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李董,Xuting徐,金Liu Zhihong妈,黄Huilian骊山,利晟戴董顺利, ”Downregulation PTPRK促进细胞增殖和转移的非小细胞肺癌增强STAT3激活”,分析细胞病理学, 卷。2019年, 文章的ID4265040, 7 页面, 2019年。 https://doi.org/10.1155/2019/4265040
Downregulation PTPRK促进细胞增殖和转移的非小细胞肺癌增强STAT3激活
Xuting徐,1 李董,2 金刘,3 Zhihong马,1 Huilian黄,1 骊山敏,1 利晟戴
,1
和
董顺利1
1湖州分子医学重点实验室,湖州中心医院,湖州,313000年浙江,中国
2胸外科、湖州中心医院,湖州,313000年浙江,中国
3湖州中心医院病理学系,湖州,313000年浙江,中国
文摘
客观的。的receptor-type酪氨酸受体磷酸酶κ(PTPRK)是一个候选肿瘤抑制参与肿瘤发生的各种器官。然而,它的表达在非小细胞肺癌(NSCLC)和生物的作用尚未研究。方法。PTPRK表达式在NSCLC组织和细胞系使用实时聚合酶链反应和免疫印迹检查。此外,PTPRK对细胞迁移的影响,入侵和扩散进行了评估在体外。此外,我们探讨的差别是否对这些PTPRK导致非小细胞肺癌细胞株STAT3激活免疫印迹。phospho-STAT3的表达Tyr705在初级人类非小细胞肺癌组织被免疫组织化学评估。结果。结果表明,PTPRK经常降低在NSCLC组织中表达与淋巴结转移和细胞系。PTPRK表达式的抑制导致增殖,增加入侵,非小细胞肺癌细胞的迁移在体外。此外,PTPRK沉默之后,phospho-STAT3Tyr705在非小细胞肺癌细胞显著增加。此外,phospho-STAT3Tyr705非小细胞肺癌组织水平与淋巴结转移呈正相关,与PTPRK的表达和显著负相关性( )。结论。这些结果表明,PTPRK小说在NSCLC肿瘤抑制功能,及其抑制的能力可能参与STAT3激活。
1。介绍
肺癌,尤其是非小细胞肺癌(NSCLC),是癌症相关死亡的最常见原因1]。尽管成功的手术切除,化疗,肿瘤复发经常发生在5年内有转移(2]。到目前为止,肺癌的5年生存率没有明显增加(3]。在过去的几十年里,多个癌基因和肿瘤抑制基因被发现在生物过程调节肺肿瘤发生。然而,发病的分子机制仍然知之甚少。
酪氨酸磷酸化模式的改变是一种常见的现象在不同的人类癌症,包括肺癌。蛋白质磷酸化是一个可逆过程,是由蛋白质酪氨酸激酶(ptk)和蛋白质酪氨酸磷酸酶(中)4,5]。Receptor-type酪氨酸受体磷酸酶κ(PTPRK)驻留在经常删除染色体6问地区,是一个跨膜酪氨酸磷酸酶,包含一个细胞外粘附群体的域和胞质酪氨酸磷酸酶域(6]。最近的研究表明,在许多人类癌症PTPRK经常表达下调。例如,减少PTPRK表达式被报道与乳腺癌预后不良(7]。其他的证据表明,PTPRK是一个潜在的肿瘤抑制结肠癌(8]。最近的研究表明,PTPRK经常underexpressed NKTCL和有助于NKTCL发病机理(9- - - - - -11]。尽管一些研究已经表明,PTPRK的表达显著下调肺cancer-derived细胞系,对异常信号在肺癌基本上仍未开发的12]。
在目前的研究中,我们审查PTPRK表达式在NSCLC组织和细胞系和调查PTPRK监管在非小细胞肺癌的进展。
2。方法和材料
2.1。主题和临床数据
新鲜组织标本来自46个病人手术切除的非小细胞肺癌湖州中心医院从2013年9月到2015年12月。没有收到任何病人手术前化疗或放疗。收集到的组织样本立即冻结在液氮和存储在-80°C RNA隔离。四个μ米厚的组织部分用于免疫组织化学来源于formalin-fixed石蜡包埋组织样本。我们的研究是湖州中心医院的伦理委员会批准。和书面知情同意表格从所有的参与者都被收购了。
2.2。细胞系,细胞培养
八肺癌细胞系(16来,95 c, 95 d, A549, GLC82, NCI-H1299, NCI-H460,和SPCA-1)从细胞购买银行的中国医学科学院(中国,北京)。prmi - 1640的细胞培养介质,补充10%胎牛血清(的边后卫)和1.5 g / L碳酸氢钠在37°C在湿润的气氛中5%的有限公司2(热电子集团、美国)。
2.3。RNA提取和定量实时PCR(存在)
从组织总RNA提取标本用试剂盒™试剂(热费希尔科学)。孤立的RNA被转换为cDNA Prime-Script RT试剂盒(豆类,大连,中国)。进行了定量实时PCR分析与SYBR预混料交货Taq TM II工具包(豆类)ABI 7500实时PCR系统(美国应用生物系统公司)和归一化的表达β肌动蛋白。PTPRK引物的5 - - - - - -ACAGAGTGGTGAAAATAGCAGGAA-3和反向5 - - - - - -TGACAACTAGGAGAAGGAGGATGA-3 。
2.4。免疫组织化学
formalin-fixed,石蜡包埋组织被切割(4μ米),安装到poly-L-lysine-coated玻片为免疫组织化学(13]。deparaffinized二甲苯和水化后的一系列乙醇分级方案,片内加热高压炊具有10更易/ L的柠檬酸缓冲(pH值6.0)抗原检索。的anti-pSTAT3Tyr705(1:500,# 9145;细胞信号,丹弗斯,美国MA)与组织孵化部分在一夜之间在4°C。随后,片是孵化与二次抗体和color-developed使用民建联根据制造商的建议。
2.5。RNA干扰
两个不同PTPRK小核RNA)碎片和非特异性控制核核NC)被Sigma-Aldrich设计和合成。小干扰rna # PTPRK意义上的序列如下:1,5 - - - - - -CGAUUAUCCACUGCCUAAAdTdT-3小干扰rna # 2和5 - - - - - -GUGAUGUGAUCAACCGGAUdTdT-3 。siRNAs / siRNA数控是转染到细胞击倒PTPRK Lipofectamine 2000(美国表达载体)。转染后48 h,收集细胞进一步化验。
2.6。细胞增殖检测
细胞增殖是由CCK-8工具包(Beyotime,中国)13]。简单地说, 转染H1299和A549细胞被播种到每一个的96孔板和培养6 h - 72 h。不同的实验周期结束时(6、24、48和72 h), 10μL CCK-8的解决方案是添加到每个2 h孵化在37°C。细胞生存能力是由阅读OD(光密度)的波长450 nm使用标。
2.7。伤口愈合实验
H1299和A549细胞的迁移能力表现在古典伤口愈合试验(13]。短暂,six-well组织培养培养皿中的细胞融合手动挠了10 80%μL小费。通过汇合的擦伤与统一的宽度都是单层。细胞被取代在新鲜培养基和孵化37°C。最初的伤口和细胞的运动的图像到挠区域被使用一个倒置显微镜观察和拍摄(德国徕卡DMIL)在0和20 h。
2.8。Transwell入侵检测
细胞侵袭能力使用细胞入侵检测工具(没有检测到。美国微孔ECM550) [13]。短暂,H1299 A549细胞转染后24小时,收获播种密度 细胞进入参议院。随后,500μL (rpmi - 1640中10%胎牛血清添加到众议院。24小时后孵化在37°C,剩下的细胞在膜的上表面仔细清除出场。入侵细胞的下表面膜浸渍插入被染色的染色溶液为20分钟。五个随机领域统计每室使用一个倒置显微镜(德国徕卡DMIL),并且每个实验重复一式三份。
2.9。免疫印迹分析
细胞细胞溶解和分离NETN裂解缓冲(20毫米Tris-HCl (pH值8.0),100毫米氯化钠,EDTA 1毫米,和0.5%诺乃清洁剂p 40)补充了1毫米PMSF (Beyotime、海门、中国)13]。蛋白质浓度采用快速启动布拉德福德,评估分析工具包(Bio-Rad)。相等数量的总蛋白质是煮和10% sds - page分离和转移到PVDF膜。涂抹膜孵化与稀释在一夜之间特定的抗体在4°C和山羊anti-rabbit二级抗体(杰克逊ImmunoResearch 1: 10000年,美国)随后。目标乐队被ECL显色底物检测。STAT3(# 12640)和pSTAT3(# 9145)抗体购自细胞信号技术有限公司PTPRK (ab185370)和β肌动蛋白抗体(ab8227)从Abcam购买。免疫印迹使用ImageJ软件进行量化。
2.10。统计分析
18.0统计软件SPSS Inc .,萨默斯,纽约,美国)被用来执行统计分析在这项研究。Mann-Whitney测试是用来比较均值之间的mRNA水平两组。单向方差分析与Bonferroni后续测试分析的区别16 hbe和七个肺癌细胞。时被认为是显著的值小于0.05。
3所示。结果
3.1。PTPRK经常Underexpressed在非小细胞肺癌淋巴结转移(LN)
建立PTPRK表达与肿瘤转移的关系,PTPRK mRNA表达水平是衡量存在分析30肺肿瘤non-lymph节点转移和16个肿瘤淋巴结转移。如图1(一),我们发现mRNA水平PTPRK显著降低在淋巴结转移组相比non-lymph节点转移组( )。同样,PTPRK水平在7个非小细胞肺癌细胞株(95 c, 95 d, A549, GLC82 NCI-H1299, NCI-H460,和SPCA-1)明显低于正常的肺细胞行(16 hbe) ( ,图1 (b))。
(一)
(b)
3.2。PTPRK击倒在H1299细胞破坏其Oncosuppressive功能
确定PTPRK导致肺细胞的转移能力,我们使用两个化学合成siRNAs击倒内源性PTPRK H1299和A549细胞。后48 h posttransfection PTPRK蛋白质表达水平有效75%撞倒siR-PTPRK-2 #由免疫印迹分析(数据2(一个)和2 (b))。结果表明,PTPRK击倒强烈促进了迁徙能力进一步差距相比控制(图2 (c))。同样,我们也观察到进攻能力PTPRK siRNA-mediated沉默后(增加数据2 (d)和2 (e))。此外,消声PTPRK H1299和A549细胞显著促进细胞增殖(图2 (f))。总的来说,我们的研究结果验证了PTPRK-mediated肿瘤抑制功能通过抑制肺癌细胞的扩散和转移。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
3.3。有助于STAT3差别PTPRK对这些基因的激活和与非小细胞肺癌的预后不良有关
STAT3持续激活在大约50%的非小细胞肺癌原发灶和肺cancer-derived细胞系。最近的研究表明,PTPRK基因包含STAT3-specifying图案,在NKTCL负调节STAT3激活(9]。因此,我们探索的差别是否对这些PTPRK导致肺癌中STAT3激活。事实上,PTPRK损耗显著增加phospho-STAT3的水平Tyr705在H1299细胞(数字3(一个)和3 (b))。重要的是,phospho-STAT3的表达Tyr705是显著负相关的mRNA水平PTPRK 26 NSCLC组织中( , ,数据3 (c)和3 (d)),phospho-STAT3的高表达Tyr705是积极的与非小细胞肺癌患者的淋巴结转移的相关性( )(表1)。
(一)
(b)
(c)
(d)
|
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4所示。讨论
蛋白酪氨酸磷酸酶(中),ptk的自我平衡的总统,是至关重要的监管机构,控制细胞内稳态。PTPRK,位于经常删除各种肿瘤的基因区域6 q22.2 - 22.3,被确认为一个候选人在癌症研究中肿瘤抑制基因(14,15]。几项研究已经报道低水平的PTPRK成绩单在乳腺癌、结肠癌、杆状的肿瘤(5,7,16]。在最近的研究中,我们的研究结果发现低PTPRK表达与非小细胞肺癌淋巴转移组织和细胞系(图1)。我们最近的研究表明,PTPRK mir - 1260 b的直接目标在非小细胞肺癌细胞中,以上的差别,对这些PTPRK与不良预后相关的非小细胞肺癌患者(13]。以前的数据从一个乳腺癌研究证明减少PTPRK水平主乳房肿瘤(7]。同样的趋势CNSL患者存活时间被发现(10]。
后减少PTPRK表达式在体外,我们观察到的强烈促进细胞增殖的能力,侵袭性和迁移,如预期的肿瘤抑制肺癌(图2)。它暗示向负PTPRK在肺癌侵袭转移中的作用,这是符合其功能在其他癌症。PTPRK的差别具体来说,对这些基因在乳腺癌细胞系与增加细胞增殖有关,粘附和入侵7]。
信号传感器和转录激活3 (STAT3),一个重要prooncogenic转录因子在多个癌症(17- - - - - -19),持续激活在大约50%的非小细胞肺癌原发灶和肺cancer-derived细胞系和可能是最重要的一个致癌司机在非小细胞肺癌11,20.]。STAT3磷酸化在Tyr705不同上游激酶,包括细胞因子受体酪氨酸激酶,是STAT3的关键步骤激活,导致广泛的基因的转录,肺癌的发病机制中扮演关键的角色15,21]。在这里,我们发现phospho-STAT3Tyr705非小细胞肺癌组织水平与淋巴结转移呈正相关,与PTPRK沉默的表达和显著负相关性。
PTPRK phospho-STAT3的表达增加Tyr705在非小细胞肺癌细胞(图3)。这些结果表明,PTPRK表达可能导致肿瘤发生的损失通过激活STAT3的癌蛋白在非小细胞肺癌。通常情况下,激活STAT3蛋白可以迅速脱去磷酸蛋白磷酸酶(22]。然而,在大多数肺癌STAT3持续活跃。因此,PTPRK活动的减少可能是负责本构激活STAT3在肺癌。
总之,我们证明了PTPRK蛋白是一个重要的角色在肺肿瘤的扩散和转移通过其抑制STAT3活动NSCLC的能力。我们的发现显示PTPRK作为一种重要的肿瘤抑制和一个潜在的目标基因在非小细胞肺癌的诊断和治疗。
缩写
| PTPRK: | 蛋白质酪氨酸磷酸酶,受体类型K |
| STAT3: | 信号传感器和转录激活3 |
| 非小细胞肺癌: | 非小细胞肺癌。 |
数据可用性
的数据支持本研究的发现可以从相应的作者在合理的请求。
的利益冲突
作者宣称没有利益冲突有关的出版这篇文章。
作者的贡献
Xuting徐和李董的贡献同样这项工作。
确认
支持的研究从浙江省自然科学基金资助(没有。LY16H160002)和公众的湖州市(关键技术应用研究计划项目。2015 gz15)。
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