 0.144米,0.0169米三基地,pH值7.4)在37°C公司5%₂大气为5分钟(28]。

2.7。流式细胞术分析细胞内染色Lung-Infiltrated免疫细胞

Lung-infiltrated免疫细胞筛选各种细胞表面和细胞内标记流式细胞术。由于机械和酶的结合让肺组织可能导致细胞损伤和死亡,mac®死细胞清除工具(Miltenyi研究,Bergisch格拉德巴赫,德国;猫。130-090-101)是用于磁性细胞分离可行的细胞。简而言之,一个单细胞resuspended于100年暂停lung-infiltrated细胞μL的死细胞去除微(每10⁷的细胞)、混合和孵化在室温下15分钟。细胞被应用于女士列内 。废水通过列包含活细胞。减少非特异性结合的抗体,可行lung-infiltrated细胞被孵化的anti-Fc块(anti-mouse CD16 / CD32)。为此,孵化1细胞悬液μBD Fc块的g / 10⁶细胞在100年μL染色缓冲区(杜尔贝科的PBS (DPBS)没有毫克^{2 +}或Ca^{2 +},1% heat-inactivated FCS, 0.09% (/叠氮化钠)15分钟在4°C。细胞被洗,沾fluorochrome-conjugated抗体。简单地说, 细胞孵化与anti-mouse CD45 F4/80,我,CD80、CD206, CD11c, NKp46, Gr-1, CD3, CD4, CD8、CXCR3,单克隆抗体结合与异硫氰酸荧光素(FITC),藻红蛋白(PE), peridinin叶绿素蛋白质(PerCP),或allophycocyanin (APC)(都来自BD生物科学,圣何塞、钙、美国)的染色缓冲30分钟在黑暗中在4°C。细胞被洗两次离心染色缓冲和颗粒状。细胞内细胞因子染色,细胞被刺激50 ng / mL佛波醇12-myristate 13-acetate (PMA)和500 ng / mL ionomycin 5 h和GolgiStop(美国加利福尼亚州圣何塞BD生物科学,;猫。554715号)补充道。细胞培养在BD固定/透化作用的解决方案(BD Cytofix / Cytoperm™固定/透化作用工具包;猫。554714号)在4°C为20分钟。之后,细胞被洗两次1×BD烫/洗™缓冲区(BD Cytofix / Cytoperm™/透化作用固定设备;猫。 No. 554714) and pelleted. Fixed/permeabilized cells were concomitantly resuspended in 50 μL (BD烫/洗™缓冲区包含一个预先确定的最优浓度fluorochrome-conjugated抗体特定FoxP3, TNF -α、il - 12、il - 10、il - 1β干扰素-γ,使用适当的IL-17 anti-mouse单克隆抗体与FITC共轭,PE、PerCP, APC (BD生物科学,圣何塞、钙、美国)。细胞被孵化fluorochrome-conjugated抗体在4°C在黑暗中30分钟。之后,细胞被洗2 * 1×BD烫/洗™缓冲区和resuspended在染色前缓冲流仪分析。实验中分析了T细胞的表型和功能,CD3 + T淋巴细胞分离得到可行的人口lung-infiltrated细胞通过磁选。为此,mac分离器,mac列,和CD3ε格拉德巴赫MicroBead包、鼠标(Miltenyi研究,Bergisch,德国;猫。没有。130-094-973)。后来,CD3 + T细胞被沾fluorochrome-conjugated anti-mouse抗体特定CD4、CD8、CXCR3 FoxP3, TNF -αil - 10,干扰素-γ后,IL-17上面描述的过程。流仪分析了BD生物科学的FACSCalibur和使用流动分析软件分析程序(28]。

2.8。测定血清中细胞因子控制和实验动物的样本

商业ELISA集(研发系统,明尼阿波利斯,美国)被用来确定TNF -的浓度α、il - 12、il - 10、il - 1β和干扰素-γ在控制和实验动物血清样本(28]。

2.9。病人

三十COPD患者,目的是获得一个Exo-d-MAPPS吸入的解决方案。患者进入本研究男性( )或绝经后妇女( )年龄在50到75年,postbronchodilator 和< postbronchodilator 80%的预测 ,≥10 pack-year吸烟史,和肺恶性通货膨胀定义为一个功能余气量(FRC)大于120%。主题与过去或当前的历史生命体征异常,异常的实验室发现,临床相关的心电图异常,或心血管疾病筛查之前被排除在研究之外。所有受试者参与研究之前提供的书面知情同意。

2.10。临床研究协议

患者接受Exo-d-MAPPS吸入溶液(0.5毫升/每周三个星期)含有高浓度的免疫抑制因子(可溶性肿瘤坏死因子受体I和II (sTNFRI和sTNFRII), il - 1受体拮抗剂(IL-1Ra)和可溶性受体对于高级糖化终端产品(sRAGE)) (25,30.]。肺功能测试和临床研究结果记录之前和Exo-d-MAPPS治疗后1个月。肺量测定法是根据美国胸科学会的建议执行指南(31日,32]。1秒用力呼气量(FEV1)和最大呼气流量(PEF)率记录。胸部计算机断层扫描(CT)、标准临床COPD问卷(CCQ)得分,和6分钟步行距离(6)随钻测量测试轻快作为高频测试的有氧能力/耐力是用来确定Exo-d-MAPPS治疗的影响,如前所述[33- - - - - -35]。

2.11。统计分析

动物研究的结果进行了分析使用的学生 - - - - - -测试。所有的数据在动物实验中被表示为 (SEM)。的Wilcoxon符号秩检验应用于演示COPD患者的肺功能的差异之前和之后Exo-d-MAPPS治疗。的值 被视为具有统计学意义。

3所示。结果

3.1。在老鼠身上Exo-d-MAPPS减慢性气道炎症

动脉血气分析参数,包括PaO₂,帕₂、pH值和圣₂(数据1(一)- - - - - -1 (d)),表示在CS-exposed呼吸功能障碍小鼠表现为疲劳,疲劳,和减少活动。重要的是,显著改善呼吸功能,显著提高PaO就证明了这一点₂(图1(一), ),O₂饱和度(图1 (c), ),和pH值(图1 (d), )和减少帕科₂(图1 (b), )在接受Exo-d-MAPPS CS-treated老鼠。因此,类似抑郁的行为和运动活动的损失并没有在CS + Exo-d-MAPPS-treated动物。

肺泡壁是完整的,白细胞聚集在控制动物的肺实质未见(数字1 (e),一个和1 (e)B)。相反,部分肺泡壁破坏,肺泡隔和肺泡扩张空间扩大,毛细血管扩张,大量中性粒细胞浸润和拥堵,淋巴细胞和单核细胞中观察到的肺CS-exposed老鼠(图1 (e)C;黑色的箭头)。重要的是,保留肺泡和血管结构和数量显著降低的lung-infiltrated白细胞被注意到在CS + Exo-d-MAPPS-treated动物的肺(数字1 (e)D)表明Exo-d-MAPPS设法减弱CS-exposed小鼠肺部炎症相关的病理变化。

符合这些发现,显著降低炎性细胞因子的浓度,扮演一个重要的致病作用的开发和进展CS-induced气道炎症(TNF -α,il - 1β、白介素、干扰素-γ)观察血清样本Exo-d-MAPPS-treated CS-exposed老鼠相比,c + vehicle-treated动物(图1 (f); 肿瘤坏死因子-α、白介素、干扰素-γ; 对il - 1β)。此外,Exo-d-MAPPS治疗导致的抗炎和免疫抑制il - 10(图1 (g), )这是参与肺修复和再生4]。

3.2。Exo-d-MAPPS明显减毒大量炎性巨噬细胞,中性粒细胞,NK和NKT细胞在肺部发炎

巨噬细胞的发展有至关重要的作用和发展CS-induced小鼠气道炎症,和他们的数量对应于肺损伤和炎症的程度(36]。Exo-d-MAPPS治疗能显著减少的总数lung-infiltrated CS-exposed小鼠巨噬细胞(图2(b), )。此外,Exo-d-MAPPS显著减毒抗原递呈能力的肺泡巨噬细胞数量显著减少的CD80就是明证,I-A-expressing F4/80 +细胞在肺部CS + Exo-d-MAPPS-treated动物(数字2(c)和2(d), )。细胞内染色显示Exo-d-MAPPS显著减毒炎症TNF -的生产α(图2(e), )和il - 12(图2(f), )在lung-infiltrated巨噬细胞。此外,数量明显高于另外激活,IL-10-producing和CD206-expressing M2巨噬细胞被发现的肺Exo-d-MAPPS-treated CS-exposed老鼠(数字2(g)和2(h), ),表明Exo-d-MAPPS治疗抑制炎症和促进了代lung-infiltrated巨噬细胞的免疫抑制表型。

此外,Exo-d-MAPPS减毒的能力NK和NKT细胞和中性粒细胞炎性细胞因子在CS-injured肺。数量显著降低的IL-17A-producing NK和NKT细胞(数字3(b)和3(c), NK和 NKT细胞)、干扰素-γ分泌NK和NKT细胞(数字3(d)和3(e), ),和肿瘤坏死因子-α和il - 1β第中性粒细胞(图3(g)和3(h), )观察肺的Exo-d-MAPPS-treated CS-exposed老鼠。

3.3。Exo-d-MAPPS显著缓解Lung-Infiltrated dc的抗原递呈属性,导致减毒CD4 +和CD8 + T淋巴细胞的活化

气道DCs启动和编排T cell-driven CS-injured肺部的炎症(34]。肺DCs组成一个哨兵在航空网络,通过受伤的上皮细胞捕获抗原,成为激活。激活DCs迁移到淋巴结抗原信息传递给专门的T淋巴细胞,诱导效应CD4 + T辅助细胞的生成和CD8 + ctl [37,38]。因为它是图所示4,Exo-d-MAPPS DCs的迁徙和抗原递呈性质的影响。数量显著降低的F4/80-CD11c +我+ DCs观察Exo-d-MAPPS-treated CS-injured肺的动物(图4(b), )。的总数lung-infiltrated F4/80-CD11c +我+ DCs表达costimulatory CD80分子(图4(c), )在收到Exo-d-MAPPS CS-treated小鼠显著降低。此外,减少数量的促炎IL-12-producing F4/80-CD11c +我+ DCs(图4(d), )和增加免疫抑制和耐受性,IL-10-producing F4/80-CD11c +我+ DCs(图4(e), )观察肺的CS + Exo-d-MAPPS-treated动物,表明Exo-d-MAPPS减毒气道dc的抗原递呈和促炎属性。

Exo-d-MAPPS-induced调制直流功能导致缓解炎症激活,干扰素-γ- - - IL-17-producing CD4 +和CD8 + T淋巴细胞(数字5(b) -5(e))。CXCR3-expressing和干扰素-数量显著降低γ第CD4 + Th1细胞(图5(b), )和IL-17-producing CD4 + Th17细胞(图5(c), )观察肺的Exo-d-MAPPS-treated CS-exposed老鼠。同样,Exo-d-MAPPS治疗减毒CXCR-expressing的涌入,干扰素-γ第(图5(d), ),和IL-17-producing CD8 + ctl(图5(e), )和减少的总数alveolotoxic, TNF -α第CD8 + ctl(图5(f), )在CS-injured肺。重要的是,Exo-d-MAPPS显著增加的总数lung-infiltrated抗炎,IL-10-producing CD4 + FoxP3 + T调节细胞亚群)(图5(g), ),使一代的肺部发炎的免疫抑制微环境。

3.4。Exo-d-MAPPS治疗明显改善COPD患者肺的地位

为了研究实验发现相应的人类病理学的相关性,我们评估的有效性Exo-d-MAPPS吸入溶液对气道炎症的衰减病人患有慢性阻塞性肺病(图6)。因为它是图所示6(一),Exo-d-MAPPS含有高浓度的可溶性免疫抑制介质(sTNFRI, sTNFRII、IL-1Ra sRAGE)。临床参数(数据6 (b)- - - - - -6 (e)(图)和CT发现6 (f))表示的有利影响Exo-d-MAPPS的减轻慢性肺部炎症。所有的30 Exo-d-MAPPS-treated病人显示显著改善肺的地位,就是明证的增加百分比变化相对于FEV1(%ΔFEV1)的初始值,明显高于PEF,降低CCQ总分,增加6分钟步行距离(6)随钻测量(数字6 (b)- - - - - -6 (e))。此外,Exo-d-MAPPS治疗后的生活质量明显改善,所有Exo-d-MAPPS-treated患者日常活动管理没有障碍。临床研究结果证实了CT。Inflammation-induced破坏恶性通货膨胀引起的肺泡和困气的肺压扁的隔膜在慢性阻塞性肺病患者(图6 (f)红色箭头)。Exo-d-MAPPS显著缓解COPD患者的肺肺气肿的变化。肺hyperexpanded较小,膜片不夷为平地,小叶和paraseptal肺气肿显著降低一个月后Exo-d-MAPPS政府(图6 (g)的有利影响,绿色箭头),表明Exo-d-MAPPS衰减的COPD患者的肺气肿。重要的是,Exo-d-MAPPS耐受性良好。没有一个30 Exo-d-MAPPS-treated COPD患者报告任何Exo-d-MAPPS政府有关的副作用。

4所示。讨论

msc被认为是新的治疗药物在慢性炎症性肺疾病的细胞治疗由于他们的能力在肺部和抑制有害的免疫反应由于其能够分化成肺泡细胞,肺上皮细胞和血管内皮细胞(39]。然而,结果在几个动物模型表明,移植msc、对生长因子产生的局部微环境,也可以分化成不受欢迎的组织,主要是骨头和软骨(40,41]。尽管msc的表达主要组织相容性较低类(MHC)分子,几行证据表明,同种异体移植的msc可以诱导同种异体免疫反应在MHC-mismatched接受者(42- - - - - -45]。因此,相关的安全问题MSC-based治疗仍然是一个有争议的问题(46]。

因为大多数MSC-mediated慈善的影响衰减的炎症性肺部疾病的结果他们的旁分泌作用[36),为了避免不必要的安全问题相关的移植msc分化或同种异体排斥反应(40- - - - - -45),我们设计了Exo-d-MAPPS, PL-MSC-derived溶性产品,其中包含MSC-derived挂式和免疫调节因子参与肺修复和再生(sTNFRI, sTNFRII、IL-1Ra sRAGE)。

通过临床资料和补充动物模型,因此,我们证明Exo-d-MAPPS的治疗潜力的减轻慢性气道炎症。明显改善肺功能和显著的减毒气道炎症慢性阻塞性肺病患者的观察一个月后Exo-d-MAPPS治疗。类似地,保护肺泡结构和数量减少的lung-infiltrated白细胞被注意到在CS + Exo-d-MAPPS-treated老鼠的肺表明Exo-d-MAPPS有效缓解CS-injured肺部炎症相关的病理变化。

的有利影响Exo-d-MAPPS CS-induced COPD的减轻依赖肺部炎性免疫细胞的抑制,因此,Exo-d-MAPPS COPD患者的管理是一个吸入的解决方案。老鼠似乎缺乏呼吸细支气管,部分alveolarized开展航空,CS-induced肺气肿的网站47]。尽管在气道解剖老鼠和人类特有的区别,老鼠一直是最常用的动物模型研究的分子和细胞机制负责新开发药物的治疗效果在慢性阻塞性肺病48]。在所有线路的日常应用药物,腹腔内政府最常用的老鼠,因为它是简单的执行和结果在一个快速吸收的药物脉管系统(49]。相反,在吸入的药物管理局,老鼠应该习惯于克制设备和鼻子面具(49]。压力,与物理约束,已被证明对心血管和免疫系统造成负面影响的老鼠,因此,可能改变免疫抑制药物的治疗效果,包括Exo-d-MAPPS [50]。由于这些原因,Exo-d-MAPPS腹腔内接种于小鼠和慢性阻塞性肺病患者的吸入。

肺泡上皮细胞暴露于CS产生TNF -α和il - 1β绑定到其肺内皮细胞受体(ECs)和诱导表达的增加selectins和整合素配体使大量积累循环白细胞在肺部发炎51]。因此,肿瘤坏死因子-α和il - 1β被认为是炎性细胞因子与最重要的致病作用的初始阶段肺损伤和炎症(51,52]。可溶性肿瘤坏死因子受体(sTNFRI和sTNFRII)抑制肿瘤坏死因子-α借慢性气道炎症,血清和唾液水平积极与COPD患者的肺功能;因此,sTNFRI sTNFRII被认为是重要的抗炎介质负责肺修复和再生53]。同样,MSC-derived IL-1Ra,一种天然的细胞因子,il - 1作为竞争性抑制剂β通过阻止il - 1和减弱肺损伤β端依赖积累在受伤的肺部炎症细胞(54]。IL-1Ra结合IL-1R ECs和防止促炎的事件由一个il - 1β:IL-1R交互,包括增强的大量中性粒细胞,巨噬细胞,淋巴细胞在肺部发炎54]。符合这些发现,我们假设sTNFRI, sTNFRII,和IL-1Ra Exo-d-MAPPS中高浓度的样品,负责其血清TNF的表达下调α和il - 1β和显著降低炎症TNF -的存在α第巨噬细胞和肿瘤坏死因子-α- - - il - 1β第c + Exo-d-MAPPS-treated动物的中性粒细胞在肺。

NK和NKT细胞促进肺损伤和炎症直接,肺泡上皮细胞的诱导凋亡,或间接地通过炎性细胞因子的分泌(IL-17A和干扰素-γ),调节炎症巨噬细胞的聚集和激活CS-injured肺(55]。因此,肺泡上皮细胞的减伤,注意到在肺部Exo-d-MAPPS-treated CS-exposed老鼠,伴随着显著减少IL-17A和干扰素的存在γ第lung-infiltrated NK和NKT细胞数量显著降低炎性巨噬细胞M1。

暴露的肺泡上皮细胞炎性细胞因子导致氧化应激的产生导致加速形成和积累先进的糖化终端产品(年龄)。年龄绑定到他们的受体(狂怒),导致肺损伤在蛋白质分子通过交联的形成(56]。因此,观察年龄和肆虐的增加表现在肺部的慢性阻塞性肺病患者,建议他们重要的致病作用在慢性气道炎症的发展和发展57]。相反,sRAGE充当诱饵受体年龄删除循环,阻止他们的结扎膜结合肆虐,保护肺组织损伤(58,59]。此外,sRAGE抑制年龄:RAGE-dependent单核细胞中炎性细胞因子的生产和促进或者激活巨噬细胞的生成和监管DCs (60]。这些抗炎细胞减少的MHC II级蛋白质和costimulatory分子的表达,诱导效应T细胞的无力,促进免疫抑制亚群的生成和扩展61年,62年]。符合这些发现,我们假设sRAGE,高浓度Exo-d-MAPPS样本中发现,负责CD80和I-A-expressing巨噬细胞的数量和DCs和增加免疫抑制,IL-10-producing或者M2激活巨噬细胞,肺的监管DCs,亚CS + Exo-d-MAPPS-treated老鼠。

肺部IL-10-producing细胞免疫抑制微环境创建了一个c + Exo-d-MAPPS-treated TNF -动物和抑制有害α干扰素-γ,IL-17-driven T细胞免疫反应。众所周知,肿瘤坏死因子-α、干扰素γ和IL-17-producing CD8 + ctl和CD4 + T辅助细胞有一个重要的致病作用的开发和进展慢性阻塞性肺病(61年]。Lung-infiltrated CD8 + ctl诱导肺泡上皮细胞直接的细胞死亡,通过分泌细胞毒性分子(TNF -α、穿孔素和granzymes),或间接地通过干扰素的生产γ或IL-17促进组织遭到破坏,促进分泌的基质金属蛋白酶(MMPs), TNF -α,il - 1β在巨噬细胞和中性粒细胞(63年,64年]。以类似方式,干扰素-γ——或者IL-17-producing CD4 + Th1和编排Th17细胞免疫反应在肺发炎放大lung-infiltrated炎症巨噬细胞和中性粒细胞的激活61年,63年]。此外,CD4 + T细胞促进长期生存的CD8 + ctl和全面发展至关重要的CTL-mediated在肺部发炎的细胞毒性61年,63年]。因此,我们相信Exo-d-MAPPS-induced扩张lung-infiltrated IL-10-producing巨噬细胞,DCs,和亚群和血清il - 10水平升高负责减毒T cell-driven气道炎症,减少受伤的肺泡上皮细胞中观察到CS + Exo-d-MAPPS-treated动物,

5。结论

总之,我们建议的主要作用机制负责Exo-d-MAPPS-based减轻慢性阻塞性肺病的依赖抗炎作用的可溶性介质(sTNFRI和第二,IL-1Ra sRAGE)抑制炎症白细胞的涌入和促进免疫抑制细胞在肺部的扩张。改变细胞组成的肺导致抗炎症微环境的创建使增强组织修复和再生和提高CS-exposed动物和COPD患者的肺功能。因此,我们相信Exo-d-MAPPS可以被视为一个潜在的新治疗剂治疗慢性炎症性肺疾病的功效应该进一步探讨在大型临床试验。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的结果包括在本文中。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

确认

这项工作是支持的塞尔维亚科技部(ON175069 ON175103)和医学科学学院大学Kragujevac (MP01/18)。

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