基于质谱的蛋白质组学特征的深入鉴定揭示了与肝转移性结直肠癌相关的新特征蛋白

抽象

肝转移是转移性结直肠癌中最常见的一种。肝脏转移性结直肠癌蛋白丰度的整体变化及其在转移建立中的作用尚未得到全面分析。在本研究中，使用多路TMT标记策略，通过定量蛋白质组学分析每位招募患者的新鲜冷冻组织样本，包括正常结肠/局部/肝脏转移CRCs。从所有样本中定量了大约5000个蛋白质组。局部/转移性CRCs的蛋白质组学特征与正常结肠组织差异很大;差异蛋白主要来自细胞外区域，参与免疫活动，对肿瘤微环境中的慢性炎症信号通路至关重要。进一步统计分析发现，47个蛋白在局限性CRCs和转移性CRCs之间具有统计学意义，其中FILI1P1和PLG首次在蛋白质组数据中被发现，与CRCs的肝转移高度相关。

1.简介

结直肠癌(Colorectal cancer, CRC)是全球第三大常见癌症，全球每年约有190万新发病例[1- - - - - -3.]。它是导致癌症死亡的主要原因之一[4,5]。大肠癌患者的高死亡率很大程度上是因为晚期大肠癌发生转移时诊断较晚[6]。早期局限性CRC患者的5年生存率一般为>50%，而远处转移患者的5年生存率则急剧下降到不到10% [7,8]。肝转移该疾病的过程中表示转移CRC的最常见的形式（〜50％）[9,10]。结直肠癌肝转移患者的中位生存时间只有5-10个月[11- - - - - -13，主要是由于缺乏有效的治疗方法[6,14]。虽然手术切除转移瘤对某些病人是可行的[15，仅将这些患者的5年生存率提高到~30% [16]。

转移是一个复杂的过程，在这个过程中，癌细胞获得了迁移和适应远处微环境的能力[17- - - - - -20.]。它已经被高度要求识别关键分子，可以提供分子的见解，以解决这些异质性，但机械有趣的过程的未知病因。为了揭示CRC转移的遗传格局，并系统地了解有利于转移的细胞机制，进行了多项基因组测序研究，发现在致癌信号通路中存在大量高复发性突变[21- - - - - -25]。在蛋白质组学领域，已经开展了一些开拓性的研究，以发现用于诊断的标记蛋白。然而，许多研究都是针对福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)组织样品，由于蛋白质交联问题以及样品制备过程中不可避免的蛋白质损失(多步脱蜡)，在蛋白质组学分析中存在固有的缺点[26]。由于技术的进步，具有高的分辨率和灵敏度质谱仪已成为选择用于蛋白质和蛋白质组的复用的和定量的分析方法。在本研究中，我们进行了使用新鲜冰冻CRC患者的组织样本的综合复用蛋白质组分析。对于每位患者，我们收集和分析结肠/直肠癌/转移性的组织来识别不仅来自不同患者之间的平均数据的蛋白质组的变化，如在几个报道的研究[呈现21,27,28，而且也来自相同的遗传背景。这些结果将加深我们对CRCs分子指纹图谱的认识，并指导精确的治疗和预后处理。

2.材料和方法

2.1。病人群

本研究的所有患者均收到知情同意书，本文的所有实验工作均获得新华医院审查委员会和伦理委员会的授权。

从新华医院获得9例患者的27例新鲜冷冻组织样本，包括肿瘤组织和相应的结肠旁组织以及肝脏转移组织(人口统计资料见表)1)。本例患者不与任何preradio-或化疗。每个招募样品的组织学是通过使用苏木精和eosin-（HE-）染色的切片两位病理学家评估。对于混乱的情况下和分歧，第三病理学家将作进一步的讨论。

2.2。组织匀浆和蛋白提取

在仔细检查所有的组织学信息后，将裂解缓冲液加入每个组织样本中，并将其切成非常小的块。根据我们之前的研究报道，裂解缓冲液中含有0.2%的酸性不稳定表面活性剂(ALS)，在20 mM HEPES缓冲液中加入1X蛋白酶抑制剂(瑞士罗氏公司)[29]。将所有的样品分别置于4℃预冷陶瓷珠的均质管中。均质后，在冰上保存半小时。然后在4℃，20000 g的压力下离心0.5 h。采用标准BCA法检测所有样品的蛋白浓度。

2.3。蛋白质消化和肽纯化

After lysis, the proteins were denatured by 6 M urea at room temperature for 1 h. Then, tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP, 5 mM) was added to reduce the proteins at room temperature for half an hour. To alkylate the reduced proteins, iodoacetamide (IAA) was applied to each sample in 6.25 mM. The reaction mixture was incubated for 0.5 h at RT in a dark place. After that, each sample was diluted with 6 volumes of HEPES buffer (50 mM, )确保尿素浓度在1米以下。序列修饰胰蛋白酶(Promega, Madison, WI, 1:100)/))加入到每个样品中，在37℃的两端摇床上孵育12小时。消化后，肽混合物被淬灭和磷酸酸化 。然后，酸性肽混合物被加载到预活化的C-18弹(96孔板，Thermo Fisher，美国)。用0.1%甲酸(200)洗涤3次进行脱盐μL).之后，用50% ACN洗脱肽，真空SpeedVac干燥。

2.4。TMT标签和高pH值的分级

通过相等地从每个肽样品从所有患者中，这是在所指定的TMT标记实验作为参考信道施加汇集等分试样产生的共同的参考样本。（见各组织亚型内串行样本名患者（CRC /肝转移/正常结肠）以及参考通道中的每个TMT 10plex标记实验组被合并图1)。将每个样品中的干燥肽段溶解在200mm HEPES缓冲液中(pH 8.5，每个样品1 mL)。将TMT 10plex试剂(胺反应型，Thermo Fisher)的每个通道溶解在无水乙腈(ACN, 100)中μL).将TMT 10plex标记反应物各通道与策略中所述的相应样品混合。混合物保持在25℃1小时，以允许标记反应完成。之后，每个反应用5%羟胺(200)猝灭μL) rt孵育15min。完成后，将30个标记样品(3个标记组)在基本条件下( ,5μ米, ,YMC，日本)1 mL min¹。洗脱缓冲液如下:碱性缓冲液A为0.01 M NH₄HCO₂在ddH₂O和碱性缓冲液B为0.01 M NH₄HCO₂在90% ACN ( )。最后得到100个馏分，进一步浓缩成9个馏分，干燥后进行质谱分析。

2.5。质谱分析

在进行质谱分析之前，肽样品用0.1%的甲醛(甲酸)溶解至0.5 mg/mL。一个nanoflow LC (Dionex UltiMate 3000, Thermo Fisher Scientific)与一个超高分辨率质谱仪(Orbitrap Fusion, Thermo Fisher Scientific, USA)耦合。对于蛋白质组分析，1μg肽(2μ升），通过自填充分析柱分离（3 μ米粒子, ,inspire C18, Dikma，加拿大)，300 nL/min。二元洗脱缓冲体系，含酸性缓冲A (ddH中0.1% FA)₂O)和酸性缓冲液B (ACN中0.1%甲酸)使用7%至35%的缓冲液B在62分钟洗脱时间内分析肽。高分辨率质谱仪(Orbitrap Fusion)以最高速度、数据依赖采集(DDA)的方式工作。全扫描(MS1，质量范围350-1550 )光谱的分辨率为120000，自动增益控制为200000，最大采集时间为100ms。离子信号(Si (CH_3.)₂O)₆H +在 监测445.120025以校准内锁质量。每个选择的前体被1.4分离 窗口，而这些被选中的前体在HCD中进一步破碎，具有32%的碰撞能量(标准化)。对于MS2光谱采集，质量分辨率调到60000，以实现报告离子与6 mDa质量差异的清晰分离。未赋值前体、单电荷前体和高电荷状态前体被排除在进一步分析之外，前体在20秒内的复发未被考虑(动态排除)。

2.6。数据分析

高峰列表直接从获得的原始MS文件中提取，并进一步用于搜索UniProt蛋白数据库(智人， 2016.09.16)，由SEQUEST实施在蛋白质组发现(版本1.4,Thermo Fisher科学)。以蛋氨酸氧化为动态修饰，半胱氨酸残基氨基甲酰化修饰，TMT 10plx修饰肽n -末端和赖氨酸残基静态修饰，进行光谱匹配。当胰蛋白酶被指定为一种蛋白水解消化酶时，最多可容忍两个错过的裂解。对于前体，允许的质量容忍为10ppm，而片段，质量容忍限制在0.02 Da。在蛋白质组发现器中以高置信水平过滤鉴定出的肽。采用目标诱骗搜索策略估计蛋白质的误发现率，并以1%过滤。全球参考的量化强度作为数据归一化的标准，只考虑所有三组中鉴定出的蛋白进行进一步分析。蛋白质丰度变化的显著性分析使用双侧学生计算 -测试。的做的多重比较时，使用的Benjamini-Hochberg的校正值进行校正。使用DAVID，V6.8，独创性途径分析（IPA），和R.进行进一步的数据解释和功能注释

3.结果与讨论

3.1。病人蛋白质组概况

如图所示1(一)，我们收集了该人群中每个患者的正常结肠组织、CRC组织和肝转移组织( )总共有27个样本。我们的蛋白质组工作流程遵循一般的样品制备程序(见图)1)，通过组织匀浆、蛋白质烷基化和消化。用TMT 10plex试剂标记得到的肽段。将所有组织标本分为3组，作为3个标记批次(1/2/3组)。将每个患者样本平均汇集，形成样本混合物，作为参考样本(见图)1 (b)用于多路标记策略)。将混合样本与每位患者相同组织类型的其他9个样本纳入标记试验组，共3组。标记完成后，在高ph条件下将各样品等量混合分馏。最终得到了9个组分，并在纳米lc上结合高分辨率质谱仪(Orbitrap Fusion)进行分析。对原始数据进行处理，并使用生物信息学工具对量化后的蛋白质进行进一步分析。

根据诊断亚型，将样本分为3组:9个正常结肠(N)、9个CRC (T)、9个肝转移组织(M)，经蛋白定量和数据归一化(见材料和方法)，共定量近6000个蛋白(图)2(一个))，其中3211个蛋白是所有组共有的。此外，我们使用共享蛋白质应用主成分分析(PCA)并绘制结果(图)2 (b))。很明显，正常结肠组织代表了一个不同于其他组的簇，表明了肿瘤组织和正常组织之间的蛋白质组特征的明显差异。局部CRC和远处转移组织在蛋白表达方面表现出相似的特征，导致在PC1或PC2维度上形成不可分割的簇。为探究N、T、M组间的变异规律，采用方差分析(ANOVA)，得到117个显著性蛋白( )。使用117种显著蛋白质聚类分析揭示中基团N和T / M（图不同蛋白质组签名2 (c))。我们选择33个最重要的蛋白并分析其功能(图)2 (d))。在细胞间室这一类别中，大多数蛋白被鉴定为细胞表面或外泌体蛋白，如乳转铁蛋白(LTF)、中性粒细胞弹性酶(ELANE)、膜联蛋白(ANXAs)和转化生长因子-诱导蛋白(TGFBI)，它们是细胞生长和迁移的关键信号分子[30.]。这些蛋白大部分参与免疫反应和补体激活过程，可能是由于肿瘤促炎微环境的刺激。这些蛋白在所有样本中的相关性分析显示，正常组织中的蛋白表达谱高度相关(图)2 (e));然而，T/M组蛋白的异常表达在个体之间的相关性非常低，说明癌细胞的高度异质性。

3.2。CRC、转移和正常结肠组织之间的蛋白质组差异

为了进一步研究的组织特异性蛋白质组的变化，我们比较CRC组织与正常结肠组织（T / N）以及转移性的组织与正常结肠组织（M / N）的蛋白质组图谱蛋白质组图谱。结果汇总图3.。对于T/N的比较，一项重要的测试将66种蛋白质( , ,数字3(一个))，肿瘤组织中有38个蛋白上调，28个蛋白下调(图)3 (b))。这些蛋白在T和N之间表达显著不同，显示出作为标记蛋白/蛋白面板的良好潜力。PCA还表明，使用66个蛋白，这两组(T和N)可以在PC1维上很好地分离(图)3 (c))。基因本体论提示这些蛋白主要参与细胞的生长和分化。在M和N之间表达的改变蛋白数量大于T/N。根据相同的遴选准则( , ),120个蛋白被选为表征M组和N组主要差异的重要蛋白，其中74个蛋白在肝转移性CRC组织中过表达，46个蛋白低表达(图)3 (d)和3 (e))。这些蛋白主要被鉴定为细胞表面蛋白和外泌体，它们控制生长、侵袭和迁移过程中绝大多数细胞信号活动。利用这120个蛋白，还可以在PC2维上很好地分离M和N基团。

3.3。肿瘤局部和转移性结直肠癌蛋白表达变化的研究

结直肠癌通常发展非常缓慢，是一种高度异质性的疾病[31];一旦发生转移，即使是组织病理学上相似的肿瘤，在治疗反应和生存率方面也存在显著差异[32]。为了进一步研究参与转移的蛋白的功能作用，我们比较了局部CRC样本(T组)和肝转移CRC样本(M组)的蛋白组学特征4。统计分析显示有47种蛋白质( )M / T之间差异表达的是（图4(一))。PCA显示，使用47个蛋白在PC1维度上很好地分离了这两组(图)4 (b))。ANOVA（Tukey检验）还优先两种蛋白质具有显着性，FILIP1L（细丝蛋白A-相互作用蛋白1样，UniProt登录：Q4L180，PLG (plasminogen, UniProt accession: P00747，值= 0.03)。研究发现过表达FILIP1L通过抑制CRC细胞系中经典的WNT信号通路抑制癌细胞的侵袭转移行为[33- - - - - -35]。缺乏FILIP1L表达的（图4 (c))在本研究的转移样本中可能部分促成了CRC细胞的转移。然而，该蛋白在正常结肠细胞中的作用，尤其是低表达的，还有待进一步研究。PLG(纤溶酶原)家族成员是一种分泌蛋白，参与纤溶酶原激活系统(PAS)。PAS的表达在肿瘤的扩散和生长中很重要，有报道称它能够预测人类CRC的结局[36]。本研究观察到，转移性CRC样本中发现PLG显著高表达(图)4 (c))。我们还确定了一些其他蛋白质如精氨酸酶1（ARG1）和醇脱氢酶4（ADH4），将其肝转移CRC样品中过表达（图4 (d))，提示这些蛋白在结直肠癌肝转移中发挥积极作用。进一步验证这些分子功能作用的实验正在进行中。

数据可用性

支持本研究结果的数据可从通讯作者处获得。

的利益冲突

作者声明没有潜在的利益冲突。

致谢

这项工作由国家自然科学基金(No. 21708024)、上海帆船项目(No. 16YF1406400)、上海交通大学跨学科项目(No. YG2016MS80和ZH2018ZDA27)、高校学科人才引进计划(111 Project, B17029)资助。

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