TEEG诱导A549细胞自噬通过调节PI3K / AKT / mTOR信号通路

文摘

TEEG (3β、16β、23-trihydroxy-13 28-epoxyurs-11-ene-3-O -β-D-glucopyranoside)来源于氯仿提取的中药配方Shenqi圣(CE-SS)。在目前的研究中,我们旨在阐明抗癌的效果和可能的分子机制的作用TEEG对人类非小细胞肺癌(NSCLC)细胞株A549体外。A549细胞与不同浓度的TEEG孵化。细胞增殖是通过MTT试验评估。自噬被免疫荧光染色法评估。Autophagy-associated考察了蛋白质免疫印迹分析。浓度的方式TEEG明显抑制A549细胞增殖。免疫荧光染色显示TEEG诱导A549细胞自噬。LC3-II: LC3-I转化率和Beclin-1的表达,Atg5, Atg7, Atg12 TEEG浓度的增加。此外,增加TEEG浓度增强第三类的表达p-PI3K p-PI3K类的表达减少,p-AKT p-mTOR, p-P70S6K。 These results indicate that TEEG induces autophagy of A549 cells through regulation of the PI3K/AKT/mTOR signaling pathway.

1。介绍

非小细胞肺癌(NSCLC)是呼吸系统最常见的恶性肿瘤,目前被认为是全世界癌症相关死亡的主要原因之一1]。虽然靶向治疗的出现改善了结果在非小细胞肺癌患者的一个子集,总体5年生存率仍不到15%。因此,识别的安全有效的药物治疗非小细胞肺癌是至关重要的(2,3]。显着改善肺癌患者的生存时间是归因于目前的治疗方法,包括手术、放疗、化疗;但是,整体治疗的疗效仍不满意(4]。因此,可靠的调查和临床相关的替代方法是当前研究的焦点。

中国传统医学(中医)在西方已成为越来越受欢迎。美国国家癌症研究所(NCI)每年花费大约1.2亿美元在补充和替代医学相关研究项目,包括中医(5,6]。近年来,研究从植物中提取天然单体产品的显示效果在治疗肿瘤,和越来越多的中药配方,提取已报告有一个可靠的非小细胞肺癌疗效[7- - - - - -9]。

自噬扮演主要角色在决定细胞命运,参与发展,细胞内稳态,生理和病理过程。自噬是一个离散的细胞过程,是由不同种类的监管和刽子手分子(10,11]。先前的研究表明,抑制mTOR / PI3K / AKT信号诱导细胞凋亡和自噬在A549细胞(12]。我们曾表明,中药配方Shenqi圣(CE-SS)促进A549细胞凋亡和对小鼠的镇痛作用[13,14]。我们孤立TEEG (3β、16β、23-trihydroxy-13 28-epoxyurs-11-ene-3-O -β从CE-SS -D-glucopyranoside)氯仿提取,证明TEEG对A549细胞产生很强的抑制作用。尽管自由基清除和抗菌活动之前已经证明(15)的生物活性TEEG仍有待澄清。重要的是,TEEG对A549细胞的抑制作用尚未报道。因此,在这项研究中,我们调查了可能TEEG抑制A549细胞增殖的分子机制。

2。材料和方法

2.1。细胞培养

A549细胞获得武汉大学(武汉,中国)。在rpmi - 1640细胞培养介质(Gibco,医学博士,美国)补充10%胎牛血清(的边后卫)(Gibco,医学博士,美国)和100 U的青霉素G 100μ克每毫升链霉素。细胞在37°C下5%孵化有限公司₂在湿润的气氛中。

2.2。细胞增殖实验

96 -孔板A549细胞孵化24 h的密度 细胞每三个二级孔。不同浓度的细胞治疗后(1、2、4、6和8μ克/毫升)的TEEG 24 h, 10μl MTT(σ,密苏里州,美国)被添加到每个。细胞培养另一个4 h后,上层清液被删除,甲瓒产品获得于150年解散μl二甲亚砜(DMSO)(σ)与搅拌10分钟qb - 9001微孔快速瓶(Kylin-Bell实验室仪器有限公司、江苏、中国)。吸光度是阅读在490 nm使用火花10米标(Tecan、Mannedorf、瑞士)。

2.3。免疫荧光染色

A549细胞被播种到six-well板( 细胞/毫升)和处理6μg / ml TEEG 12 h。细胞被固定在4%多聚甲醛20分钟紧随其后使用0.1% Triton x - 100膜透化作用30分钟。与PBS洗涤后,幻灯片被封锁在室温下以5% BSA 1 h,随后孵化一夜之间在4°C Alexa萤石®488共轭LC3I / II XP®兔子马伯(1:400)(细胞信号技术、马、美国)。细胞被与DAPI染色(1μg / ml)(中国Biosharp) 5分钟,用PBS洗了三次。最后,使用共焦激光扫描显微镜系统信号可视化(德国徕卡TCS SP2)。

2.4。免疫印迹分析

细胞被播种在six-well板( 细胞每)。附件后,细胞治疗与不同浓度(1、2、4、6μg / ml)的TEEG 6 h。细胞细胞溶解,并添加蛋白酶抑制剂的鸡尾酒是为了获得量化整个蛋白质含量。蛋白质的溶解产物被煮5分钟加载缓冲区。收集上清液和蛋白质(40μg)解决了钠十二烷基sulfate-polyacrylamide凝胶电泳(sds - page);凝胶12%)。分离蛋白被转移到聚偏二氟乙烯膜(美国微孔)和屏蔽5%脱脂牛奶在室温下2 h。膜在一夜之间被孵化在4°C以下主要检测抗体稀释阻断缓冲区根据制造商的指示:anti-Class我p-PI3K (p85) anti-Class三世p-PI3K (p85) (Abgent、苏州、中国),anti-p-AKT (Ser473) anti-p-mTOR (Ser2448) anti-p-p70S6K (Thr389) anti-Class我PI3K (p85) anti-AKT, anti-P70S6K, anti-LC3-I / II, anti-Beclin-1, anti-Atg5, anti-Atg7 anti-Atg12,反β肌动蛋白(细胞信号技术)。与Tris-buffered盐水洗涤三次后(TBS)含有0.5% ( )Tween-20,膜被孵化2 h在室温下与HRP-conjugated二级检测抗体稀释在阻止缓冲区根据制造商的指示。与TBS洗涤三次后,墨迹都使用一种ECL检测试剂开发(美国Bio-Rad)和分析使用了FluorChem一个FC3系统文件(ProteinSimple、钙、美国)。

2.5。统计分析

执行统计分析使用SPSS统计24.0(美国纽约IBM)。数据被表示为 偏差(SD)的值从至少三个独立的实验。数据分析使用单向方差分析(方差分析)。的值 被认为是表示一个统计上的显著差异。

3所示。结果

3.1。TEEG减少A549细胞的增殖

如图1,随着TEEG浓度的增加,细胞A549细胞生存能力明显下降的价格相比控制( 和 )。half-maximal抑制浓度(IC₅₀)的A549细胞TEEG为4.9μ克/毫升。的A549细胞的异常治疗24 h与1,2,4,6,8μg / ml TEEG分别为83.13%,76.23%,70.04%,30.47%,和27.35%,分别。因此,A549细胞生存能力降低剂量依赖性的方式。

3.2。TEEG诱导A549细胞自噬

自噬体球形结构参与多级过程涉及许多与双层膜蛋白质。结合导致LC3的可溶性形式的转换(LC3-I)自噬vesicle-associated形式(LC3-II),用作标记的自噬(16,17]。通过免疫荧光检测自噬体的形成可以被可视化为LC3在这些细胞器积累。增加LC3-II表达式被TEEG诱导(数字2(一个)和2 (b)),这表明TEEG诱导A549细胞的自噬。进一步证实自噬的诱导TEEG-treated A549细胞,我们调查了LC3-II: LC3-I转化率。治疗组(1、2、4、6μg / ml), LC3-II: LC3-I转换比率分别为1.2,1.8,3.1,和6.2倍,分别比对照组(图2 (c))。如数据所示2 (b)和2 (d)Beclin-1显著调节治疗组(6μg / ml; ),虽然Atg5、Atg7 Atg12显著下调(4和6μg / ml; 和 )。这些结果表明,TEEG诱导自噬抑制A549细胞的增殖。

3.3。mTOR / PI3K / AKT通路参与TEEG-Induced自噬

PI3K / AKT / mTOR信号通路已经被证明参与自噬(12]。探讨PI3K / AKT的参与/ mTOR TEEG-induced自噬通路,我们分析了autophagy-related蛋白的表达在A549细胞治疗TEEG西方墨点法。如图3,第三类的表达p-PI3K显著调节TEEG-treated组相比,对照组( )。相反,类的水平我p-PI3K p-mTOR明显下调细胞治疗6μg / ml TEEG ( 和 ),和水平的p-AKT p-P70S6K明显下调细胞处理4和6μg / ml TEEG ( 和 ,分别)。然而,类我PI3K的水平,一种蛋白激酶,p70S6K被TEEG待遇不变。这些结果表明,mTOR / PI3K / AKT通路参与TEEG-induced在A549细胞自噬。

4所示。讨论

天然产物一直广泛应用治疗有效药物的重要来源,及其在肿瘤预防和治疗的重要性越来越明显(18]。此外,越来越多的中国草药提取物已被证明具有抗炎,抗氧化,antiliver纤维化和抗癌作用[19- - - - - -22]。这些发现表明,中国草药和提取有很大的潜在的治疗许多疾病。

自噬是II型细胞死亡过程孤立的细胞细胞器,长寿蛋白质,和胞质部分,导致自噬小体的形成。这个double-membraned结构与溶酶体融合形成一个修改后的结构被称为自吞噬泡,最终退化(23,24]。在这项研究中,免疫荧光检测autophagy-related因素显示,TEEG增强LC3表达式,表明TEEG抑制A549细胞增殖,诱导自噬。自噬体的形成发生通过两个途径:Atg12-Atg5-Atg16通路和Atg4-Atg7-Atg3通路。结合导致LC3的可溶性形式的转换(LC3-I)自噬vesicle-associated形式(LC3-II),用作标记的自噬(25]。LC3-II: LC3-I转换比率是用来评估水平的自噬的非小细胞肺癌(26,27]。此外,我们的后续调查证明Beclin-1 TEEG移植的能力水平,Atg5, Atg7, Atg12和增加LC3-II: LC3-I转化率。这些发现表明TEEG诱导A549细胞自噬通过Atg12-Atg5-Atg16和Atg4-Atg7-Atg3途径增加自噬小体的形成和调节autophagy-related蛋白的表达;然而,具体的机制需要进一步调查。

mTOR / PI3K / AKT通路的监管是必要的增长,增殖,细胞周期、转移、凋亡和自噬28- - - - - -30.]。自噬也受PI3K III型,这是一个组成部分包括Beclin-1 multiprotein复杂。pi3k(我类和III类)是一个家庭的酶参与自噬信号。第三类pi3k可以促进自噬。一般来说,激活类的我PI3K抑制自噬通过行之有效的PI3K / AKT / mTOR(机械的雷帕霉素靶)复杂1 (mTORC1)途径31日- - - - - -33]。在这项研究中,我们表明,TEEG治疗抑制类我PI3K的磷酸化和促进了第三类PI3K的磷酸化A549细胞。这表明TEEG诱发自噬在A549细胞通过调节我PI3K和III类PI3K两类。自噬的调节是一个高度复杂的过程,涉及许多信号复合物和通路,以TOR (mTOR哺乳动物)为核心球员(34]。作为PI3K-related激酶家族的一员,mTOR与细胞增殖和细胞代谢有关。之前的研究表明,抑制mTOR AKT及其下游目标有助于启动自噬的35]。同时,mTOR PI3K / AKT的下游是一个重要的目标,积极调节p70S6K;PI3K / AKT / mTOR是一个重要的细胞内信号通路在调节细胞生存和死亡。通过PI3K / AKT信号/ mTOR通路控制增殖,细胞凋亡和细胞自噬36,37]。这是符合我们的研究结果显示,TEEG抑制一种蛋白激酶的磷酸化,mTOR, p70S6K A549细胞中表达。我们的研究结果表明,TEEG诱导A549细胞自噬通过调节PI3K / AKT / mTOR信号通路。

总之,我们得出这样的结论:TEEG抑制A549增殖诱导自噬通过PI3K / AKT / mTOR信号通路。因此,当前研究的结果进一步阐明潜在的抗肿瘤作用机制TEEG;然而,进一步的研究需要一个全面的说明的机制。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的发现可以从相应的作者。

的利益冲突

所有作者声明没有金融竞争的利益。

作者的贡献

鲁史和皮涂了同样的工作。

确认

这项研究得到了湖北省自然科学基金(2018号cfb657)、中国博士后科学基金会(2016号m592320)和江汉大学的博士科研基金(08250001)。

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