人乳头状瘤病毒E6 / E7,hTERT,Ki67信使rna RT-qPCR化验检测与显微镜载玻片高档宫颈病变

文摘

后乳腺癌和结肠癌、宫颈癌是全球女性的第三大常见的癌症。自从人类乳头状瘤病毒(HPV)感染是宫颈癌的主要原因,分子HPV筛查目前细胞学和组织学检查方法用于癌前期诊断。然而,当前的人乳头状瘤病毒的敏感性测试小于80%;因此,许多宫颈癌病例不能仅由HPV筛查诊断,同样地,宫颈癌患者往往决定由当前HPV-negative筛查方法。因此,人类端粒酶逆转录酶(hTERT),Ki67之前确认为癌症标记未遂。和高档宫颈脱落细胞鳞状上皮内病变(HSIL),最严重的癌症的癌前病变,被用于这项研究。然而,它需要很长时间才能收集到足够的样本进行统计分析。因此,在目前的研究中,显微镜载玻片,宫颈脱落细胞玻片,未遂。分析结果表明,hTERT和Ki67表达水平有助于区分癌细胞和正常标本,表现出比传统HPV更高的敏感性和特异性E6 / E7测试。和临床研究表明细胞样品的环境可以有效地用于回顾性研究确定新型生物标志物。

1。介绍

宫颈癌是全球妇女的第三大常见的癌症,在乳腺癌和结肠癌(1]。世界卫生组织(世卫组织)估计,每年大约有528000名妇女被诊断为宫颈癌的疾病每年导致约266000人死亡。

宫颈癌的已知的危险因素包括人乳头瘤病毒(HPV)感染,滥交的性交,性传播疾病感染,长期使用激素避孕药,和吸烟2]。这些风险因素,HPV感染是宫颈癌的主要原因。因此,有效的HPV筛查是必要的方便准确和快速的癌前期诊断和目前全球使用细胞学和组织学检查(3- - - - - -6]。

当前的“金本位”方法为癌前期诊断细胞学和组织学检查。脱落细胞学检查、宫颈细胞收集的抽汲子宫颈(作为“子宫颈抹片检查”测试的一部分),在被放置到一个幻灯片要检查异常。在组织学检查的情况下,它是通过显微镜检查诊断染色组织切片的(7]。这两种癌前期诊断方法是影响灵敏度测试本身和考官的主体性。

最近,分子通过人乳头状瘤病毒核酸序列的识别方法是使用标准结合细胞学和组织学检查技术,一般(8]。

目前,常用的诊断标记包括hpv相关蛋白L1, E6、E7。其中,L1是一个主要的病毒衣壳蛋白在细胞质中产生,在易位到中间值和表面的鳞状上皮细胞的细胞核,正如前面可视化使用免疫化学染色。E6、E7是主要与许多细胞目标包括人乳头状瘤病毒癌基因蛋白p53和视网膜母细胞瘤的肿瘤抑制蛋白(复审委员会)。E6抑制p53,防止细胞凋亡,而E7是主要的改变蛋白质,和抑制复审委员会逮捕调节细胞循环9,10]。在前面的研究中,我们评估的有效性通过筛查宫颈癌诊断常用的mRNA表达人乳头状瘤病毒标记L1,E6,E7以及额外的癌症标记人类端粒酶逆转录酶(hTERT),Ki67。hTERT代表了端粒酶催化亚基。端粒是位于染色体末端的高度专业化的结构和已知基因组稳定至关重要11]。事实上,以前端粒功能障碍和端粒酶的激活与人类癌症进展(12]。的表达水平hTERT是人类端粒酶活性的病原因素,这样,可能更敏感指标的端粒酶功能和活动比其他端粒酶亚基的表达水平在正常和肿瘤细胞中表达的结构上13]。另一方面,Ki67核抗原表达在细胞周期的所有活动阶段(即。,G1, S, G2, and M) except G0, and thus, its expression level can be used to determine the cell proliferation status and to predict tumor development [14]。

筛查的诊断标记也可以使用在评估宫颈癌的进展过去midstage,作为先前进行的前瞻性研究证明了他们的表达formalin-fixed石蜡包埋(FFPE)临床组织样本15]。细胞学样本实际使用在临床筛选试验也进行了。然而,严重的癌前病变样本不足以进行统计分析。特别是需要很长时间来收集高档鳞状上皮内病变(HSIL)样品是最严重的癌症的癌前病变。因此,在目前的研究中,显微镜载玻片被试图作为样本。他们正在与加拿大香脂密封在真空状态,诱发贮藏期相对较长。他们可以快速、轻松地通过收集临床信息记录。

在目前的研究中,人乳头状瘤病毒和癌症标记分析了上面提到的110 HSIL和50名正常的显微镜载玻片。

2。材料和方法

2.1。临床样本

110和50个幻灯片剥落cervical-cell样品安装与加拿大香脂(默克,法兰克福,德国)回顾性从患者获得诊断HSIL和正常,分别在2000年和2004年之间,从病理学系延世大学Wonju遣散基督教医院,Wonju,韩国。严格地说,正常意味着负面上皮内病变或恶性肿瘤(NILM)在这种情况下。为了减少解释诊断错误,我们只利用HSIL标本确认与宫颈上皮内瘤2级或2级(CIN2 +)。

所有科目提供书面知情同意参与这项研究,这是制度伦理委员会批准Wonju延世大学医学院(批准号CR315052)。

2.2。组织学和细胞学诊断

临床诊断主要是确定正常值使用2001贝塞斯达系统的术语;然而,还例获得组织切片病理检查。

2.3。幻灯片和总RNA提取做准备

幻灯片与宫颈脱落细胞(显微镜载玻片)被用于总RNA提取。幻灯片最初放在coplin jar和二甲苯(Duksan安山,韩国)4天将他们覆盖片段(与加拿大香脂安装)。然后他们被干(5分钟),放入six-well培养板(SPL生命科学有限公司Pocheon,韩国)。Isol-RNA裂解试剂(1毫升;5 ',奥斯汀,得克萨斯州)添加到每个幻灯片,然后1毫升清新cervical-cell样本收集从每个幻灯片通过热压处理过的载玻片刮(两次)。每个收集剥落cervical-cell样本被转移到一个RNase-free 1.7毫升管,通过涡流/重复移液,细胞溶解,可以孵化的试剂(室温下,5分钟)。之后的200年μL氯仿,管大力动摇了,孵化(室温下,3分钟),然后离心机(12000克,15分钟)。合成水性层被转移到一个新的管和与同等体积的异丙醇混合通过倒相管。混合物是孵化(25°C, 10分钟),然后离心机(12000 g, 10分钟)在得到的上层清液被切除之前,和1毫升的75%乙醇添加到剩下的小球。通过管倒置后混合,混合物是离心机(7500克,5分钟),和上层清液随后删除。剩余的RNA颗粒干燥,筛选了25μL diethylpyrocarbonate——(DEPC)处理过的水(生物技术基因内区、首尔、韩国)。提取的总RNA的纯度和浓度是决定通过测量其吸光度在260年和200年280海里使用无限板读者(Tecan、萨尔茨堡、奥地利)。孤立的总RNA终于储存在−70°C到使用。注意所有的制备和处理总RNA进行了层流罩,RNase-free条件下。

2.4。互补脱氧核糖核酸的合成

互补DNA合成(互补)使用一个M-MLV逆转录酶工具包(美国表达载体,卡尔斯巴德,CA)和随机五个一(表达载体),根据制造商的建议。简单地说,10μL的总RNA是包含1添加到主混合μL(10毫米混合核苷酸(包含10毫米每个dATP dGTP, dCTP,和dTTP中性pH值),0.25μg随机五个一,1μL DEPC-treated水PCR管。反应混合物是孵化(65°C, 5分钟),然后快速冷冻冰。4的混合物μ5 L×第一链缓冲区,2μL(0.1二硫苏糖醇(DTT), 1μL (M-MLV逆转录酶(RT)添加到反应混合物,然后互补脱氧核糖核酸合成反应通过骑自行车25°C执行10分钟,50分钟37°C, 70°C,持续15分钟。

2.5。人乳头瘤病毒基因分型结果使用PCR-REBA

一个REBA HPV-ID®PCR-REBA测试(码诊断、龙仁市、韩国),一个“嵌套PCR”方法被用来放大目标区域MY11-MY9和GP5-GP6之间使用两对引物,用于HPV基因分型。使用20 PCR进行μL反应混合物(Genetbio、大田、韩国)组成的2×大师,1×引物混合物,3μL样本的DNA,无菌去离子水(DW)。这种混合受到PCR循环条件包括94°C 5分钟(predenaturation),其次是15 94°C的周期30年代(变性)和30年代55°C(退火),45周期30年代的94°C(变性)和52°C 30 s(退火)和最后一个周期72°C的7分钟(链合成)。然后放大biotin-labeled PCR产品变性(25°C, 5分钟)变性解决方案,970年稀释μL杂交的解决方案,应用于REBA在印迹膜带托盘,和杂化(50°C, 30分钟)所需的探测。膜条然后洗两次,1毫升的清洗解决方案(50°C, 10分钟,温柔颤抖),在孵化前(25°C, 30分钟),streptavidin-alkaline磷酸酶(美联社)共轭(罗氏诊断,曼海姆,德国)稀释(1:000)共轭稀释剂(CDS)的解决方案。两个决赛后洗1毫升cd(室温下,1分钟),比色杂交信号通过孵化一个电视台/ BCIP可视化解决方案(1:50稀释,罗氏诊断)足够的时间来检测酶的转换电视台/ BCIP衬底的形式。由此产生的乐队被读取和解释模式。

2.6。多路复用定量逆转录酶(RT-Q) PCR分析

人乳头状瘤病毒E6 / E7,hTERT,Ki67mRNA表达颈椎标本是评估通过多路复用RT-qPCR TaqMan执行使用CervicGen HPV的检测E6 / E7和hTERT-Ki67信使rna RT-qDx化验用品(Optipharm Osong,韩国)和排名- 96实时PCR系统(Bio-Rad、大力神、钙、美国)热循环和荧光检测。实时PCR扩增人乳头状瘤病毒E6 / E7信使rna进行混合反应包含10μL 2×雷鸟探针qPCR混合(Toyobo,大阪,日本),5μL底漆和TaqMan探针的混合物,和5μL(模板互补。实时PCR扩增hTERT和Ki67信使rna进行混合反应包含10μL 2×雷鸟探针qPCR混合(Toyobo,大阪,日本),3μL底漆和TaqMan探针的混合物,2μL模板cDNA、和足够的DW最后20卷μl .包括积极的和消极的控制整个过程,同样,没有模板控制(包含无菌DW代替模板DNA)与每个PCR被放大。利用PCR循环条件由95°C 3分钟,其次是41周期3 s的95°C, 30多岁和55°C。每个信使rna表达水平被确定量化“循环阈值”(CT),这是荧光PCR循环所需的数量超过一个值明显高于背景荧光。为了避免假阴性结果的一代由于信使rna降解,glyceraldehyde-3-phosphate脱氢酶的表达水平(GAPDH作为内部控制。六个样品HSIL组和四个样品的正常组不显示GAPDH价值;因此,他们被排除在以下实验。换句话说,研究者进行实验以104 HSIL、46正常样本。相对于目标基因mRNA表达水平GAPDH是自动计算根据比较C_t方法,使用它Manager v1.6 (Bio-Rad)或Genex (Bio-Rad)软件。使用比较C基因表达进行评估_t(ΔΔC_t)方法,信使rna表达水平表示相对于参考基因的表达水平。hTERT和Ki67分析滑动样本中表达水平没有HSIL病人被认为表示“基线”每个基因的表达水平。

2.7。统计分析

统计分析使用GraphPad棱镜软件版本5.02(美国GraphPad拉霍亚,CA)。学生的t95%可信区间(CI),以及和ROC曲线是用来评估统计学意义生成的数据。科恩kappa系数衡量两个评级机构之间协议的定性项目也使用。

3所示。结果

3.1。组织学和细胞学诊断的临床标本

所有幻灯片样本分析证实展览癌前状态,宫颈上皮内瘤(CIN) III。此外,组织学和细胞学方法被用来证实诊断为HSIL在110相关的幻灯片。患者HSIL(范围年满10 - 79)被发现主要是年龄在30岁至39岁(36/104的患者中,34.62%)或40 - 49(35/110的患者中,33.65%)年。数量较小的HSIL 20到29岁的患者(11/104的患者中,10.58%)或50 - 59(12/104的患者中,11.54%)年,和很少大于或小于20 59岁(表1)。

3.2。REBA人乳头状瘤病毒感染状况的分析分析HSIL临床标本

104幻灯片的剥落HSIL cervical-cell样本,83(79.81%)被发现感染了至少一个HPV基因型,其中26例(25%)与多个(即被感染。两个以上)HPV基因型。其中83例,56个(53.85%)被确定是感染高危HPV基因型(人力资源),而一个病例(0.96%)显示感染低风险(LR) HPV基因型(表2)。26例中发现感染多种HPV基因型,21个(20.19%)被证明是感染HR-HPV基因型,5个(4.81%)被确定是感染了人力资源和LR-HPV基因型,并没有发现病例感染LR-HPV基因型。

3.3。人乳头瘤病毒基因型分布的临床样本分析

如构建累积图(图所示1),在患有乳腺癌最常检测HPV基因型剥落cervical-cell样本是人乳头状瘤病毒16(累积比例40.22%),其次是人乳头状瘤病毒52(55.43%),58(66.30%),31日(77.17%),18(84.78%),33(90.22%),35(94.57%),66年(97.83%),84年(98.91%)和45(100%)。

3.4。hTERT和Ki67信使rna表达水平取决于RT-qPCR

我们RT-qPCR进行分析hTERT和Ki67表达水平在104年HSIL-diagnosed清新cervical-cell样本。不排除样品GAPDH表达水平,我们决定,98(94.23%)和49(47.12%)的104剩余HSIL样本阳性hTERT和Ki67分别为mRNA表达(图2)。

3.5。一致的表达hTERT或Ki67与人乳头状瘤病毒E6 / E7信使rna在HSIL临床样本分析

RT-qPCR进行分析的结果表明,104年(nonexcluded) HSIL样本,80(76.92%)人乳头状瘤病毒是积极的E6 / E7和hTERT3(2.88%)人乳头状瘤病毒阳性E6 / E7,18例(17.31%)阳性hTERT只有,三人乳头状瘤病毒阳性(2.88%)E6 / E7,但负hTERT(表3)。相反,38(36.54%)的104个样本被证明是积极的对人乳头状瘤病毒E6 / E7和Ki67表情,45(43.27%)人乳头状瘤病毒阳性E6 / E7表达式,11例(10.58%)阳性Ki67表达式,10(9.62%)人乳头状瘤病毒阳性E6 / E7,但负hTERT表达式(表4)。

3.6。人乳头状瘤病毒的结合E6 / E7,hTERT,Ki67信使rna表达

积极率分别为90.38%(94/104)的组合人乳头状瘤病毒E6 / E7和Ki67信使rna表达,96.15% (100/104)hTERT和Ki67信使rna表达,为97.12 (101/104)人乳头状瘤病毒E6 / E7和hTERTmRNA表达,98.08%(102/104)的人乳头状瘤病毒E6 / E7,hTERT,Ki67信使rna表达(图3)。

4所示。讨论

先前的研究是与FFPE临床组织样本进行(16]。这是适当确定可用性生物标志物的组织样本,因为组织样本收集精确只有通过显微镜和癌变区域包含IHC检测。我们还证实,hTERT Ki67 mRNA表达可以互补生物标志物诊断宫颈病变组织样本。在目前的研究中,显微镜载玻片宫颈脱落细胞样本收集从受试者诊断为健康或HSIL和HPV基因型筛选,评估的有效性hTERT和Ki67表达式作为宫颈癌的诊断标志物。宫颈脱落细胞在被放置到一个幻灯片目前用于筛选试验标本,因为他们伴随着微创和劳动密集型的过程比其他测试17,18]。他们暴露在空气中,需要制冷的条件,所以他们的存储周期是有限的。最重要的是,癌前病变样本相对较少比较正常样本,还有不知道多少时间需要收集到足够的样本进行统计分析。事实上,HSIL样本,这是最严重的癌前病变,在韩国和中国收集了三年多,但大约有50个样本(16,19]。相比之下,显微镜载玻片与加拿大香脂密封在真空状态,所以他们贮藏期相对较长。事实上,没有差别的管家基因表达之间的样品5年。和幻灯片总是准备细胞学试验作为常规筛查试验。这些因素使采集大量HSIL样本超过100容易和立即。因此,幻灯片是足够的标本为回顾性队列研究。有几个与幻灯片回顾性研究;然而,他们主要是目前有限的外观检查染色(20.- - - - - -23]。第一次,分子测试与显微镜载玻片进行这项研究。验证核酸降解和变化,分析进行内生控制基因在实验。

结果表明,HR-HPV感染与宫颈癌密切相关进展比LR-HPV上下文中的一个或多个人类乳头瘤病毒感染(表1)。此外,最常检测HPV基因型在患有乳腺癌HSIL标本是人乳头状瘤病毒16日,而且值得注意的是,人乳头状瘤病毒的检出率18幻灯片低于组织样本。

宫颈癌肿瘤形成启动和人乳头状瘤病毒癌基因蛋白介导通过upregulation E6、E7的过度E6 / E7信使rna转录本已被证明是风险显著增加癌前组织(CIN)和宫颈癌的24]。的假设E6 / E7表达水平可能是宫颈癌的具体和有效的预测风险由本研究的结果支持,显示使用的敏感性E6 / E7信使rna RT-qPCR测定79.81%在104年cervical-cell样本分析剥落了。它表明宫颈癌发生可能影响其他因素不仅人乳头状瘤病毒。因此,hTERT和Ki67证实了组织样本(16也被应用。的敏感性hTERT信使rna RT-qPCR 104份临床样本的筛选是94.23%,而Ki67筛选仅为47.12%。有趣的是,一项研究表明hTERT在细胞学mRNA表达要高于从高档宫颈病变组织样本,而相反的,Ki67组织的mRNA表达被发现高于细胞学样本高档宫颈病变(20.]。机制这个观察到的差异标记基因表达在细胞学和组织学样品还有待阐明。

而hTERT和Ki67mRNA表达只有94.23%和47.12%的检测分析细胞学样本,分别结合HPV筛查E6 / E7和Ki67,人乳头状瘤病毒hTERT和Ki67,人乳头状瘤病毒E6 / E7和hTERT信使rna表达了90.38%、96.15%、和97.12%的样本,分别(图3)。此外,重合的HPV筛查E6 / E7,hTERT,Ki67mRNA表达导致了RT-qPCR检测灵敏度为98.08%,表明这是一种很有前途的诊断HSIL标记的组合。

目前的研究表明使用的有效性分析显微镜载玻片的non-HPV标记和识别小说首次诊断癌前期和癌症生物标记。进一步的研究需要评估的适用性作为诊断标记低度鳞状上皮内病变(LSIL)和/或宫颈病变的恶化的指标。

数据可用性

生成的数据集和分析在当前的研究中不公开的专利申请,但由于可从相应的作者以合理的要求。

伦理批准

所有科目提供书面知情同意参与这项研究,这是制度伦理委员会批准Wonju延世大学医学院(批准号CR315052)。

同意

这是国家,我充分允许出版。

的利益冲突

作者宣称他们没有利益冲突,和所有作者都应确认其准确性。

作者的贡献

Jemberu意甲收集病人临床资料和标本。Kwangmin Yu进行实验。病人Geehyuk金分析和解释数据。所有作者阅读和批准最终的手稿。

确认

这项研究受到了基础科学研究项目通过韩国国家研究基金会(NRF),由科技部资助,ICT和未来规划(2015 r1a2a2a04004455)。这项工作也支持(部分)的延世大学研究基金会2018年。

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