tempo通过抑制一氧化氮的产生来减轻神经性疼痛

摘要

背景．神经性疼痛不仅影响个体的生活质量，而且增加了社会的经济负担。需要治疗以减轻神经性疼痛。方法．将50只大鼠随机分为假手术组、脊髓神经结扎组和3个不同剂量的tempo治疗组(分别为100、200、300 mg/kg)，每组10只。采用脊髓神经L5和L6结扎建立神经性疼痛模型。术前(第0天)和术后(第1、3、5和7天)分别检测机械异位痛和热痛觉过敏。术后7天检测脊髓一氧化氮水平以及一氧化氮合酶和乙酰胆碱酯酶的活性。结果．与脊髓神经结扎组比较，Tempol治疗组大鼠对机械疼痛和冷板刺激的反应降低。高剂量的tempo会产生更大的衰减效应。tempo处理降低了一氧化氮水平和一氧化氮合酶活性，而乙酰胆碱酯酶活性未见显著变化。结论．坦波尔通过抑制一氧化氮的产生减轻了实验性神经性疼痛模型大鼠的疼痛。

1.介绍

神经性疼痛是由外周或中枢神经系统的原发疾病引起的[1］．它是一种慢性疼痛，不仅影响个人生活质量，也增加了社会的经济负担[2］．治疗神经性疼痛时推荐使用抗抑郁药、抗惊厥药或阿片类药物，但许多患者不能得到满意的反应或出现不良反应[3.，4］．因此，发展新的治疗策略神经性疼痛是必要的。

许多因素已被证实有助于神经性疼痛的发展。活性氧和一些神经递质，如乙酰胆碱，参与了神经性疼痛的发病机制[5- - - - - -8］．抗氧化剂可改善神经性疼痛患者的疼痛评分和生活质量[9］．tempo(4-羟基-2,2,6,6-四甲基哌啶n -氧基)是一种新发现的抗氧化剂。研究表明，在实验大鼠模型中，tempo可以增加对胰岛素治疗的敏感性，并减缓高血压的发展[10］．然而，关于Tempol治疗神经性疼痛作用的研究有限[11］．

在目前的研究中，我们报道了tempo对实验性大鼠神经性疼痛模型的影响。我们研究了大鼠的行为变化，一氧化氮水平，一氧化氮合酶和乙酰胆碱的活性。我们的结果表明，Tempol可以减轻大鼠的神经性疼痛，可能是由于抑制一氧化氮的产生。

2.材料和方法

2．1．动物

成年Sprague-Dawley大鼠50只，雄性，体重180 ~ 200 g，北京大学医学系动物护理中心。喂食标准的鼠粮和水随意并单独保存在塑料盒中，在室温下进行12小时的光-暗循环。本研究方案经北京大学动物伦理委员会批准，所有程序均按照国家卫生研究院《实验动物护理和使用指南》和《动物福利法》进行。

2．2．研究协议

将大鼠随机分为5组，即假手术组、脊髓神经结扎(SNL)组、低tempo组(100 mg/kg)、中tempo组(200 mg/kg)和高tempo组(300 mg/kg)，每组10只。如前所述，通过脊髓神经结扎建立大鼠神经病理性疼痛模型[12］．简单地将大鼠置于水合氯醛(300 mg/kg，腹腔注射)麻醉下俯卧位。背部中线处做了皮肤切口。分离左侧棘旁肌和部分切除L6横突后，显露L4、L5和L6神经根。除假手术组外，其余各组均采用6-0丝线结扎L5、L6神经。所有大鼠术后肌肉注射100万单位青霉素预防感染。天泊酚低、中、高剂量组分别腹腔注射100、200、300 mg/kg天泊酚。在术前(第0天)和术后第1、3、5和7天测量机械疼痛和冷痛阈值。术后第7天处死大鼠，测定脊髓液一氧化氮水平、一氧化氮合酶和乙酰胆碱酯酶活性。

2.3。机械异位痛的测量

机械性异位痛通过50%的爪退缩来量化，反应来自von Frey纤维的机械刺激，使用上下法[13］．简单地，大鼠在带有金属网地板的有机玻璃室中习惯15分钟。von Frey纤维在大鼠左后足跖中表面敷4秒。当观察抬爪或舔爪时，记录阳性反应。由身体动作引起的爪后退缩不计入阳性反应。使用8条von Frey单丝，力分别为1.0、1.4、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0和15.0 g。首先，施加2.0 g力的长丝。然后，如果有一个积极的反应，测试下一个较弱的灯丝，而如果有一个消极的反应，测试下一个较强的灯丝。这些试验随着力的逐渐增加或减少而继续进行，直到出现与前一次试验不同的反应。每根不同受力的灯丝测试5次，间隔30秒。 The number of positive responses for each filament tested was recorded. If the positive responses were no less than 3 times in these 5 stimulations, a positive rate for maximal force was calculated as the percentage of positive response. If the positive responses were less than 3 times, the positive rate for minimal force was calculated. Fifty percent paw withdrawal threshold was calculated as ．如果需要超过15克或少于1.0克才能引起阳性反应，则记录50%的爪子撤离阈值为15.0克或1.0克。

２.４.热痛觉过敏的测量

老鼠对冷刺激的反应是通过把老鼠放在有温度的冷板上测试的 ．在大鼠停止探查活动5分钟后，由一名不知道大鼠分组的检查员记录5分钟内缩爪的次数。没有记录由于身体活动或动作而引起的爪脱。

2．5．脊髓一氧化氮水平及一氧化氮合酶、乙酰胆碱酯酶活性的测定

术后第7天处死大鼠，取突出的腰椎段脊髓。用冷生理盐水洗净血液后，将脊髓组织在匀浆器中研磨制成脊髓组织匀浆。按照生产厂家(南京建城生物工程研究所，中国南京)提供的方案检测一氧化氮(NO)水平、一氧化氮合酶(总型(tNOS)、诱导型(iNOS))和乙酰胆碱酯酶活性。

2．6．数据分析

研究结果包括50%的缩回阈值、在冷板上抬起脚掌的次数、脊髓NO水平、NOS (tNOS和iNOS)和乙酰胆碱酯酶活性。结果显示为 ．采用单因素方差分析(one-way ANOVA test)比较各组间差异(SPSS, version 13.0)。 被认为具有统计学意义。

3.结果

3．1.机械性异位痛和热痛觉过敏

每组10只，共50只。所有的老鼠都完成了研究。

与术前0天相比，假手术组大鼠50%缩足阈值、冷板提足次数变化均无统计学意义。而SNL组的大鼠在统计学上显著降低了50%的缩爪阈值，增加了在冷板上抬起爪子的次数(图)1)．

与SNL组相比，Tempol治疗组大鼠的50%缩足阈值下降不明显，在冷板上提足次数增加。这些影响在术后第1天观察到，并持续到研究结束(第7天)。与低剂量Tempol组(100 mg/kg)相比，接受高剂量Tempol(200和300 mg/kg)注射的大鼠与SNL组相比有更显著的差异(图)1)．

3．2．一氧化氮水平及一氧化氮合酶和乙酰胆碱酯酶活性

与假手术组比较，术后SNL组大鼠NO水平升高，NOS和乙酰胆碱酯酶活性升高。随着Tempol剂量的增加，大鼠NO水平和NOS活性显著降低(图)2)．

4.讨论

在目前的研究中，我们发现Tempol可以缓解神经性疼痛模型大鼠的机械性疼痛和热痛觉过敏。Tempol还能降低脊髓NO水平和NOS活性。NO是一种自由基分子，其产生受NOS控制，自由基参与神经性疼痛的发生发展。我们的结果表明，Tempol可以通过抑制一氧化氮的产生来减轻神经性疼痛。

神经性疼痛是由于外周或中枢神经系统的紊乱，其特征是痛觉过敏、感觉异常和自发性疼痛[1］．最近的研究表明，氧自由基参与了神经源性疼痛的发生和维持。具有抗氧化活性的物质可缓解氧自由基活性，并有可能缓解神经性疼痛。Tempol是一种新的抗氧化剂，已被证明可以减少氧化应激，改善胰岛素敏感性，并缓解实验性机械痛觉过敏。然而，关于tempo对神经性疼痛影响的研究有限[11］．

在本研究中，我们成功建立了L5和L6脊髓神经根结扎神经源性疼痛模型。只进行脊髓神经根结扎而不进行Tempol处理的大鼠，在冷板上抬起足爪的次数显著增加，足退阈值降低50%。在Tempol治疗下，老鼠在这两种测量结果上显示出了剂量依赖性的缓解，剂量越大，对实验诱发的疼痛的保护作用就越大。这表明Tempol可以减轻这些实验大鼠的神经性疼痛。

在目前的研究中，我们进一步研究了Tempol对神经性疼痛的潜在作用机制。我们选择检测脊髓NO水平和NOS活性，因为NO是一种自由基分子，据报道参与神经性疼痛的发展[14］．NO合成由限速酶NOS控制[15］．不依赖钙的氧化物合酶(iNOS)是NOS的一种重要形式，参与感染和炎症过程[16］．iNOS水平的增加会导致NO的产生增加，从而进一步激活星形胶质细胞。这些活化的星形胶质细胞可以产生大量的前列腺素，从而增加神经元对疼痛刺激的兴奋性[17］．我们的研究结果显示，SNL组大鼠的NO水平以及TNOS和iNOS活性较假手术组大鼠升高，提示疼痛敏感性升高可能是由于NO的产生增加所致。tempo处理可以降低NO产量，降低机械和热刺激的敏感性。这表明Tempol的镇痛作用可能是通过抑制NOS和NO的产生而介导的。

乙酰胆碱参与神经元活动的调节。先前的研究报道乙酰胆碱与神经性疼痛有关[7，8］．在目前的研究中，我们发现SNL组与假手术组相比，乙酰胆碱酯酶活性增加。乙酰胆碱酯酶是乙酰胆碱代谢的主要酶。SNL组乙酰胆碱酯酶活性升高提示乙酰胆碱水平降低参与神经性疼痛。这与之前的研究报告一致[18］．我们未观察到SNL组和Tempol组脊髓乙酰胆碱酯酶活性的显著差异，提示Tempol对神经性疼痛的作用可能不是由乙酰胆碱介导的。

综上所述，坦波尔对实验性神经性疼痛模型大鼠有明显的镇痛作用。这种效应可能是通过抑制NO的产生来介导的。tempo是一种新型的抗氧化剂，具有分子量小、性能稳定、细胞通透性好、无毒等优点。虽然在临床实践中尚未见Tempol用于治疗神经性疼痛的报道，但动物实验结果显示了良好的前景。

数据可用性

用于支持本研究发现的数据可由通讯作者要求提供。

的利益冲突

我们声明，我们与可能不恰当地影响我们工作的其他人或组织没有财务或个人关系，并且在任何产品、服务和/或公司中没有专业或其他任何性质的个人利益，可能被解释为影响手稿。

作者的贡献

贾东林、王欢对这项工作贡献相当。

致谢

本研究由国家杰出领导人才培养计划(批准号:青年医学人才培养计划(批准号:PWR12013-03);上海市浦东地区卫生局。

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