诊断价值的调查和生物信息学分析miR-31患者结直肠癌淋巴结转移

文摘

结直肠癌(CRC)是最常见的癌症之一,发生在发达国家。遥远的CRC转移导致超过90%的CRC-associated死亡率。小分子核糖核酸(microrna)起着关键的作用在调节肿瘤转移和可能潜在的CRC患者诊断的生物标志物。本研究旨在识别可以作为诊断生物标记的microrna CRC转移。朝着这个目标,我们比较五个microrna的表达通常与转移有关(即。,miR-10b,mir - 200 c,mir - 155,miR-21,和 miR-31) between primary CRC (pCRC) tissues and corresponding metastatic lymph nodes (mCRC). Further, bioinformatics analysis of miR-31 was performed to predict target genes and related signaling pathways. Results showed that miR-31, miR-21, miR-10b, and miR-155 expression was increased to different extents, while miR-200c expression was lower in mCRC than that in pCRC. Moreover, we found that the level of both miR-31 and miR-21 was notably increased in pCRC when lymph node metastasis (LNM) was present, and the increase of miR-31 expression was more profound. Hence, upregulated miR-31 and miR-21 expression might be a miRNA signature in CRC metastasis. Moreover, we detected a higher miR-31 level in the plasma of CRC patients with LNM compared to patients without LNM or healthy individuals. With the bioinformatics analysis of miR-31, 121 putative target genes and transition of mitotic cell cycle and Wnt signaling pathway were identified to possibly play a role in CRC progression. We next identified seven hub genes via module analysis; of these, TNS1 was most likely to be the target of miR-31 and had significant prognostic value for CRC patients. In conclusion, miR-31 is significantly increased in the cancer tissues and plasma of CRC patients with LNM; thus, a high level of miR-31 in the plasma is a potential biomarker for the diagnosis of LNM of CRC.

1。介绍

结直肠癌(CRC)是最常见的恶性肿瘤之一,全世界癌症死亡的第四大原因(1]。然而,尽管早期筛查的发展模式和辅助化疗改善了CRC的预后,与淋巴结转移先进的CRC (LNM)仍然极其不良预后。LNM先进CRC患者中是很常见的,并考虑到不良预后,更敏感和LNM诊断的具体方法可以显著受益CRC患者的治疗计划和临床随访(2]。尽管几个基因产物似乎导致CRC的恶性肿瘤,准确预测预后和复发的因素CRC尚未确定。

在基因产物和信号分子参与了CRC的发展,小分子核糖核酸(microrna),短测量年龄在18岁至25岁之间的非编码rna的核苷酸长度,可能作为诊断和治疗的分子靶点。microrna已经被证明为一个新的机制,调节基因表达和参与各种生物过程的人类癌症(3]。他们可以调节基因表达转录后的,和生物信息学分析表明,microrna在调节许多哺乳动物基因的表达的能力,其中包括肿瘤促进基因和肿瘤抑制基因(4]。microrna报道在癌症发展,积极充当致癌基因(例如,mir - 155和miR-21),肿瘤抑制(如miR-15a和miR-16-1),或转移促进剂(如miR-10b, mir - 182, miR-29a) (5]。异常的microrna的表达与人类癌症有关,因此microrna的分析,作为一个最现代的形式为肿瘤的分子特征,用于癌症诊断和预后预测(6,7]。

研究表明microrna的概要文件区分CRC组织从正常结直肠粘膜。罗等人已经观察到164 microrna表达异常的CRC (8]。进一步,miR-31 miR-20a报道明显升高,而mir - 145和mir - 143在CRC组织显著下调(9- - - - - -11]。另外,一些研究进一步描述了microrna的表达水平与肿瘤特异表达之间的相关性特征。例如,miR-21的表情,miR-31, miR-20a与组织学标记的表达水平呈正相关(ki - 67和CD34) CRC组织(12]。mir - 145 k基因的表达呈负相关,而miR-21呈正相关,CRC (k - ras基因的表达基因13]。这些研究结果表明,特异表达microrna在CRC参与细胞增殖和血管生成发展。然而,很少有研究关注microrna与肿瘤之间的关系阶段。microrna可能会影响迁移、入侵和肿瘤细胞内渗和作为乳腺癌转移促进剂(14,15),移行细胞癌、黑色素瘤和CRC (16]。有趣的是,upregulation miR-21和miR-10b与LNM乳腺癌的差别,而对这些miR-31, mir - 335, mir - 126与肿瘤复发有关(16]。Eslamizadeh等人调查了CRC的microrna的概要的诊断价值。根据他们的研究,等离子体水平的miR-21, miR-31, miR-20a, mir - 135 b与CRC的更高阶段上升。相比之下,mir - 145、miR-let-7g和mir - 200 - c随CRC的更高阶段。和等离子体的表达水平miR-21, miR-31, mir - 135 b明显不同阶段II和III CRC患者(17]。

microrna可能促进或抑制肿瘤转移通过调节靶基因的表达(18]。NF - miR-31发现目标κB-inducing激酶(尼克)负调控中的NF -κB通路,因此失去miR-31触发致癌信号在成人T细胞白血病(19]。另一项研究在头颈癌建议miR-31可以激活低氧诱导因子促进癌症恶化通过瞄准factor-inhibiting低氧诱导因子(20.]。此外,肿瘤抑制基因RhoBTB1也建议由miR-31,伴随着人类结肠癌的发展(21]。然而,确凿的研究目标基因和通路CRC比较少见。进一步探索miR-31调节CRC的可能机制,我们进行了生物信息学分析miR-31预测目标基因和信号通路。和一个全面的方法被用来屏幕最可能的靶基因,包括去KEGG浓缩分析、PPI网络建设、表达水平的验证,相关分析和生存分析的目标基因。

本研究的目的是:(1)确定CRC转移microrna能生物标志物。朝着这个目标,我们比较五个microrna的表达通常与转移有关(即。,miR-10b,mir - 200 c,mir - 155,miR-21,和miR-31)between primary CRC (pCRC) tissues and corresponding metastatic lymph nodes (mCRC). Further, we aimed to (2) determine the mechanism by which miR-31 regulates CRC metastasis and thus adopted bioinformatics analysis to explore putative target genes and related pathways involved in CRC. Finally, we sought to (3) identify the most possible key target genes of miR-31 in CRC using comprehensive bioinformatics methods.

2。材料和方法

2.1。病人和样品

实验过程和病理分类都是武汉大学中南医院伦理委员会批准后,进行国际抗癌联盟和美国癌症联合委员会结肠癌TNM分期系统成立于2003年。知情同意是在抽样之前从每个病人。肿瘤组织收集CRC患者肿瘤切除术后在武汉大学中南医院。他们没有收到任何术前治疗。我们设计了三组实验。在组1中,9主要CRC (pCRC)同一病人的组织样本和对应的mCRC(阶段III / IV CRC)是识别metastasis-related microrna的配对。每个淋巴结测试确认LNM通过苏木精和伊红染色。在集合2,pCRC组织样本收集与CRC患者有或没有LNM验证组1中确定的候选人microrna。在第3集,在手术或术前治疗之前,血液收集等离子体从28 CRC患者(阶段III / IV) LNM、28个病人(阶段I / II)没有LNM,和28岁,sex-matched健康志愿者。组织和等离子体都集合到RNA提取后立即保存完好。

2.2。RNA提取

等离子体的小分子RNA提取RNA miRVana巴黎隔离设备(德国试剂盒)。简单地说,250年μl(等离子体在冰融化之后,在14000转离心5分钟去除细胞碎片和细胞器。然后我们细胞溶解150μl的上层清液的体积相等 解决方案(试剂盒,德国)。规范化样本之间的差异,25 fmol合成线虫microrna cel-miR-39 (BioVendor、欧洲)添加到每个变性在RNA提取样本(22]。小分子rna被净化后,制造商的协议,除了45μl nuclease-free水用来洗提小rna。

肿瘤组织的总rna提取使用试剂盒试剂(豆类、东京、日本)后,制造商的协议。总rna浓度和纯度的测定使用智能规范+分光光度计(美国热科学Inc .)。

2.3。实时PCR和表达分析

等离子体RNA或100 ng组织腺苷酸和反向转录成RNA是cDNA使用miScript逆转录工具包(试剂盒,德国)。rt - PCR对每个样本进行重复使用miScript SYBR绿色PCR试剂盒(DNA试剂盒、希尔登,德国)发动机内髓II系统(Bio-Rad实验室、Inc .、大力神、钙、美国)。miRNA-specific引物设计基于从miRBase获得microrna的序列数据库。每个放大反应是在最后的20倍μl包含1μ每个引物的l (cDNA、0.25毫米,和 绿色PCR掌握混合。PCR的末尾,融化曲线分析和PCR电泳产品3.0%琼脂糖凝胶进行确定的特异性扩增。U6核内小rna作为内部控制。

成熟的microrna的量化是使用BioRad执行只经理(Bio-Rad实验室、Inc .、大力神、钙、美国)。循环阈值(Ct)被定义为周期数量在PCR荧光信号越过阈值。

相对microrna的表达规范化U6水平和计算通过2^{- - - - - -ΔΔCt}方法(23]。提供的数据是随着褶皱的变化相对于正常组织的表达。

2.4。识别Metastasis-Related microrna在pCRC和mCRC

确定转移microrna特定CRC, microrna在9个匹配pCRC组织和相应mCRC通过rt - pcr分析。我们首先测试了五种microrna的表达,即。,miR-10b,mir - 200 c,mir - 155,miR-21,和miR-31,because they have been suggested to closely associate with metastasis in multiple tumor types.

2.5。预测miR-31的假定的目标基因

miR-31靶基因的预测使用三个在线数据库常用的microrna的目标预测:TargetScan 7.2版本,miRDB, v5.0 DIANA-microT web服务器(24- - - - - -26]。重叠的部分可能的靶基因被认为是公认的目标基因。

2.6。去KEGG假定的目标基因的聚类分析

假定的目标基因上传到数据库的功能注释门户注释、可视化、发现和集成(大卫),在线生物信息学资源调查的生物意义大的基因列表(27]。基因本体论(去)分析是利用调查可能的靶基因的角色参与生物过程(BP),细胞组件(CC)和分子功能(MFs)。京都基因和基因组的百科全书(KEGG)聚类分析是采用基因映射到一个相关的通路。一个值< 0.05和< 0.05的错误发现率应用于识别重大和KEGG物品。

2.7。PPI网络的建设和模块分析

研究功能蛋白质之间的相互作用网络,我们构建的蛋白质交互(PPI)网络StringApp插件在Cytoscape从数据库的字符串(28]。Cytoscape 3.51是一个公共平台,建立生物分子相互作用网络(29日]。此外,CytoHubba包含12个预测算法(压力、中间性DMNC,学位,跨国公司,MCC,瓶颈,EPC,亲密,Radiality,怪癖,和ClusteringCoefficient)是用来确定中心基因最有可能miR-31的关键目标基因。

2.8。验证miR-31和中心基因的表达在结肠直肠癌

验证在CRC miR-31和中心基因的表达,我们下载RNA表达数据的环球数码创意TCGA结肠癌和直肠癌和控制从UCSC齐娜平台(30.]。所有的数据与log2标准化转换表达式。然后,提取基因RNA项miR-31和中心。基因表达水平的miR-31和中心之间的比较结肠癌,直肠癌,并与学生的控制 - - - - - -测试使用GraphPad Prism 6.0 (GraphPad软件公司,拉霍亚,CA,美国)。miR-31和中心基因表达的差异就显示为一盒阴谋。此外,揭示miR-31和中心基因之间的关系,斯皮尔曼的相关性分析和线性回归土地建设与GraphPad Prism 6.0执行。

2.9。预后价值评价中心的基因

评估这些中心的价值基因CRC患者的预后,我们使用了GTEx结肠癌和直肠癌患者的生存数据GEPIA在线工具(31日]。总生存期(OS)和无病生存期(DFS)的结肠癌和直肠癌患者估计通过绘制kaplan meier生存曲线。风险比(人力资源)计算生存率较评估中心基因表达对患者生存的影响。

2.10。统计分析

所有的数据都表示为 。学生的 - - - - - -测试和Mann-Whitney测试应用于评估统计学意义。确定的程度——获得ΔCt有效区分不同临床子集,接受者操作特征(ROC)分析和曲线下的面积(AUC)作为指标的区分能力。所有使用SPSS 13.0软件进行统计分析值低于0.05被定义为具有统计学意义。

3所示。结果

3.1。Metastasis-Related microrna在pCRC和mCRC

miR-10b的表情,mir - 155, miR-31, miR-21更高,mir - 200 c的表达是低比相应mCRC pCRC组织。这些变化被观察到在所有9例测试。特别是,miR-21的表达和miR-31 mCRC既超过两倍高于pCRC组织(表1)。因此,我们关注miR-21和miR-31进一步调查披露他们的意义。

3.2。miR-21和miR-31调节与LNM CRC

探索的价值miR-21 miR-31 CRC转移的诊断,我们评估了他们的表达pCRC组织收集的患者有或没有通过rt - pcr LNM。每组由33名患者。miR-21水平明显高于1.62倍的平均pCRC组织LNM在场时,与pCRC组织没有LNM ( )(图1)。同样,miR-31水平也是相当高的pCRC组织LNM患者(平均2.36倍, )。

3.3。等离子体miR-31区分CRC转移

评估miR-31的upregulation是否可以识别CRC或者,更具体地说,CRC转移,我们确定了CRC患者的血浆miR-31水平和健康的捐赠者。总共有84血浆样本来自28 I / II期患者没有LNM, 28个阶段III / IV LNM患者和28个健康的捐赠者。-ΔCt值被用来指示miR-31表达式的等离子体。与健康的捐赠者,CRC患者显著升高miR-31等离子不管LNM ( )。此外,患者血浆miR-31表达式LNM甚至高于病人没有LNM ( )(图2(一个))。ROC曲线显示,miR-31是一个潜在的有价值的生物标志物识别CRC患者LNM CRC患者没有LNM,表示的AUC 0.89(95%置信区间:0.81—-0.97, )(图2 (b))。在中华民国化验,a -Δ患者的Ct值为-8.6(规范化)LNM被认定为截止歧视转移CRC nonmetastatic CRC。最佳的特异性和敏感性分别为86.2%和78.5%,分别为(图2 (b))。

3.4。miR-31假定的目标基因

有477、613和595的目标基因miR-31预测使用TargetScan miRDB,分别和DIANA-microT web服务器。3的121个重叠基因数据库被认为是miR-31的目标基因(图3)。

3.5。去KEGG富集分析

有四个,三个,六个方面显著的集群BP, CC,分别通过去分析和MF(图4)。三大条款大脑皮层发育,有丝分裂细胞周期的过渡,在英国石油公司和参与运动的运动行为;细胞质、粘着斑和cAMP-dependent蛋白激酶在CC复杂;和蛋白质heterodimerization活动,SH3域绑定,在曼氏金融和离子通道绑定。七个通道被确定通过KEGG浓缩分析(图4),三大途径进行杀菌作用,ubiquitin-mediated蛋白水解作用,和Wnt信号通路。

3.6。PPI网络和枢纽的基因

PPI网络的构建与使用StringApp(图121年的假定的目标基因5(一个))。的121个目标基因可能与他人联系,这可能构成互动模块参与CRC的进展。使用12个算法模块分析后,结果在降序排序,和七个中心基因(ELAVL1、PPP3CA DICER1, CBL, GNA13, SSH1,和TNS1),这可能是miR-31的目标基因(图的关键5 (b))。

3.7。验证miR-31和中心基因的表达

比较之间的miR-31 CRC的表达组织和控制,microrna的表达数据615肿瘤组织和11个控件下载。在结肠组织miR-31水平显著高于控制(图6(一))。至于中心基因,mRNA表达数据638年环球数码创意TCGA肿瘤组织(包括结肠癌和直肠癌)和51控制(图下载6(一))。除了ELAVL1之外,所有其他的六个中心基因显著下调结肠和直肠肿瘤组织相比在控制。考虑到miR-31显著调节在CRC,这六个基因可能受miR-31 CRC中心。此外,相关分析表明,与miR-31 TNS1水平负相关(见图6 (b));与此同时,其他六个中心之间没有显著关系的基因和miR-31被发现。

3.8。预后价值评价中心的基因

362年数据CRC患者中使用kaplan meier生存分析七中心基因。结果表明,低TNS1表达式能显著改善操作系统( , )和DFS ( , )(图7)。然而,对中心的其他六个基因包括ELAVL1 PPP3CA, DICER1, CBL, GNA13, SSH1,生存分析中没有发现统计学意义(补充数据1- - - - - -6)。更大的群组研究中需要进一步的研究。

4所示。讨论

放大、删除和重排的microrna经常出现在人类癌症。一些改变microrna的表达能促进肿瘤发生,和microrna作为肿瘤抑制(32]。最近,提出了“metastamiR”这个词来形容microrna与肿瘤转移相关。MetastamiRs prometastatic或antimetastatic [16]。例如,miR-10b首先报道为乳腺癌转移(33]。后来,据报道,mir - 335可以抑制转移性乳腺癌细胞的入侵。越来越多的证据表明改变microrna的表达主要与转移性肿瘤,暗示microrna在肿瘤转移的重要作用。先前的研究已经报道,5调节microrna和14个表达下调microrna参与CRC的转移,但microrna的水平和CRC转移之间的关系尚不清楚(34,35]。因此,有必要探讨微分microrna的原发肿瘤和转移性组织之间的水平。匹配的比较方法是最优的,因为它可以排除内生microrna的表达的差异。在我们的研究中,五个metastasis-related microrna的水平被发现,他们中的大多数在mCRC增加。microrna的表达我们的结果的趋势是类似于先前的调查33,36,37]。在我们的研究中,表达miR-31越高,miR-21, miR-10b, mir - 155 mCRC表示microrna的签名可能预测CRC转移。因为miR-31和miR-21最microrna在选择五个microrna升高,然后我们想知道如果他们可以pCRC的潜在转移性生物标志物。正如所料,他们与LNM pCRC表达明显升高。有趣的是,miR-31更深刻的增加,表明miR-31可能是一个更敏感的生物标志物预测CRC转移。

虽然microrna的表达变化与LNM pCRC可能有助于诊断,临床医生很难收集CRC患者的组织。更方便和更少的入侵检测方法,如血液测试,将大大有利于CRC转移的预测和诊断。循环核酸水平可用于诊断CRC (7,38]。据报道之前,等离子体microrna水平高度相关和microrna的表达从乳腺癌患者肿瘤组织39]。microrna已发现在CRC的血清和血浆,卵巢癌和前列腺癌患者。等离子体microrna更比其他循环核酸稳定和一致的。因此,他们可能是最佳的生物标记物对癌症的诊断。例如,增加血浆mir - 92水平可以准确区分CRC从胃癌和良性疾病40]。等离子体mir - 141提出了诊断转移性结肠癌(41]。我们也评估了CRC患者血浆miR-31水平或没有LNM。没有LNM CRC患者相比,患者LNM等离子miR-31水平要高得多得多。miR-31了ROC曲线面积0.89的敏感性为78.5%,特异性为86.2%在区分CRC LNM CRC没有LNM、使用的截止值-8.6(归一化)。

据我们所知,等离子miR-31调查作为口腔癌症生物标记(42]。Eslamizadeh等人报道等离子miR-31水平上升的更高阶段的CRC (17]。在这里,我们得出结论,等离子体miR-31与LNM CRC的诊断价值。然而,为了进一步验证我们的研究,未来的调查应该招募一个大样本。

探索与CRC miR-31转移的关联,我们预测miR-31假定的目标基因,然后进行功能富集分析目标基因的信号通路和生物信息学方法。浓缩的结果分析表明,miR-31的目标基因可能参与一些癌症相关的生物过程和信号通路如有丝分裂细胞周期G1 / S过渡,ATP绑定和Wnt信号通路。PPI网络建设和模块进行进一步分析,和七个中心基因被确定,这更有可能是miR-31的目标基因。通过验证的表达和相关分析等七个中心基因,TNS1水平被发现在CRC组织相比,控制和降低与miR-31水平负相关。因此,TNS1最有可能被miR-31监管。通过生存分析,我们发现TNS1水平显著相关的操作系统和DFS CRC患者。此外,低表达TNS1预测的改进操作系统和DFS CRC患者。

TNS1是220 kD蛋白局部病灶粘连和地区的质膜细胞对细胞外基质的高度重视。TNS1蛋白质发挥作用在调节细胞活性和建议参与肿瘤发生[43]。TNS1水平升高与贫穷相关CRC患者的总生存期。因此,我们怀疑miR-31可能目标TNS1,导致CRC患者的改善结果。进一步的实验研究需要执行验证是否TNS1实际上是在CRC miR-31的目标。

5。结论

总之,miR-31显著提高肿瘤组织和血浆中CRC LNM患者。等离子体miR-31可以用作生物标记与LNM CRC。此外,miR-31升高可能导致改进针对TNS1 CRC患者的治疗结果。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的发现可以从相应的作者。

的利益冲突

没有披露潜在的利益冲突。

作者的贡献

Wu-wen张Xin-liang明,元荣,Fu-bing Wang和Jun-mei扁设计并进行实验并进行数据分析和报告。所有作者准备和修订后的手稿。Wu-wen张Xin-liang明,元荣贡献同样这项工作。

确认

作者感谢实验室的成员和他们的合作者的研究工作。这项工作是支持的第六为武汉培训计划的基础医学人才的健康委员会武汉。这项工作是由科技创新促进基金会也支持武汉大学中南医院(批准号znpy2018027)。

补充材料

补充图1:kaplan meier 362 CRC的生存曲线情况下根据ELAVL1表达水平。补充图2:kaplan meier 362 CRC的生存曲线情况下根据PPP3CA表达水平。补充图3:kaplan meier 361 CRC的生存曲线情况下根据DICER1表达水平。补充图4:kaplan meier 360 CRC的生存曲线情况下根据CBL表达水平。补充图5:kaplan meier 362 CRC的生存曲线情况下根据GNA13表达水平。补充图6:kaplan meier 362 CRC的生存曲线情况下根据SSH1表达水平。(补充材料)

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