条件培养基从脂肪干细胞抑制Jurkat通过TGF -细胞增殖β1和p38 MAPK通路

文摘

背景。第一份报告后,脂肪中提取干细胞的免疫调节和免疫抑制特性(ADSCs),许多研究阐明潜在的分子机制的抑制活性混合淋巴细胞反应(高)。然而,差距存在于我们理解ADSC-conditioned介质的分子机制(ADSC-CM)高。方法。ADSCs从人体脂肪组织分离,酶联免疫吸附试验(ELISA)是用于识别转化生长因子的浓度β1 (TGF -β1)在ADSC-CM。TGF -的转录丰度β1,以及胰岛素样生长因子结合蛋白3 (IGF-BP3),使用中存在评估在ADSC-CM Jurkat细胞培养24小时。Jurkat细胞的增殖是通过细胞周期分析评估。西方墨点法进行识别潜在的信号分子参与ADSC-CM-induced Jurkat细胞增殖的抑制作用。结果。孤立的发现证实ADSCs展示经典ADSC的特点。TGF -水平β1被发现低ADSC-CM评估ELISA。Jurkat细胞生长在ADSC-CM TGF -基因表达降低β1,与对照组相比IGF-BP3。此外,西方墨点法ADSC-CM种植Jurkat被封锁在G0 / G1期细胞表明ADSC-CM pP38的蛋白表达降低剂量依赖性的方式。结论。ADSC-CM可以抑制Jurkat通过TGF -细胞增殖β1-p38信号通路。

1。介绍

间充质干细胞(msc)是公认的免疫调节能力(1- - - - - -3]。ADSCs,由于他们从容的孤立的充足的组织来源,msc的良好来源用于一个广泛的各种各样的疾病的治疗(4]。ADSCs没有显示的主要组织相容性complex-II表达式(5),及其免疫抑制的行为是由前列腺素E2 (PGE2) [6]。临床前和临床研究表明,同种异体移植ADSCs能够调节移植物抗宿主疾病(7,8]。研究已经证明,许多有针对性的疾病表现出显著改善ADSC异种移植后(9]。

核因子-κB (NF -κB)存在休眠细胞质成分的复合物,与成员的抑制剂κ(我κB)和家人起着关键和免疫进化的作用10]。以前的研究已经表明ADSCs可以调节通过NF - T和树突细胞生物活性κB信号通路,在某种程度上类似于msc (11]。由ADSCs此外,旁分泌分泌物,包括细胞因子il - 10、PGE2,和indoleamine-2 3-dioxygenase (IDO),还有一个重要的角色在免疫6]。尽管许多研究都集中在ADSCs的免疫抑制活性,其影响在高仍然未知的分子变化。因此,目前的研究表明在Jurkat ADSC-CM细胞的影响。

2。材料和方法

2.1。人类ADSCs的分离和培养

人类脂肪组织样本从捐赠者获得接受lipoplasty。获得脂肪组织冲洗3次用PBS和消化0.1%胶原酶IV(罗氏诊断、德国)1 h。接下来,获得的悬架是获得ADSCs离心机。ADSCs培养在杜尔贝科的修改鹰介质(DMEM)由10%胎牛血清,100 U /毫升青霉素和链霉素(美国Gibco) 37°C,在5%的股份有限公司₂孵化器。一旦ADSCs confluency达到80 - 90%,他们在DMEM / F12培养基孵化24 h。这个孵化后,中收集,离心机 了5分钟,然后储存在-80°C。在章节2 - 6细胞的培养基用于其余的实验。获得伦理委员会批准的上海交通大学医学院。知情同意是获得所有的病人。

2.2。Jurkat细胞

Jurkat细胞,从写明ATCC购买,RPMI系统中包括10%胎牛血清在37°C包含5%的湿润孵化器有限公司₂。

2.3。流式细胞术

在PBS收获和洗涤3次之后,人类ADSCs孵化与以下FITC-conjugated抗体:CD29、CD44、CD45、CD90、CD105, CD31、CD34(美国圣克鲁斯生物技术)37°C在黑暗中30分钟。流式细胞仪是用来检测(美国BD生物科学)。

2.4。脂肪形成的和成骨分化

人类ADSCs (10⁵细胞/在章节3 - 5)播种0.1% gelatin-coated six-well板块(Cyagen生物科学,中国),允许confluency达到80 - 90%。脂肪形成的分化促使越来越多的细胞中含有0.5μ0.5 mol / L地塞米松,更易与L 3-isobutyl-1-methylxanthine, 0.1 L更易与罗格列酮,100 IU胰岛素为2周(Cyagen生物科学)。成骨分化是通过增加细胞中含有0.1μmol / L地塞米松,50μ10 mol / L抗坏血酸,更易与Lβ甘油磷酸盐为3周(Cyagen生物科学)。每3天中被改变。的分化,4%多聚甲醛在PBS修复细胞用于在室温下15分钟。接下来,细胞染色使用油红O和茜素红S,供应商的协议后,为了评估脂肪形成的和成骨分化。专门染色的数量ADSCs计算使用光学显微镜(日本奥林巴斯)。

2.5。间接Coculture条件

为了制定条件培养基,人类ADSCs从6人在DMEM / F12培养基培养24小时。脱细胞条件培养液(CM)离心机,小心,并储存在-80°C,直到进一步的使用。对照组的细胞在DMEM / F12培养基培养进行进一步的实验。此外,25%,50%,和75%厘米游离DMEM / F12被用作实验组。

2.6。ELISA

TGF -的数量β1的条件培养基决心使用酶联免疫试剂盒,按照供应商的方案(美国研发系统)。

2.7。定量实时聚合酶链反应(存在)

如前所述(执行中存在12]。总之,从Jurkat细胞总RNA提取后24小时内文化与不同浓度的ADSC-CM,使用一个RNA隔离设备(豆类生物、日本)。A260 / A280比率是用来评估RNA纯度,在1.8和2.0之间。以下引物被用于基因扩增:TGF -β1-forward亚美大陆煤层气有限公司广汽CTC GGC TGG亚美大陆煤层气有限公司TG和反向20 GGT答GCT GGT TGT;IGF-BP3-forward CCC柠檬酸ACC亚美大陆煤层气有限公司亚美大陆煤层气有限公司AAT G和反向AAC亚美大陆煤层气有限公司标签广汽苑ACC TT。为了定义相对基因表达,3自主反应的结果。GAPDH表达式用于规范化研究结果。三个独立实验的结果从三个技术复制使用。

2.8。细胞周期

24小时在ADSC-CM增长之后,Jurkat细胞收集和使用PBS洗一次,然后固定在70%的酒精,一夜之间。细胞周期分析是通过细胞周期进行装备(Qihai生物技术,中国),按照供应商的协议。流式细胞术分析是使用流式细胞分析仪(贝克曼库尔特)和ModiFit LT v2.0软件。三个独立实验的结果从三个技术复制使用。

2.9。西方墨点法

从Jurkat细胞总蛋白提取24或48小时后的coculture里帕裂解缓冲,正如前面发表(13]。核通过NE-PER核和胞质蛋白提取提取试剂(美国罗克福德皮尔斯生物技术)实验组和对照组。蛋白质样品(40μ每g)加载在SDS-polyacrylamide凝胶,电泳,然后转移到PVDF膜。使用增强化学发光蛋白质乐队被抓获(ECL)检测设备(英国Amersham生物科学)。以下主要抗体被用于:phospho-Akt, Akt, phospho-Erk, Erk1/2, phospho-JNK,物,phospho-p38,和p38, GAPDH是用作加载控制。三个独立实验的结果。

2.10。统计分析

所有的数据都显示为 偏差(SD)。使用SPSS 19.0版进行了统计分析。统计学意义是用单向方差分析计算。事后分析进行了使用图基的多重比较检验。一个值< 0.05被认为反映了统计学意义。

3所示。结果

3.1。描述的ADSCs

正如前面发表(14),人类ADSCs表示阳性染色的间充质干细胞表面标记:CD29 (100%)、CD44 (99.4%)、CD105(85.2%),和CD90(99.8%),尽管他们表示负染法对以下造血干细胞表面标记:CD31 (0.1%)、CD34(0.1%),和CD45(0.1%)(图1(一))。人类ADSCs还显示一个典型的呈形态(图1 (b))。我们检查的多功能分化能力ADSCs使用脂肪形成的和成骨的化验。ADSCs分化成一个脂肪形成的表型在2周的脂肪形成的媒介,通过接触油红O染色(图1 (c))。当培养3周成骨的介质,ADSCs展览矿化,明显与茜素红染色后美国这表明钙沉积(图的存在1 (d))。这些结果表明,孤立ADSCs呈现典型的ADSC的特点。

3.2。稀缺的TGF -β1表达ADSC-CM

先前的研究已经报道,TGF -β1在细胞增殖中起着至关重要的作用,经济增长,和分化15]。根据我们的实验结果(图2),TGF -的浓度β1只被发现 ,这太低有任何影响细胞生物活性的分泌物ADSCs ADSC-CM。

3.3。ADSC-CM减少TGF -的基因表达β1、IGF-BP3 Jurkat细胞

IGF-BP3, IGF结合蛋白可以绑定到TGF -ΒV (T受体βr v)和调解TGF -β全身的生长抑制与TGF -音乐会β我受体(Tβ第i)和TGF -βII受体(TβR-II) [16]。这项研究的结果表明,ADSC-CM可以暗示地减少TGF -的基因表达β1和IGF-BP3(图3)。

3.4。ADSC-CM压制细胞增殖

培养24小时后Jurkat细胞条件培养基,细胞的数量在G0 / G1期被发现增加,同时减少在G2 / M期细胞(图4)。

3.5。ADSC-CM Jurkat细胞的蛋白表达降低

p38 MAPK的磷酸化水平降低中等文化Jurkat细胞后,在不同浓度的ADSC-CM。但是,没有值得注意的影响Akt的刺激,ERK1/2,物是观察(图5)。

4所示。讨论

的修复或替换受伤的器官仍然是一个必要的和复杂的社区健康问题。器官移植可能是最有效的治疗方法有缺陷或损坏的器官。然而,移植排斥仍是成功的最大障碍和永久性移植(17]。已经有大量的研究集中在持久的器官移植移植和衰减的方法免疫排斥。淋巴细胞的作用,特别是T细胞在移植排斥是有力的,证明了裸小鼠实验;这些老鼠并没有把同种异体皮肤移植,因为他们缺乏CD4 +和CD8 +功能(18]。然而,重建这个功能使用收养搬迁普通T细胞触发解雇的植皮手术18]。因此,同种异体移植困难的激活因子CD4 +和CD8 + T细胞免疫反应19,20.]。树突状细胞(dc)、巨噬细胞、多形核细胞,血管生成介质和细胞因子,也刺激解雇(21]。许多免疫抑制剂用于抑制移植排斥不能有效抑制免疫反应,引起许多副作用22]。

科学家们试图确定多年来抑制免疫反应的一种有效方式。msc、发现以来的研究发现,msc组织损伤的位置可以移动,引起炎症,通过调节树突细胞产生抗炎作用,自然杀伤细胞(NK细胞),T细胞和B细胞(23]。msc还可以促进调节性T (Treg)细胞和维持其功能(24]。ADSCs,共享相同的生物属性与MSC,承诺MSC对抗免疫排斥。第一个报告免疫调节,以及ADSCs的免疫抑制特性,于2005年出版;更精确地说,在体外实验表明,ADSCs不加重alloreactivity,他们能够抑制高钙(25]。因为大量研究揭示了可溶性的突出因素,在最大限度地承认是PGE2,相信ADSCs可能不需要的免疫抑制效应和信息联系(26]。此外,精确的吲哚胺2,预防3-dioxygenase或无效的白血病抑制因子也被发现消除ADSCs[造成的免疫抑制27,28]。此外,我们试图发现淋巴细胞反应的机制导致ADSCs secretomes的释放。

本研究的结果发现,ADSCs包含CD29、CD44、CD105, CD90标记。同时,孤立的人类ADSCs发现展览multilineage分化潜能和自我更新能力。他们呈形态是按照之前的报告29日]。

TGF -β1在细胞增殖和生长中起着至关重要的作用。为了排除TGF -的影响β1,我们用ELISA检测TGF -的浓度β在ADSC-CM 1。此外,研究表明,TGF -β1不发挥关键作用在抑制由通道ADSCs [25]。如图2,TGF -的浓度β1 ADSC-CM被发现极低( );因此,它不可能干扰后续实验的结果。Tβr v作为IGF-BP3受体介导IGF-independent IGF-BP3造成的增长抑制反应细胞。我们的研究结果表明,基因表达的TGF -β1和IGF-BP3 Jurkat细胞生长在ADSC-CM降低显著(图3)。

细胞周期分析也用于评估细胞增殖和生长条件。试验的结果表明,ADSC-CM-treated Jurkat细胞停留在G0 / G1期细胞周期,对应与rt - pcr结果在一定程度上。

分析扩散和增长,我们也想确定相关的可能机制。因此,西方墨点法用于分析Jurkat细胞的抗增殖作用可能的机制。我们的研究结果显示,pP38水平显著降低随着ADSC-CM的浓度增加,表明磷酸化ADSC-CM-mediated p38是重要的免疫抑制。然而,ADSC-conditioned培养基成分的损耗介质可能会影响结果。因此,进一步的研究探索某些分子的扩散效应T细胞在CM中仍有待解决。

器官移植解雇在再生医学是一个必要的问题。拒绝过程发生由于刺激T细胞,要么由于直接,间接,或半直接同种抗原识别,连同附件B和NK细胞的积极参与,废除供者细胞。努力促使宽容,以及延长移植的耐力,并没有完全成功。补充替代方法,包括干细胞疗法,更有效。用干细胞治疗有着丰富的生物工程领域的潜力,由于易于获取细胞修复或者替换受伤的组织或器官。因此,ADSCs,这非常类似于msc、易于获取和显示巨大的潜力的治疗修复受损组织。

5。结论

最后,目前的研究结果显示,ADSC-CM能够抑制Jurkat通过TGF -细胞增殖β1 / p38信号通路。然而,更多的功能需要测量之前ADSC-CM可以用作耐受性策略在不久的将来。

数据可用性

流式细胞术、PCR、ELISA和世行数据用于支持本研究的结果包括在本文中。如果有其他信息需要,相应的作者提供的信息请求。

伦理批准

所有的实验都是伦理委员会批准上海9^th人民医院、上海交通大学医学院。

的利益冲突

没有利益冲突。

作者的贡献

Xiuxia王先生和王沉积对本文的贡献同样co-first作者。

确认

我们要感谢实验室的组织工程在上海9^th人民医院、上海交通大学、提供必要的设备和技术指导完成工作和支持中国的自然科学基金(81401613)。

引用

1. s·m·迪瓦恩,a . m .巴塞洛缪:马哈茂德et al .,“间充质干细胞能够寻的非人类的灵长类动物的骨髓系统注入后,“实验血液学卷,29号2、244 - 255年,2001页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
2. 利奇缇,k . w .该t·c·麦肯齐,a·f·班et al .,“人类间充质干细胞灌输和演示因地制宜分化后在子宫内在羊移植。”自然医学》第六卷,没有。11日,第1286 - 1282页,2000年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
3. 巴塞洛缪,c .鲟鱼,m . Siatskas et al .,“间充质干细胞在体外抑制淋巴细胞增殖,延长皮肤移植体内生存,”实验血液学,30卷,不。1,42-48,2002页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
4. m . Sheykhhasan r·t·库米和m . Ghiasi纤维蛋白支架设计为了人类脂肪间充质干细胞分化为软骨细胞的TGF -β3,“国际干细胞杂志》上,8卷,不。2、219 - 227年,2015页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
5. p·m·Kornacker a Mehlhorn et al .,“比较免疫学性质的骨髓基质细胞和脂肪tissue-derived干细胞成骨分化之前和之后在体外”,组织工程,13卷,不。1,第121 - 111页,2007。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
6. n . l .崔阴,w . Liu, w•张曹y,“扩大脂肪中提取干细胞抑制混合淋巴细胞反应的分泌前列腺素E2,”组织工程,13卷,不。6,1185 - 1195年,2007页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
7. m . Gautam d . Fujita k .木村et al .,“脂肪tissue-derived干细胞移植改善心脏收缩功能和电子稳定在大鼠心肌梗死模型,”分子和细胞心脏病学杂志》上卷,81年,第149 - 139页,2015年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
8. w·高,l, y, c .太阳,x,, y,“脂肪间充质干细胞促进肝再生和抑制small-for-size肝移植排斥,“移植免疫学,45卷,1 - 7,2017页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
9. z l . m . l . Ren w . Peng杨et al .,“同种异体免疫原性较低的脂肪中提取干细胞构建组织工程骨修复骨缺损的猪,”细胞移植,21卷,不。12日,第2721 - 2711页,2012年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
10. j·k·杜兰和a·s·鲍德温”针对IKK和NF -κB治疗。”蛋白质化学和结构生物学的进步卷,107年,第115 - 77页,2017年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
11. 非规范NF - s . c .太阳。κB途径免疫和炎症。”自然评论免疫学,17卷,不。9日,第558 - 545页,2017年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
12. 周x y . Wang Wang x, z, j .杨和f·刘,“抑制效应由人类脂肪干细胞的激活T细胞包括物,”国际分子医学杂志》上,43卷,不。1,第184 - 177页,2019。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
13. 瞿m . w . Wang,徐l . et al .,”索拉非尼对anti-keloid活动得罪TGF -β/ Smad和MAPK / ERK信号通路。”分子医学杂志,卷94,不。10日,1181 - 1194年,2016页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
14. 美国d . Wankhade m .沈r . Kolhe和s . Fulzele“进步在脂肪中提取干细胞隔离、表征和应用再生组织工程”干细胞国际卷,2016篇文章ID 3206807、9页,2016。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
15. s . Dennler m . j . Goumans和p .十Dijke“转化生长因子β信号转导,”《白细胞生物学,卷71,不。5,731 - 740年,2002页。视图:谷歌学术搜索
16. 黄黄和j·s .”TGF -β控制细胞增殖的。”细胞生物化学杂志》上,卷96,不。3、447 - 462年,2005页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
17. g . Papp p .米堡,b . Nakken p . Szodoray和m . Zeher”监管自身免疫、移植免疫学、免疫细胞和功能”自身免疫的评论,16卷,不。5,435 - 444年,2017页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
18. j·p·桑德博格,r·w·邓斯坦,w . g .投影机和d . r .科学家Roop”从片状皮肤全层皮肤移植小鼠裸体小鼠:维护psoriasiform表型,”《皮肤病学研究杂志》上,卷102,不。5,781 - 788年,1994页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
19. j·a·布拉德利,s . r . Sarawar Porteous et al .,“同种异体移植物排斥在CD4 + T cell-reconstituted无胸腺的裸体rats-the不必要的host-derived CD8 +细胞的作用,“移植,53卷,不。2、477 - 482年,1992页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
20. 木头和r·k·j·Goto”,排斥机制:目前的观点,”移植,卷93,不。1、1 - 10,2012页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
21. c·里希特·d·a . van Pelt e . van Geldrop et al .,“鼠皮肤树突细胞,迁移”《白细胞生物学,60卷,不。3、317 - 322年,1996页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
22. 罗x, x, j.y.侯et al .,“免疫抑制药物治疗原发性硬化性胆管炎:系统回顾和荟萃分析,“消化系统疾病,35卷,不。5,478 - 485年,2017页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
23. k . a .赵j·k·李,y . h . Kim m .公园郑胜耀哇,和k h . Ryu“间充质干细胞改善B-cell-mediated免疫反应和增加IL-10-expressing监管B细胞EBI3-dependent地,“细胞与分子免疫学,14卷,不。11日,第908 - 895页,2017年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
24. r . j .唐、沈、x y赵et al .,“间充质干细胞细胞调整Treg细胞抑制colitis-associated结直肠癌,”干细胞研究与治疗》第六卷,没有。1,p。71年,2015。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
25. b .强力,c . Barreau p Bourin et al .,“人类脂肪tissue-derived成人干细胞的免疫调节效应:与骨髓间充质干细胞,”英国血液学杂志》,卷129,不。1,第129 - 118页,2005。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
26. s Wolbank a . Peterbauer m . Fahrner et al .,“巧克力摄入量有关人类从羊膜干细胞的免疫调节效应:比较与人类间充质干细胞从脂肪组织,”组织工程,13卷,不。6,1173 - 1183年,2007页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
27. j·w·康k . s . Kang h·c·古j . r .公园,e·w·崔和黄懿慧公园,“可溶性factors-mediated犬tissue-derived脂肪间充质干细胞免疫调节的影响,“干细胞与发展,17卷,不。4、681 - 694年,2008页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
28. m . Najar g . Raicevic h . i Boufker et al .,“Adipose-tissue-derived和沃顿商学院的jelly-derived间充质基质细胞分泌抑制淋巴细胞反应的白血病抑制因子,”组织工程部分,16卷,不。11日,第3546 - 3537页,2010年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
29. j . w . y . Li Zhang et al .,“脂肪tissue-derived干细胞抑制肥厚性瘢痕纤维化通过p38 MAPK信号通路,”干细胞研究与治疗,7卷,不。1,p。102年,2016。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索

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