蛋白质的影响FAM172A HepG2细胞增殖和调查可能的分子机制

文摘

背景。在我们之前的研究中,我们发现FAM172A重组蛋白可以促进L02细胞的扩散。然而,潜在的机制仍然未知。本研究旨在调查FAM172A对HepG2细胞增殖的影响,探讨可能的分子机制及其在肝细胞癌(HCC)中的作用。方法。细胞增殖是通过MTT试验来衡量的。西方墨点法进行了调查机制。兔抗体FAM172A和膜蛋白分离溶解产物HepG2细胞共沉淀和合成沉淀被质谱分析。结果。MTT试验表明,重组蛋白FAM172A同种型1 (FAM172A-1)可以诱导HepG2细胞增殖的浓度10 - 100 ng / mL,而蛋白质FAM172A同种型3 (FAM172A-3) 80 - 100 ng / mL的浓度。免疫印迹证明FAM172A-1和FAM172A-3可以激活增殖蛋白激酶/细胞外signal-regulated蛋白激酶(MAPK / ERK)通路和磷脂酰肌醇3-kinase / threonine-protein激酶(PI3K / Akt途径)。质谱分析表明,有一些膜蛋白与FAM172A交互。几个候选人相互作用引起的蛋白质可能调解增殖信号FAM172A重组蛋白,其中包括7个膜蛋白。结论。总之,FAM172A重组蛋白可以诱导增殖HepG2细胞MAPK / ERK和PI3K / Akt信号通路可能参与其中。FAM172A在HepG2细胞增殖的作用还表示它可能参与肝细胞癌。FAM172A的受体细胞仍然需要利用。

1。介绍

肝癌是第四个癌症死亡最常见的原因(782000人死亡,8.2%)发布的2018年国际癌症研究机构(1]。在原发性肝癌,肝细胞癌(HCC)形式癌症死亡率的85%到90%的原因。肝癌是可以预防,发现在早期阶段,和高质量的筛选有效治疗,正确地管理筛查出病变,和适当的治疗疾病的阶段(2]。分子机制的理解,引发hepatocarcinogenesis正在增长。这个患癌症的风险不是健康的肝脏和存在是明显针对慢性肝损伤在肝硬化阶段(3]。基因表达分析和蛋白质组分析阐明分子事件潜在肝癌发展和允许识别新的诊断标志物以及治疗和预防目标(4]。尽管疾病晚期或局部区域治疗后进展有一个惨淡的预后和系统性治疗没有改善晚期肝癌患者生存,索拉非尼和lenvatinib药物主要用于小成功在这个阶段(5,6]。这些数据提供的证据表明,肝癌的发病和进展是由一系列的分子缺陷和特异表达途径。新颖的靶向治疗可以抑制这些途径在分子水平上为了提高临床结果(7,8),而且,联合治疗目标的多个不同的步骤可以是一个适当的策略来对付人类肝细胞癌(9]。这种癌症的致命的性质与高水平的基因组不稳定性在先进的疾病使我们有必要识别生物标志物最早发展的疾病阶段将有助于成功的治疗干预措施(8,10]。microrna - 517和mir - 122确定在肝细胞癌发病机制,肿瘤预后和细胞增殖11,12]。其他途径mTOR激活和RICTOR致癌基因作为中介的人类hepatocarcinogenesis [13]。微环境的变化中发挥重要作用在肝癌和MAPK激酶的超表达(MEK) MAPK在肝细胞癌,从MAPK-independent和改变细胞的生存途径,MAPK-dependent细胞生存途径是其中一个14- - - - - -16]。可以有针对性的其他途径包括MAPK通路(Ras /皇家空军/ MEK / ERK), MEK, PI3K / Akt / mTOR通路,VEGF / VEGFR PDGFR, FGFR, EGF /表皮生长因子受体、肝细胞生长因子/ c-Met通路和IGF / IGFR Klungboonkrong所列出的et al。17]。持久的肝炎病毒感染也与肝癌有关,和MAPK / ERK级联过程包括Elk1参与(18]。李等人证明FAM172A蛋白促进细胞增殖,抑制细胞凋亡,促进s阶段进入和所有这些表明FAM172A蛋白参与细胞生长调节(19]。FAM172A被确认为一种新的肿瘤抑制基因发挥重要作用在细胞周期控制和肿瘤细胞增殖20.]。FAM172A基因,也称为C5orf21,第一只克隆从2009年的正常人类主动脉组织。这个基因位于染色体5最喜欢和它的功能是知之甚少。李等人报道,C5orf21基因包含五个剪接变体和首次被发现在mRNA水平而变化C5orf21糖尿病大血管病变(基因表达也与21]。李等人提出的证据表明,FAM172A蛋白存在于人类主动脉内皮和主动脉平滑肌细胞和巨噬细胞,并可能参与高glucose-induced血管损伤的发病机理(22]。李等人表明FAM172A蛋白促进了人类乳头状甲状腺癌的增殖细胞(23]虽然崔等人表明FAM172A在结直肠肿瘤抑制癌(24]。

针对诊断HCC与生物标志物和治疗肝癌有针对性的药物,在目前的工作中,我们调查了FAM172A对HepG2细胞增殖的影响,探讨了可能的分子机制。

2。材料和方法

2.1。试剂

杜尔贝科修改鹰的介质(DMEM)、青霉素、链霉素和胎牛血清从Hyclone购买(洛根,UT)。MS-grade修改胰蛋白酶是从Promega(麦迪逊,WI)。二甲亚砜(DMSO)购买的σ(圣路易斯,密苏里州)。兔多克隆抗体总MAPK / ERK phospho-MAPK / ERK total-Akt, phospho-Akt,磷酸酶抑制剂鸡尾酒从细胞信号技术(波士顿)。(3)- 4 5-Dimethylthiazol 2, 5-diphenyltetra-zolium溴化(MTT),抑肽酶,亮抑酶肽来自Amresco(梭伦,哦)。Mem-PER哺乳动物蛋白提取试剂,Mem-PER真核生物膜蛋白提取试剂盒,和BCA蛋白质化验设备购买从热费希尔科学(罗克福德,IL)。

蛋白质A / G PLUS-Agarose免疫沉淀反应试剂,单克隆鼠标人类肌动蛋白抗体,或GAPDH是购自圣克鲁斯生物技术(圣克鲁斯,CA)。正常兔免疫球蛋白是购自PeproTech(落基山,新泽西)。FAM172A重组蛋白被保存在我们的实验室。

2.2。细胞培养

所有实验进行人类肝癌细胞株HepG2在这项研究中。这些细胞被保存在我们的实验室。细胞在DMEM培养基培养补充10%胎牛血清的边后卫,青霉素和链霉素。文化是保持在95%以下湿润大气含5%二氧化碳在37°C。细胞通过每隔一天在一个2:1分流比。

2.3。扩散测量

细胞增殖是由经典的MTT试验(25]。总之,HepG2细胞被播种在96 -孔板(4000个细胞/)在100年μL培养基的边后卫为10%。细胞附件12 h后,媒介取代serum-starved中等(0.5%的边后卫)24 h。然后,细胞与不同浓度的孵化FAM172A-1或FAM172A-3重组蛋白(0,1,10年,20年,30、40、50、80和100 ng / mL) 24 h。与实验并联,井没有细胞作为空白组。刚做好的MTT的解决方案(5毫克/毫升的最终浓度)被添加到每个好,和细胞培养4 h 37°C。然后,媒介是吸气仔细,150μL DMSO溶液添加到每个肝癌和溶解。光密度值(OD)在多模量化微型板块Reader-Varioskan Flash在490/570 nm。

2.4。细胞溶解产物制备

细胞被播种在6-well盘子。12小时后,细胞serum-starved 24小时中有0.5%的边后卫。然后,FAM172A-1或FAM172A-3重组蛋白(100 ng / mL的最终浓度)添加和细胞coincubated 0 h, 4 h、12 8 h, h。同等体积中担任控制。随后,细胞被洗PBS和细胞溶解Mem-PER哺乳动物蛋白质提取试剂(预先添加蛋白酶抑制剂)30分钟在冰上。离心是12000克15分钟在4°C。收集上清液和煮1 x十二烷基硫酸钠样品缓冲10分钟99°C。由BCA蛋白质测定蛋白质浓度测量工具在562海里一盘读者(26]。

2.5。免疫印迹分析

蛋白质(50μg / lane)分离钠十二烷基sulfate-polyacrylamide凝胶电泳(SDS-AGE),在硝化纤维膜转移electrophoretically [24]。然后,膜被封锁在脱脂奶粉5%或5%牛血清白蛋白在缓冲盐在室温下1 h。膜随后被孵化与特定主要抗体在一夜之间在4°C,然后用相应的辣根孵化peroxidase-conjugated二级抗体在室温下1 h。每次孵化后,PBS清洗重复了3次。蛋白质最终被可视化增强化学发光试剂。β肌动蛋白或GAPDH作为控制。每一个实验至少重复三次。

2.6。针对FAM172A兔多克隆抗体的制备

兔多克隆抗体制备所述由任正非等人,郑等人做了一些调整(27,28]。首先,免疫接种前收集血清样本。然后,兔子与FAM172A-3接种重组蛋白(1毫克)每隔一周3次。第一免疫、FAM172A-3重组蛋白与弗氏完全佐剂混合和其他与弗氏不完全佐剂免疫接种。血清样本收集一周后最后免疫和抗体纯化的蛋白琼脂糖列。分析了制备多克隆抗体ELISA和免疫印迹,确保多克隆抗体可用于以下实验。

2.7。隔离膜蛋白

细胞( /毫升)在70%融合被PBS收获和洗一次。膜蛋白是准备使用商业Mem-PER真核生物膜蛋白提取试剂盒制造商所描述的。细胞溶解产物混合物在12000克15分钟离心机在4°C。浮在表面的维护,在37°C加热20分钟。然后,上层清液离心机在10000 g在室温下2分钟。前阶段被迅速,和底部阶段是一个膜蛋白。确定膜蛋白是归一化到适当的体积与试剂B超纯水稀释4倍。

2.8。Coimmunoprecipitation

准备的膜蛋白是分为两个,每个标准化为1毫升如上所述。正常兔免疫球蛋白和蛋白质A / G琼脂糖珠被添加在4°C和孵化30分钟,随后在2500转离心5分钟把珠子。准备多克隆抗体或正常兔免疫球蛋白(对照组)添加在上层清液和孵化1 h在4°C连续旋转。然后,添加了蛋白质A / G琼脂糖珠和孵化4 h在4°C连续旋转。离心是2500转5分钟和上层清液被移除。洗珠子后,蛋白质被筛选了1 x SDS珠子的样品缓冲和煮10分钟99°C。沉淀分离的sds - page和讨论与考马斯亮蓝染色29日]。

2.9。质谱分析

目标凝胶乐队被切成小块,并进行了凝固态胰蛋白酶的消化和准备质谱分析(如前所述)(30.]。凝胶是使退色CH的50%₃CN, 30% CH₃CN/100 mM NH₄HCO₃,50%的CH₃CN/50 mM NH₄HCO₃,50%的CH₃CN/25 mM NH₄HCO₃一个接一个,直到凝胶变得澄清。干燥后,凝胶与MS-grade修改胰蛋白酶消化1 h在4°C。然后,添加足够的25毫米NH的体积₄HCO₃的凝胶块,继续消化16 h在37°C。50μH L重蒸馏的₂O添加和孵化10分钟。肽提取60% CH₃CN/5%组织从凝胶块,干到10μL体积。准备的肽Q-TOF质谱仪被识别,和数据分析与吉祥物搜索软件。

2.10。统计分析

定量数据被表示为 。统计分析与执行GraphPad Prism 5.01使用方差分析分析其次是图基事后测试。的被认为具有统计显著性值小于0.05。

3所示。结果

3.1。FAM172A提升HepG2细胞增殖

孵化后FAM172A-1或FAM172A-3重组蛋白为24小时显示浓度,HepG2细胞的增殖是通过MTT试验来衡量的。我们发现细胞增殖是由FAM172A重组蛋白质。的浓度1 ng / mL, FAM172A-1显示细胞增殖没有明显的影响( ),在10 - 100 ng / mL孵化浓度、细胞增殖的水平明显高于对照组( ;图1)。然而,扩散效应只观察到孵化80 ng / mL的浓度和100 ng / mL,当FAM172A-3重组蛋白cocultured ( ;图2)。

3.2。MAPK / ERK和PI3K / Akt信号通路可能参与其中

探讨FAM172A蛋白促进细胞增殖的分子机制,我们研究了FAM172A-1或FAM172A-3在两个关键信号通路的影响,而与HepG2细胞的细胞增殖密切相关。细胞被FAM172A-1刺激或FAM172A-3重组蛋白质、MAPK / ERK的活动和PI3K / Akt进行了分析。结果表明,ERK1/2和一种蛋白激酶磷酸化与FAM172A治疗后显著提高重组蛋白的总ERK1/2和Akt保持不变(数字3和4)。

3.3。活动对FAM172A兔多克隆抗体

结果表明,制备抗体纯度高(图5(图)和良好的特异性6)。

3.4。膜蛋白的识别与FAM172A交互

首先,我们探讨了最好的兔多克隆抗体的浓度对FAM172A coimmunoprecipitation。不同浓度(2、5、10μg / mL)中使用了coimmunoprecipitation实验,并通过免疫印迹分析了沉淀。免疫印迹分析表明,5μg / mL是最好的FAM172A抗体浓度相比正常兔免疫球蛋白(图7)。最好的浓度,coimmunoprecipitation实验进行了sds - page分析了沉淀。结果表明,有几个乐队与控制(图明显不同8)。然后,这些差异蛋白质乐队被砍倒,胰蛋白酶的消化凝固态。well-digested肽被确定UPLC-Q-TOF质谱仪。吉祥物的搜索结果显示,有七个膜蛋白可能与FAM172A(表进行交互1)。蛋白质膜蛋白,所确定的其他十二或亚细胞位置没有被证实(表2)。

4所示。讨论

有四个FAM172A成绩单变体。结果isform 1最完整的结构,是一种分泌蛋白,这使得它最潜在的调节细胞生长。由此产生的同种型2 n端较短,相比同等型1。由此产生的异构体3有一个短的n端和缺乏内部部分,而同种型1。变种4缺少另两个外显子,而变体1。这变种是表示为非编码,因为使用的5 - - - - - -大多数人都支持平移开始密码子呈现一个候选人nonsense-mediated mRNA衰变。所以我们选择FAM172A-1 FAM172A-3亚型在我们的实验中,发现他们参与HepG2细胞增殖。首先,FAM172A-1的有效浓度和FAM172A-3识别,导致HepG2细胞增殖,通过coculturing蛋白质与MTT试验和测量。我们依照其他研究结果发表FAM172A显著调节和被发现在细胞生长周期的积极参与。在一项由崔et al ., FAM172A表达与肿瘤的恶性程度有关,可以用来识别结直肠癌患者更严重的疾病阶段适当的早期治疗。崔等人吸引了循环肿瘤细胞之间的相关性积极率和FAM172A表达积极率(31日]。另一项研究由李等人的影响FAM172A蛋白HEK293细胞表现出类似的结果。FAM172A蛋白促进细胞增殖,抑制细胞凋亡,促进s阶段,表明其参与细胞生长调节糖尿病大血管病变(和可能的作用19]。

我们下一个试图确定的可能分子机制FAM172A蛋白质促进HepG2细胞增殖。尽管许多通路参与肝细胞癌(17),两个关键信号通路、MAPK / ERK和PI3K / Akt,与细胞增殖(密切相关32HepG2细胞),研究了体外细胞培养方法。HepG2细胞cocultured FAM172A蛋白质是细胞溶解和免疫印迹试验。结果显示,FAM172A的表达水平的调节,ERK1/2和一种蛋白激酶磷酸化是治疗后显著增加FAM172A重组蛋白的总ERK1/2和Akt保持不变。这表明的参与MAPK / ERK和PI3K / Akt通路。符合这些结果是由李等人的工作,调查了FAM172A对几种常见的影响与细胞增殖相关信号通路和证明过度FAM172A造成明显的激活p38 MAPK通路诱导细胞增殖。另一项研究还显示FAM172A和p38 MAPK途径的参与疾病的乳头状甲状腺癌(23]。与之相反,其他的研究报道,FAM172A是一个肿瘤抑制基因介导的细胞周期阻滞至少部分,通过调节等级3的表达途径(20.]。崔等人也在与结直肠癌模型报道,FAM172A可能抑制结肠癌细胞的增长和入侵的机制参与激活人信号(24]。钱等人证明FAM172A被STAT1调节转录因子表达下调,从而调节细胞凋亡和结肠癌细胞的增殖过程(人类lovos和SW480细胞)33]。类似的结果在我们的研究中,王、大证明MAPK表达水平高,磷酸化MAPK和磷酸化MEK1/2被发现在肿瘤的肝细胞癌患者16]。尽管有许多其他途径参与细胞生长,我们没有全面检查和二次效应不能被排除在外,我们的研究结果表明,MAPK / ERK和PI3K / Akt信号通路可能参与其中。也许我们可以阻止通路进行进一步的验证。

明年在我们的研究中,我们分离高纯度和良好特异性重组FAM172A兔多克隆抗体。这些抗体的最佳浓度是coimmunoprecipitated孤立从HepG2细胞溶解产物,获得膜蛋白sds - page电泳和沉淀分离。差异蛋白质乐队被确定UPLC-Q-TOF质谱仪。七个膜蛋白和十二nonmembrane蛋白质被确定与FAM172A交互。膜蛋白MACF, PTPRF、NDST SLC27A6, ACVRL1 RAB27A和RAB3D确认为绑定,FAM172A导致HepG2细胞的增殖upregulation或超表达这些蛋白质。我们的研究结果是一致的与其他出版的数据(34- - - - - -38]。需要进一步的研究来验证这些候选人FAM172A膜蛋白相互作用,包括Co-IP、免疫印迹,抗体阻断,siRNA技术和组织学验证。

5。结论

总之,本研究的力量在于确定FAM172A HepG2细胞增殖的可能机制。MAPK / ERK和PI3K / Akt信号通路可能涉及。膜蛋白和nonmembrane蛋白参与了一连串MAPK / ERK和PI3K / Akt也被检测到。这还有很长一段路要走在肝癌治疗诊断标记和目标药物的合成。这项研究的局限是,FAM172A的受体细胞仍然需要被利用。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的结果包括在本文中。

信息披露

本研究提出了在第26届会议文摘APASL年会,2月15 - 19,2017年,上海,中国。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

作者的贡献

香港赵和洁具王co-first作者。

确认

这项工作是由北京市科委的项目(批准号D171100003117005),消化医疗协调发展北京医院权威(批准号XXZ0402),和北京医院权威医院临床医学发展的特殊资助(批准号ZYLX201808)的支持。我们感谢人文国张、李Hongmin和回族任关于实验的帮助和有价值的讨论。

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