RAD51表达式及其在口腔鳞状细胞癌的临床影响

文摘

目的。检查RAD51的表达在口腔鳞状细胞癌(OSCC),分析其与病理等级,临床阶段,淋巴转移的潜力。方法。在这项研究中,74年OSCC样品,15正常粘膜组织,11个正常皮肤组织样本收集。RAD51表达式使用免疫组织化学研究。后续访问被用来评估每个病人的预后。我们比较RAD51表达式在口腔黏膜上皮细胞(OMECs),角化细胞,舌鳞状细胞癌的细胞(TSCCs)免疫印迹分析。结果。RAD51肿瘤细胞的表达高于正常粘膜组织。此外,RAD51表达式与高分化肿瘤( )。而且,RAD51表达较高( )淋巴转移患者,患者的复发率也较高RAD51水平升高( )。此外,RAD51皮肤角化细胞表达水平最高,其次是TSCCs OMECs。结论。之间有很强的正相关关系被发现RAD51表达和恶性的程度在OSCC患者中,表明RAD51 OSCC患者可能是一个优秀的预后指标。

1。介绍

口腔鳞状细胞癌(OSCC)账户超过每年90%的口腔恶性肿瘤的诊断。在全球范围内,这是最常见的癌症,来自口咽和口腔的粘膜膜每年有超过275000新病例诊断和全球每年125000人死于恶性肿瘤(1]。由于丰富的颌面部淋巴网络区域,OSCC显示超过40%的高转移潜能OSCC患者在两年内发生颈部淋巴结转移的早期诊断(2]。一旦恶性肿瘤扩散到周围的淋巴结,病人存活率显著下降只有40 - 50%的个人幸存的五年期在最初的诊断。然而,没有转移病人的存活率是90%,表明提高生存率的关键是疾病的早期诊断和及时的治疗。记住这一点,科学家已经发现了几个生物标记,可以用于识别早期疾病症状患者或高危个体(3]。

RAD51 339 -氨基酸,在DNA双链断裂修复中扮演着重要的角色。DNA的双链结构时受伤,RAD51利用妹妹DNA分子作为模板,允许同源重组(人力资源)受损区域,保持稳定的基因(4]。虽然RAD51显示一个保护作用,学者们发现,在一些肿瘤中RAD51是过表达的类型,包括乳腺癌、胰腺癌、头部和颈部,前列腺癌、非小细胞肺癌,食管癌(5,6]。最近,元et al。7]发现高RAD51表达式直接增加化疗radio-resistance,惨淡的结果和预测乳腺癌患者。在另一项研究中,陈等人。8RAD51)透露,在宫颈癌患者中,促进了癌细胞的分化从G0 / G1 S期。有趣的是,抑制RAD51增加肿瘤细胞对放疗的敏感性,这是一种很有潜力的治疗策略,需要进一步探索。此外,最近的一项荟萃分析的结果显示高RAD51表达式可能增加患头颈部肿瘤的病人风险(9]。

当前的文献表明,术后放射治疗是一种理想的治疗头颈部鳞状细胞癌的改善病人的总生存期和生活质量。然而,放射治疗导致外部损伤健康组织,从而导致不必要的炎症或粘膜溃疡的发展(10]。辐射也会产生负面影响表皮细胞和口腔黏膜上皮细胞,然而,这些细胞相关的副作用严重低于粘膜(11]。因此,我们相信RAD51可能发挥重要作用在抗辐射诱导的损害。

目前,有限的研究评估RAD51在OSCC的角色。在这项研究中,我们旨在评估的潜在使用RAD51 OSCC的预后指标。为此,我们研究了在OSCC RAD51表达式,口腔黏膜和皮肤组织样本,分析其与淋巴转移。RAD51相比我们还表现在口腔黏膜上皮细胞(OMECs),角化细胞,舌鳞状细胞癌的细胞(TSCCs)的临床应用提供理论依据RAD51作为口腔癌预后的生物标志物。

2。材料和方法

2.1。患者样本

这项研究是吉林大学的伦理委员会批准。在这项研究之前,所有的病人提供书面知情同意。在这项研究中,美国口腔病理学提供74 OSCC组织样本,15邻近正常组织样本,和11个正常皮肤组织样本病人口腔医院,吉林大学(中国长春),在2013年和2017年之间。史的患者糖尿病,高血压,或系统,代谢和免疫疾病被排除在研究之外。此外,酒精的消费和吸烟也排除标准。之前所有的患者接受治疗,包括手术、放疗、化疗或手术前在口腔医院,吉林大学。的患者,55岁是男性(74.3%)和19是女性(25.7%),平均年龄为57.2岁(范围:33 - 81)。分化良好型的组织学检查21例,32个是中度分化,分化不良例OSCC 21。共有28例(14 + 14,37.8%)早期疾病(1 + 2),而46例(62.2%)22 + 24日疾病晚期(3 + 4)。此外,21例(28.4%)有淋巴转移而53例(71.6%)没有淋巴转移(表1)。手术后患者样本收集和分段4μ米厚度后10%福尔马林固定,脱水,石蜡包埋。部分是坚持幻灯片和用于组织学研究。

2.2。免疫组织化学

OSCC和正常组织样本进行免疫组织化学使用商业套装(MXB生物技术,福州,中国)。多克隆抗体的最佳浓度RAD51 (ABclonal生物科技有限公司、武汉、中国)是1:100。根据制造商的协议中,部分在二甲苯清蜡、梯度酒精和自来水。接下来,部分接受微波抗原检索在柠檬酸溶液pH值(6.0)10分钟前孵化的内源性过氧化物酶阻断剂(3% H₂O₂为10分钟)。与PBS洗涤后,部分被孵化与正常羊血清在室温20分钟。然后,主要抗体稀释PBS一夜之间添加一个孵化在4°C。部分洗在PBS和孵化羊anti-rabbit免疫球蛋白10分钟。在PBS洗后,部分在biotin-labeled孵化链霉亲和素(10分钟)和接受一个颜色反应使用涂抹工具(MXB生物技术、福州、中国)为3分钟,在苏木精复染色1分钟。接下来,部分被盐酸酒精处理,和氨。最后,在分级乙醇脱水的部分解决方案,在二甲苯清理,安装与中性胶用盖玻片。

2.3。免疫组织化学评分

彩色部分是光学显微镜下查看和得分两个独立的调查。每个部分是评估在5个领域400 x放大。一个清晰可见的黄色或棕色沉淀的存在被认为是一种免疫反应,和各部分得分根据程度的阳性染色,染色强度。样本分为消极的(0 0 - 10%积极性)或积极(1 10 - 25%积极性,2为25 - 50%的积极性,3为50 - 75%的积极性,和4 75 - 100%的积极性)。表达强度是半定量的评估没有任何临床信息使用四能级系统的先验知识(0 - 1作为弱2温和,和3强)(12]。每个部分染色指数当时达成的阳性细胞分数乘以强度分数获得最后得分,这是平均5个分数。统计分析的样本分为两组:- ( )和积极的( )(13]。

2.4。细胞培养

TSCC细胞系,CAL-27和SCC-9从写明ATCC购买(美国弗吉尼亚州马纳萨斯)。人类角质细胞(HaCaT)是由教授Hongchen太阳(口腔病理学、口腔医院、吉林大学)。OMECs分离得到健康的捐赠者的过度粘膜组织(男,23岁)在一个orthognathic手术的口腔颌面外科、口腔医院、吉林大学。捐献者提供的书面知情同意在此之前的研究。洗了PBS粘膜组织,上皮部分是孤立和切成小碎片(1毫米³)在消化前2.5 g / L Dispase II (Solarbio科技有限公司,北京,中国)。在PBS洗后,上皮是混合酒含有0.25%胰蛋白酶消化(表达载体)和0.03% EDTA(表达载体)和阻塞在DMEM单细胞悬液做准备。

CAL-27细胞被维护在rpmi - 1640(表达载体)和提供10%胎牛血清(的边后卫;PAA实验室、派斯克、奥地利),100 U /毫升青霉素和100 mg / L链霉素。SCC-9细胞在DMEM / F-12孵化(表达载体)补充剂的边后卫和400年的10%μg / L氢化可的松(σ)。HaCaT和口腔黏膜上皮细胞培养在角化细胞无血清培养基(K-SFM;Gibco)。所有的细胞都维持在37°C湿润孵化器有限公司为5%₂。实验进行了使用对数生长期的细胞生长。

2.5。免疫印迹分析

细胞被洗PBS和细胞溶解里帕缓冲区(微孔、Billerica MA)。蛋白质浓度测定bicinchoninic酸蛋白测定。首先,40μl使用10% sds - page和总蛋白的解决转移到PVDF膜(Bio-Rad、大力神、钙、美国)。阻塞后5%的脱脂奶粉1.5 h,孵化了膜主要抗体RAD51(细胞信号技术,中国上海)一夜之间在4°C。洗后,细胞膜受到适当的辣根peroxidase-conjugated二级抗体和可视化使用增强化学发光系统(通用电气医疗集团,伦敦,英国)。β肌动蛋白是用于规范化。

2.6。临床随访

后续访问与选择患者进行手术后五年多。后续访问期间,病人特点、治疗计划,复发病例记录。

2.7。统计分析

所有统计分析使用SPSS 18.0版(美国芝加哥,IBM IL)。对比组评估使用单向方差分析(方差分析),学生的测试,或者测试。小于0.05的值被认为是具有统计学意义。

3所示。结果

3.1。RAD51 OSCC组织和健康组织样本之间的表达式

RAD51表达主要定位在细胞质和一些细胞的细胞核。群体间的比较如表所示2。RAD51表达显著增强OSSC组织与正常组织相比,和RAD51表达水平呈正相关的疾病阶段( ;图1),这表明RAD51表达式可能会用来估计OSCC患者的预后。此外,RAD51表达式也在OSCC患者淋巴转移( )。最后,根据TNM阶段,我们发现RAD51表达更高的疾病的患者(III或IV)相比,患者早期(I或II) OSCC ( ),然而,这一发现并没有统计学意义。

3.2。RAD51 TSCC细胞表达水平高于口腔黏膜上皮细胞和低于HaCaT细胞

免疫印迹分析是用来评估RAD51 TSCC细胞表达水平,OMECs,和皮肤细胞。RAD51差异表达的细胞系。如图2,RAD51表达水平最高的皮肤角化细胞(HaCaT),其次是TSCC细胞(CAL-27和SCC-9)。OMECs显示RAD51表达式的最低水平。TSCC细胞的reparability OMECs相比是更强的。

3.3。后续访问

总有39名患者遇到的时间标准,其中一个病人失去了联系和38例(表提供了相关信息3)。38例,十八岁是已故的随访和19个病人复发。RAD51表达明显高于患者样本中死去的后续访问( )。同样,有一个高的趋势RAD51表达式在患者复发性疾病患者相比,但( ),然而,这一发现并没有统计学意义。为了进一步探索放疗术后患者的功能,我们分析了复发的病例。结果表明,放疗组的复发率(43.3%)低于未接受放射治疗的患者(75%, )。在复发的情况下,我们也比较RAD51表达式中,中度和低分化组。在所有的组织,包括( ),适度( ),和低分化( ),RAD51高表达患者疾病复发与患者相比无疾病复发。总的来说,高表达的RAD51表示预后不良和高OSCC患者疾病复发的可能性。

4所示。讨论

近年来,RAD51表达式中已经发现了几种类型的癌症,包括主要是乳腺癌(14,15],宫颈癌[15,16)和卵巢癌17]。纯合子基因RAD51 GG经常被发现在乳腺癌患者16),而RAD51 G172T最在宫颈癌的临床意义18,19]。在这项研究中,我们调查了可能RAD51表达式和OSCC之间的联系,发现RAD51 OSCC患者的高表达。此外,我们发现RAD51低分化组织中的表达明显高于中度或分化良好型的组织(图1、表3),晚期疾病患者表现出更强的水平的RAD51与早期OSCC患者相比 )。这些发现表明,RAD51可能是一个可行的生物标志物为今后举办OSCC [20.]。

过度的RAD51会导致形成的基因毒性RAD51的染色质蛋白复合物,这将减少同源重组的效率(21]。此外,RAD51过度会导致细胞生长抑制和凋亡诱导的增强,导致肿瘤恶化[22]。此外,RAD51可以防止辐射诱导的肿瘤细胞。以前,一个et al。23)使用T0070907 (T007),一种过氧物酶体proliferator-activated受体(PPARγγ),削弱RAD51的表达在宫颈癌和干扰肿瘤细胞的有丝分裂。他们发现,代理也增加了对放射治疗的敏感性。在另一项研究中,刘等人。24拆装的RAD51基因在三阴乳腺癌(TNBC)细胞,发现抑制细胞增殖。此外,癌症干细胞(二者)TNBC能抗拒保利ADP-ribose聚合酶(PARP)抑制剂。然而,当在CSC RAD51基因是拆装的,其对PARP抑制剂的敏感性和放射治疗增加,这有效地抑制肿瘤的生长(25]。

在目前的研究中,我们分析了RAD51表达与OSCC之间潜在的联系。我们的研究结果表明,高表达的RAD51(表显示病人的预后3)。在免疫组织化学研究中,RAD51表达在高分化组低于中度和低分化组。相比那些没有复发的病人OSCC的后续访问,无论在( ),适度( ),或不佳( )分化,更高水平的RAD51可能复发病例样本所示。上述研究结果表明,增加表达RAD51发生密切相关,发展,OSCC的复发。

此外,DNA修复蛋白的upregulation RAD51一样,可以减少辐射诱导DNA损伤(26]。考虑到OSCC的推导,我们比较RAD51 TSCCs之一的表达水平,OMECs,角化细胞和皮肤发现RAD51expression是最高的,其次是OSCC,口腔黏膜(图1、表2)。细胞实验显示出类似的结果(图2),表明皮肤组织有更强的能力来抵抗放射性损伤。这就解释了为什么口腔黏膜放射治疗期间产生溃疡的(10),而对皮肤的影响不太明显。尽管如此,皮肤组织需要更多时间恢复辐射诱导的损伤比口腔粘膜组织(27),但确切的机制还有待阐明。

此外,高RAD51表达式被发现与增加转移性的潜力。最近,马赫迪et al。28)检查RAD51表情明显高于原发性卵巢肿瘤和转移性,发现转移性肿瘤中的表达。RAD51的高表达在乳腺癌以前所示增加脑转移的风险和微转移。然而,击倒RAD51减少乳腺癌的转移潜力(29日]。学者已经证实高RAD51表达式可以作为关键因素在促进肿瘤的淋巴转移(30.,31日]。确认发现,这项研究表明,RAD51表达明显高于在OSCC患者淋巴转移( )。

这项研究是第一个报道的高表达RAD51在OSCC患者中,与口腔黏膜和皮肤。虽然RAD51蛋白质有恢复作用,它还可以提高肿瘤细胞的antidamage和入侵能力,因为它非选择性的属性。因此,RAD51可能被视为一个重要的蛋白质为未来的靶向治疗。总的来说,我们发现RAD51 OSCC患者是一个优秀的预后指标。

数据可用性

上可用的数据和材料的合理请求。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

西城和YYL构思和设计。JL YYL, JS进行实验。凯尔、DL、LD和BW收集和分析数据。YYL和杰准备手稿。西城,YYL, JS修订和起草这个手稿。所有作者阅读和批准最终的手稿。王在这项研究提供了资金支持。YYL和JL贡献了同样的工作。

确认

这项研究的部分资金支持中国的国家自然科学基金(# 81602377)的资助吉林省中医药科技工程(# 2018119),吉林省教育部门的资助(# JJKH20190097KJ),卫生和计划生育委员会研究吉林省的主题(# 2018 q016),并从吉林省财政部拨款(# JCSZ2019378-8)。从提供的工具和技术援助吉林省省级重点实验室的工作人员在吉林大学牙齿发育和骨重建。

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