膀胱尿路上皮癌中COX-2免疫染色增加与侵袭性和预后不良相关

摘要

背景．膀胱尿路上皮癌是最常见的膀胱肿瘤。环氧化酶-2 (COX-2)介导血管生成、细胞存活/增殖和凋亡。本研究探讨沙特阿拉伯UCB中COX-2免疫染色与临床病理参数的关系。方法．研究人群包括123例UCB和25例UCB邻近的尿路上皮粘膜。在任何局部或全身治疗前采集UCB样本。设计并构建组织微阵列，切片TMA块进一步免疫组化染色。免疫组化染色采用小鼠抗人COX-2单克隆抗体。选取10%作为阈值来确定COX-2的高低。结果．UCB中COX-2免疫染色高于相邻尿路上皮( )．高COX-2免疫染色与高UCB相关( )，远处转移( )，lymphovascular入侵( )，阳性肌肉侵犯( )，pT2及以上( )，和高度解剖阶段(阶段II及以上)。高COX-2免疫染色是较高肿瘤分级的独立预测因子( )，肌肉入侵( )，晚期病理T ( )，lymphovascular入侵( )，及远处转移( )．高COX-2免疫染色与较低的总生存率相关( )．结论．COX-2免疫染色与UCB的侵袭性相关，可作为独立的预后指标。COX-2可能是UCB发生和发展的重要分子。需要进行分子和临床研究，以探索COX-2在UCB中的分子下游，以及COX-2抑制剂作为传统化疗辅助治疗的有效性。

1.背景

膀胱尿路上皮癌(Urothelial carcinoma of the bladder, UCB)是西方国家最常见的膀胱肿瘤[1］．在沙特阿拉伯，UCB占男性癌症的3.8% [2］．UCB主要表现为非肌肉浸润性肿瘤。低级别肿瘤经尿道切除术后预后良好，而高级别肿瘤患者需要膀胱内灌注卡介苗芽孢杆菌和/或化疗。70%的非肌肉侵袭性UCB患者在治疗后会复发。15%的无创UCB发生肌肉侵犯。恶性肿瘤患者可能存在进展风险[3.］．治疗费用仍然很高，因为复发的风险很高，而且需要密切的终身随访[4］．

慢性炎症被认为会增加UCB的风险[5］．环氧合酶-2 (COX-2)是一种前列腺素内过氧化物合成酶。促炎细胞因子、生长因子、肿瘤启动因子和其他外部因素刺激COX-2催化前列腺素生成[6，7］．COX-2的激活促进细胞过程，并参与肿瘤发生，如血管生成、肿瘤细胞增殖、存活和凋亡[8，9］．膀胱炎或UCB患者的膀胱组织与正常膀胱组织相比COX-2水平升高[10，11］．COX-2在UCB中过表达[11- - - - - -14]及大肠癌[15］．

本研究的目的是研究沙特阿拉伯UCB患者中COX-2免疫染色状态与各种临床病理参数的关系及其作为疾病结局预测指标的价值。据我们所知，这是第一个在沙特阿拉伯UCB患者中解决这种关系的研究。

2.方法

2．1．病人

本研究共纳入123例UCB和25例UCB附近的未受累尿路上皮粘膜。所有病理材料均来自沙特阿拉伯吉达阿卜杜勒阿齐兹国王大学病理学系。研究中使用的UCB样本是在任何膀胱内或全身治疗前获得的。根据美国癌症联合委员会癌症分期图谱的标准，对肿瘤进行T分期的审查[16]，而分级则根据世界卫生组织的肿瘤分类作了修订[17］．临床病理结果见表1．沙特阿拉伯吉达阿卜杜勒阿齐兹国王大学医学院生物医学伦理研究委员会批准了这项研究。在研究中使用他们的活检材料的知情书面同意来自纳入本研究的患者。

2．2．组织微阵列

组织微阵列的设计和构建如前所述[18，19］．从每个UCB和未受损伤的尿路上皮黏膜中选择两个核心组织，并在受体石蜡块中排列。使用全自动组织排列仪(master3dhistech)。使用正常胎盘组织在TMA块中定位核心。将TMA块切成4微米的切片，置于带正电的载玻片上进行进一步免疫组化染色。

2．3.免疫组织化学

免疫组织化学染色采用小鼠抗人COX-2单克隆抗体(DakoCytomation Norden a /S, Glostrup, Denmark;稀释1:50)。使用自动免疫染色仪(Ventana BenchMark XT, Ventana Inc.，图森，AZ)进行免疫染色。阳性对照由已知具有抗cox -2抗体的结直肠癌组成。阴性对照组用三缓冲盐水代替一抗。

２.４.COX-2免疫染色评价

采用半定量评分法记录COX-2阳性细胞的百分比。在每个组织盘中，计数肿瘤/尿路上皮细胞，然后计数阳性细胞(胞浆棕色染色)。计算cox -2阳性细胞百分比。选取10%作为临界值。当检测到的肿瘤/尿路上皮细胞的染色小于10%时，认定为cox -2阴性免疫染色;当检测到的肿瘤/尿路上皮细胞的染色大于或等于10%时，认定为cox -2阳性免疫染色[20.- - - - - -23］．据此，我们将COX-2免疫染色分为高、低两种。

2．5．统计分析

统计检验在SPSS®程序(美国纽约)第16版中进行。统计意义为 ．检验两个和三个变量之间的差异使用曼-惠特尼计算试验和Kruskal-Wallis试验交替使用。沿着一个变量的数据，变异被检验使用非参数卡方检验。采用Kaplan-Meier法和log-rank (Mantel-Cox)检验比较存活概率。无病生存时间计算从诊断到出现复发的疾病(或最后一次见到无病的日期)。采用二元logistic回归分析确定COX-2免疫染色的预后价值。估计的优势比(指数 ）95%置信区间被表达。

3.结果

3．1.COX-2免疫染色模式

COX-2在UCB及邻近尿路上皮的染色模式如图1．在邻近尿路上皮中，22%检测到COX-2免疫染色。在UCB附近的尿路上皮伞状细胞胞浆中局灶性检测到COX-2免疫染色(图)1(一))．37.8%的UCB有免疫染色。恶性尿路上皮细胞的弥漫胞浆COX-2免疫染色如图所示1 (b)- - - - - -1 (d)．在邻近尿路上皮及UCB中，低COX-2免疫染色的发生率高于高COX-2免疫染色的发生率( )．然而，COX-2免疫染色在UCB中比在邻近的尿路上皮中报道更多( )．数据见表2．

3．2．COX-2免疫染色与UCB预后因素的相关性研究

COX-2免疫染色在临床病理参数中的分布如表所示3.．高COX-2免疫染色与肿瘤高分级有统计学关联( )，伴有远处转移的肿瘤( )，淋巴血管浸润阳性的肿瘤( )．高COX-2免疫染色与UCB的侵袭性有关。从统计上看，这与正向肌肉侵犯( )，病理T值(pT2及以上)较高的肿瘤( )，和高度解剖阶段(阶段II及以上)。高COX-2免疫染色与阳性淋巴结转移的相关性具有统计学意义( )．COX-2免疫染色与年龄、性别、局部疾病复发和生存状态无统计学差异。回归分析显示，高COX-2免疫染色是较高肿瘤分级的独立预测因子( )，肌肉入侵( )，晚期病理T ( )，lymphovascular入侵( )，及远处转移( )．回归分析详情见表4．

3．3.生存结果与COX-2免疫染色相关

生存分析显示COX-2高免疫染色患者的总生存率低于低免疫染色患者(log-rank (Mantel-Cox) = 5.485)，差异有统计学意义 ）(图2)．尽管无病生存率没有统计学意义(log-rank (Mantel-Cox) = 2.325， )，有一个明显的趋势，即低COX-2免疫染色的肿瘤患者无病生存期较长，而高COX-2免疫染色的肿瘤患者无病生存期较短(图)3.)．

4.讨论

COX-2通常在组织中不表达;然而，它是在某些刺激下诱导的，包括炎症因子、生长因子和致癌基因[24］．在包括UCB在内的不同肿瘤中观察到COX-2免疫染色增加[11，13］．然而，在正常人类膀胱上皮中，COX-2不表达[13，20.，24- - - - - -26］．另一方面，其他研究表明COX-2在正常膀胱组织尿路上皮的免疫反应性较弱[27］．在本研究中，对UCB附近形态正常的尿路上皮组织进行COX-2免疫染色。在检查的标本中，COX-2显示根尖定位低免疫染色(<10%)。这一观察结果之前曾被报道过，与我们的发现一致[13，20.］．这一观察可能代表了尿液中致癌物通过肿瘤细胞分泌生长因子或细胞因子对肿瘤周围尿路上皮细胞或旁分泌环的场效应[13］．COX-2免疫染色可在慢性膀胱炎、鳞状上皮化生和异常增生区域观察到[28］．另一方面，其他人在肿瘤周围的正常尿路上皮细胞中未观察到COX-2的表达[29］．这个问题非常重要，需要在大规模样本中解决，因为使用COX-2抑制剂作为局部肿瘤复发的化学预防可能是有用的。

COX-2过表达可能参与起始癌变[30.，31］．在本研究中，高COX-2免疫染色在UCB比在邻近的尿路上皮有统计学意义。17.1%的UCB呈高免疫染色。10%的免疫反应细胞作为截止点，之前使用过，UCB中cox -2阳性免疫染色结果类似[22，24，32］．然而，也有报道大量UCB中COX-2免疫染色[13，21，33］．COX-2免疫染色在正常和肿瘤组织之间的差异可能是由正常和肿瘤组织之间的旁分泌效应所解释的。结果的差异可能是由于COX-2免疫染色的技术条件不同，对COX-2免疫染色的解释不同。

大多数众所周知的肿瘤预后指标是临床和病理参数，包括分期和分级。另一方面，肿瘤生物学行为的评估对于确定适当的治疗方式是至关重要的。因此，需要更可靠的预后因素。目前的方法是将重点放在遗传标记上[34］．在这个过程中靶向的分子之一是COX-2，它被认为是膀胱癌发生和侵袭的危险因素[35］．关于COX-2表达作为UCB的独立预后因素，仍有相互矛盾的结果。COX-2和临床病理参数之间的关系是一个有争议的问题。在我们的研究中，高COX-2免疫染色与肿瘤晚期有关。有几项研究报告了相同的关联[28，32，36］．另一方面，其他研究未能显示COX-2表达与UCB分级之间的关系[20.，22，24，29，37，38］．

有报道称COX-2有助于体外对恶性细胞的侵袭能力，可能参与UCB的癌变[24，30.，39］．我们的研究结果表明，高COX-2免疫染色与UCB的侵袭性相关。这与肌肉侵袭、高病理T (pT2及以上)和高解剖阶段(II及以上)呈正相关。以前的研究也有类似的发现[11，32，40］．但其他一些研究未能证明这种关联[29，36］．此外，我们也报道了高COX-2免疫染色在统计学上与淋巴血管浸润阳性的肿瘤相关，类似于以前的报道[36］．这些发现可能支持COX-2抑制剂在侵袭性UCB中的潜在作用。

我们的研究表明，高COX-2免疫染色与阳性淋巴结转移和肿瘤与远处转移有统计学意义的边界关联( )．很少有研究涉及COX-2免疫染色与UCB的转移潜能有关。一项研究发现COX-2免疫染色与淋巴结转移之间存在显著相关性[37］．另一方面，另一项研究没有显示与淋巴结转移有显著的相关性[29］．

在目前的研究中，回归分析显示高COX-2免疫染色是较高的肿瘤分级、肌肉浸润、晚期病理T、淋巴血管浸润和远处转移的独立预测因子。先前的一项研究报道COX-2与局部侵袭显著相关[24］．高COX-2免疫染色可作为UCB预后差的独立预测指标。有人认为COX-2表达可能与肿瘤预后良好有关[41］．然而，在本研究中，染色强度用于评价COX-2免疫染色。在我们的研究中，高COX-2免疫染色与总生存率相关。然而，这与无病生存没有关联，这一发现之前曾有报道[32]，这与之前的一些研究报道高COX-2免疫染色与疾病特异性生存相关[38，41］．综上所述，UCB中COX-2免疫染色结果的上述矛盾可能是样本量、COX-2免疫染色截止点、抗体克隆、免疫染色技术等方面的差异。

5.结论

总之，目前的研究表明COX-2免疫染色与UCB的侵袭性有关，并支持COX-2免疫染色可作为UCB的独立预后生物学标志物。COX-2可能是UCB发生和发展的重要分子。随后，COX-2抑制剂可作为UCB的预防和治疗药物。需要进行分子研究和临床试验来探索COX-2表达与UCB发展的分子关系，以及COX-2抑制剂作为传统化疗辅助治疗的有效性。

缩写

cox - 2:	Cyclooxygenase-2
药:	膀胱尿路上皮癌。

数据可用性

没有数据支持本研究。

伦理批准

沙特阿拉伯吉达阿卜杜勒阿齐兹国王大学医学院生物医学伦理研究委员会批准了这项研究。

同意

在研究中使用他们的活检材料的知情书面同意来自纳入本研究的患者。

信息披露

该摘要已在USCAP 2018 107中提出^th年会:泌尿生殖病理学(编号:987，页数:323-324)。

的利益冲突

作者确认本作品的任何部分都没有被提交或在其他地方发表，也没有利益冲突。

作者的贡献

BM参与COX-2免疫染色评分，并对手稿进行了修改。WG参与组织芯片设计和COX-2免疫染色评分，进行统计分析，起草和修订手稿。MA对免疫染色进行评分，并对手稿进行修改。JM参与了石蜡块的组织学检查和选择，参与了研究的设计，并修改了手稿。稿件已被所有作者阅读并批准，符合作者身份要求，每位作者都认为稿件代表诚实的作品。

致谢

作者感谢国家科学、技术和创新计划(MAARIF-AH)、沙特阿拉伯王国阿卜杜勒阿齐兹国王科技城以及阿卜杜勒阿齐兹国王大学科学和技术部门的技术支持。

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