叶酸代谢酶的异常表达及其诊断和预测卵巢癌生存

文摘

本研究旨在验证叶酸受体的水平的变化α(FOLR1)、二氢叶酸还原酶(DHFR)和蛋氨酸合成酶还原酶(MTRR)组织的OC的病人。FOLR1的表达、DHFR MTRR评估80例原发性OC, 50例良性卵巢肿瘤,30正常卵巢组织。蛋白表达和临床病理特征之间的关联进行了评估,诊断和预后评价FOLR1, DHFR, MTRR执行。结果表明,调节FOLR1 MTRR和表达下调DHFR发现OC。异常的患者FOLR1、DHFR MTRR倾向于有更高比例的铂电阻。此外,接受者操作特征曲线下的地区(AUCs-ROC) FOLR1, DHFR, MTRR分别为0.723,0.717,和0.714,分别。FOLR1的结合,DHFR, MTRR可以产生一个接受者操作特征曲线下面积0.864区分platinum-resistant患者platinum-sensitive患者( )。FOLR1的表达之间的相关性存在,DHFR, MTRR。此外,kaplan meier曲线表明,患者中MTRR相比有一个贫穷的总体生存时间较低的表达式( )。因此,叶酸代谢酶可以提供一个潜在的有前途的生物标志物的诊断platinum-resistant OC。

1。介绍

卵巢癌是第四全球女性最常见的癌症,它最值得注意的致命率在妇科恶性肿瘤。两个卵巢恶性肿瘤治疗最关键的障碍是缺乏早期诊断标记和促进耐药治疗后,尤其是在晚期。各种表观遗传变化在卵巢癌。最近的进展我们对卵巢恶性肿瘤的分子发病机制的理解大大为分子靶向治疗提供了潜在的新目标。因此是一个重要的需要改进的生物标志物和治疗卵巢癌,将来自一个更好的理解疾病的生物学。

DNA合成叶酸是一个重要的组成部分,复制和修复、蛋白质合成和甲基化反应。特别是快速分裂的细胞(1]。叶酸受体1 (FOLR1)内在化的叶酸受体介导的内吞作用和减少叶酸载体(RFC)运输使用双向阴离子交换机制的叶酸进入细胞质(2,3]。二氢叶酸还原酶(DHFR)催化二氢叶酸(DHF)的减少tetrahydrofolate(四氢呋喃),起着至关重要的作用在细胞代谢和细胞生长4]。蛋氨酸合成酶还原酶(MTRR)是一个在叶酸代谢酶控制地铁的活动转移甲基methyltetrahydrofolate同型半胱氨酸通过蛋氨酸合成酶,负责DNA甲基化(5]。

在我们先前的研究实验室,卵巢抗癌的细胞系建立了筛选耐药基因(6]。它们中的大多数都是与新陈代谢有关,尤其是叶酸代谢。与此同时,有报道称,过度顺铂耐药性MTRR扮演重要的角色,和压制MTRR表达部分逆转有顺铂耐药性表型(7]。在目前的研究中,FOLR1的表达水平,DHFR, OC组织MTRR和检查,这三种蛋白质的预测能力研究和比较。

本研究的目的是验证FOLR水平的变化,DHFR, MTRR OC患者的组织。我们试图确定叶酸代谢酶可以作为一种新的生物标志物早期诊断和预后的platinum-resistant OC的病人,以及他们在OC的临床意义。

2。材料和方法

2.1。临床样品和后续

OC组织和正常卵巢组织收集于患者治疗的妇科肿瘤的广西医科大学附属肿瘤医院2004年至2010年之间。所有患者病理诊断为度。病理阶段和组织学亚型测定根据国际妇产科联合会(FIGO)标准和世界卫生组织的标准。临床和病理数据收集的医疗记录,包括年龄、手术阶段,转移,腹水、肿瘤分级和亚型,耐药性。样本收集的80例原发性OC, 50例良性卵巢肿瘤,30正常卵巢组织。的平均年龄为41.1岁(范围:13 - 76年)OC组40.1年(范围:10 - 74年)良性卵巢肿瘤组和43.1年(范围:29-60年)在正常卵巢组织。OC的80 OC患者接受手术治疗的61例卵巢癌上皮收到与顺铂化疗+紫杉醇和19 nonepithelial卵巢癌患者接受顺铂,博来霉素、长春新碱。这项研究是广西医科大学的伦理委员会批准。书面知情同意了之前研究的所有课程。

2.2。免疫印迹分析

160新鲜标本用超声波组织破坏者在裂解缓冲了30分钟。组织碎片是颗粒状的离心,收集上清液。测量由BCA蛋白质测定蛋白质浓度后,受到蛋白质sds - page,然后转移到PVDF膜。阻塞后,膜处理5% ( )在PBST BSA (PBS, pH值7.5,包含0.1% Tween-20)然后孵化主要抗体MTRR (1: 1000;圣克鲁斯生物技术)、FOLR1 (1: 1200;Abcam)和DHFR (1: 1000;圣克鲁斯生物技术)在一夜之间在4°C。随后这些PVDF膜处理PBST和孵化peroxidase-conjugated二级抗体(1:1000)(圣克鲁斯生物技术)为1 h。可视化是通过化学发光检测系统(美国皮尔斯)根据制造商的指示。乐队强度量化使用ImageQuant软件(分子动力学,桑尼维尔,美国)。然后,被膜和reincubated anti-GAPDH (1: 1000;圣克鲁斯生物技术)进行归一化。

2.3。免疫组织化学

石蜡包埋的部分(5μ米)的卵巢组织,通过分级deparaffinized,水化乙醇系列。抗原检索在10毫米柠檬酸缓冲在120°C (pH值6.0)2分钟。部分被允许冷却30°C和用磷酸盐(PBS, pH值7.3)。内源性过氧化物酶灭活后3%的H₂O₂10分钟与PBS和洗涤,一夜之间,部分被在4°C的环境与初级抗体在PBS然后用PBS。主要是多克隆抗体MTRR抗体(1:200;sc - 48889,圣克鲁斯生物技术)、多克隆抗体FOLR1 (1: 200;ab - 3361, Abcam)和多克隆抗体DHFR (1: 200;sc - 14778;圣克鲁斯生物技术)。部分沾一个超灵敏streptavidin-peroxidase工具包(Maixin生物、装备9719,福州,中国),和可视化执行3,3 - - - - - -diaminobenzidine (DAB)。核与哈里斯苏木精染色(Sairuida。生物,中国天津)。在消极的控制,主要抗体是PBS所取代。结肠癌样本作为一个积极的控制。阳性细胞有棕色颗粒在细胞质中。积极的癌细胞是半定量的确定根据染色强度和阳性细胞百分比。部分基于彩色强度得分:0,没有色素沉着;1、淡黄色;2、浅黄色;3,棕色的。 Five fields were randomly selected from each section, and the mean percentage of positive cells was determined: 0, <5%; 1, 5%-25%; 2, 26%-50%; 3, 51%-75%; and 4, 。免疫组织化学分数乘以强度得分和阳性细胞百分比:0 - 2 (-);3 - 4 (+);5 - 8 (+ +);和9 - 12 (+ + +)。部分是由两个观察员独立评估。

2.4。统计分析

名义变量比较使用测试和有序分类变量被非参数的斯皮尔曼等级测试评估。接受者操作特征(ROC)曲线建立了评估FOLR1的诊断价值,MTRR, DHFR区分良性和恶性,截止值计算。根据中华民国的截断值曲线,我们定义了蛋白质的结果低于上方的截断值低表达和截断值高表达。kaplan meier OS曲线被绘制的方法和比较生存率较。评估的存活时间和多个临床病理的变量之间的相关性是由Cox比例风险回归模型。单变量和多变量Cox比例风险模型被用来确定变量与操作系统有关OC组的病人。当与操作系统相关的重要的变量是通过单变量分析,多变量分析是用于评估这是操作系统的最重要的预测变量。一个值小于0.05被认为是具有统计学意义。所有的统计计算进行使用SPSS软件(美国芝加哥19.0,IL)和GraphPad Prism 5.0 (GraphPad软件公司,CA)是用于生成图表。所有的值< 0.05被认为是具有统计学意义。

3所示。结果

3.1。表达FOLR、DHFR MTRR

FOLR、DHFR MTRR表达组织的160名患者进行免疫印迹分析(图1)。免疫印迹分析的定量分析表明,FOLR1和MTRR OC组织中表达最高,而DHFR最高表达在良性肿瘤组织(图1(一))。DHFR和MTRR表达明显升高platinum-resistant OC与platinum-sensitive OC相比,虽然FOLR1表达式在platinum-sensitive platinum-resistant OC低于OC(图1 (b))。FOLR的表达之间的相关性、DHFR MTRR和卵巢组织的类型是总结表1。FOLR的表达、DHFR MTRR显著相关的卵巢组织( ,分别)。

为了检测位置、FOLR DHFR,和MTRR表达在临床样本进行免疫组织化学染色的部分孤立的从10摄氏度,良性肿瘤患者10摄氏度,10个病人与正常卵巢。代表染色图所示的例子2。免疫组织化学显示FOLR - DHFR -, MTRR-positive细胞有棕色颗粒在细胞质中。FOLR1 MTRR和温和的OC组织强有力的表达,而DHFR证明很少或没有在OC组织免疫反应性(数据没有显示)。

3.2。表达FOLR、DHFR MTRR卵巢样品中与临床病理的特点

FOLR的表达的相关性,DHFR MTRR各种临床变量中列出表2。结果表明,FOLR和MTRR蛋白质的表达没有与网膜转移和腹水。然而,DHFR的表达与网膜转移和结果显著相关( ,分别)。

3.3。的诊断疗效FOLR、DHFR MTRR

ROC曲线分析评估的诊断准确性FOLR, DHFR, MTRR。ROC曲线分析显示,当最优截止值的FOLR DHFR, MTRR分别为3.855,0.185,和1.425,分别曲线下的面积(AUC)值为0.723(95%置信区间:0.606—-0.840, ;敏感性= 88.20%,特异性= 55.20%),0.717(95%可信区间:0.597 - -0.837, ;敏感性= 69.00%,特异性= 62.70%),和0.714(95%置信区间:0.594—-0.833, ;敏感性= 44.80%,特异性= 92.20%),分别为(图3)。在下一步中,我们进一步探讨FOLR的结合,是否DHFR, MTRR大大提高了诊断效率(AUC 0.864, 95%置信区间CI: 0.777 - -0.951, ;图3)。FOLR敏感性、特异性和准确性,DHFR, MTRR和组合(FOLR + DHFR + MTRR)区分platinum-resistant OC患者从platinum-sensitive控制表进行了总结3。结果表明,联合治疗组有更高的敏感性和特异性。总之,这些结果表明,蛋白质FOLR DHFR, MTRR潜在意义对诊断的敏感性和特异性platinum-resistant OC。

3.4。FOLR的表达之间的相关性、DHFR MTRR

FOLR、DHFR MTRR和coexpressed位于细胞质的OC组织(图2)。FOLR的表达之间的相关分析,DHFR, MTRR OC组织总结在表中4。结果表明,积极MTRR表达式与积极FOLR1显著相关,DHFR表达式( 和< 0.01,分别)。积极FOLR1之间的相关性被发现和积极DHFR ( )。

3.5。Cox比例风险度之间的回归模型与操作系统相关的风险因素的病人

单变量和多变量分析的结果提出了在桌子上5。组织学、节点状态、网膜转移器官转移,FOLR1, DHFR不是OC患者的预后的重要预测因素由单变量分析( )。然而,菲戈阶段,等级、腹水、铂电阻,高表达的MTRR OC患者的预后的重要预测因素( ,表5)。多变量Cox分析的操作系统,菲戈阶段,年级,腹水,铂电阻和高表达MTRR没有独立的预测OC患者的预后的危险因素( )。

3.6。生存分析和预后意义的表达FOLR, DHFR, MTRR

建立生存曲线,FOLR1不断表达水平,DHFR, MTRR和转化为二分变量,使用ROC曲线分析的截止值作为阈值,分别。kaplan meier法分析操作系统的时候80 OC患者之间的高表达和低表达FOLR, DHFR, MTRR。如数据所示4(一)和4 (b)患者,OC不同操作系统时间不能区分FOLR1或独自DHFR ( )。然而,MTRR更敏感的预测预后OC组的患者( ,图4 (c))。此外,OC患者生存时间的中位数低( )和高( )分别的MTRR 40和19个月。

4所示。讨论

叶酸代谢途径由一个周期由FOLR1 DHFR, MTRR(图5)。异常的启动子甲基化与OC预后不良的发展或临床严重性几种癌症类型,包括铂电阻(8- - - - - -10]。我们的研究结果表明,异常叶酸代谢途径可以提供优势的铂电阻和扩散OC。

FOLR1过表达在多种上皮恶性肿瘤(11- - - - - -14]。一些研究开发,血清FOLR1是卵巢癌生物标记与影响诊断,预后和预测OC (11,15,16]。歌等人表明,抑制FOLR1逆转耐紫杉醇在鼻咽癌细胞株(17]。此外,在神经内分泌肿瘤,低FOLR1表达式也被确定为一个更具攻击性的标志和相关的操作系统和PFS(较短18]。在这项研究中,我们发现FOLR1在OC调节组织与正常卵巢组织和良性卵巢肿瘤。然而,高水平的FOLR1短不相关操作系统的OC的病人。

干扰DHFR的表达方式在改善药物动力学和逆转耐药OC (19,20.]。在非小细胞肺癌、骨肉瘤、淋巴细胞白血病,DHFR表达式或多态性也一直与敏感性相关耐药(21- - - - - -24]。此外,非小细胞肺癌患者低DHFR表达式有一个更长的平均PFS和OS与更高的患者相比DHFR表达式。然而,差异无统计学意义(25]。我们的数据也表明,过度的OC DHFR与铂电阻有关。同样,过度OC DHFR较短的操作系统无关的病人。

MTRR (rs1801394)与许多癌症26- - - - - -28]。但是早期的研究报道之间没有明显的联系MTRR基因的多态性和卵巢癌风险(29日- - - - - -31日]。在我们之前的研究7),我们发现MTRR与顺铂耐药性的过度表达,也许因为诱导的细胞凋亡,减少在OC细胞自噬。在这项研究中,MTRR OC患者的临床结果的实际影响仍然非常稀缺和不完整的。在这项研究中,我们证实的存在增加了MTRR表达在大多数我们platinum-resistant病人。操作系统之间的差异被发现患者高低MTRR表达式。

我们的研究结果表明,合并后的ROC分析发现歧视的AUC值0.832 platinum-resistant患者platinum-sensitive病人。这种分析提供了一个有效的信息组合预测方法的耐药性。据我们所知,这是第一个报告显示铂电阻之间的关系和表达的三个叶酸代谢酶在OC。

需要提出了本研究的局限性。首先是缺乏其他类型的组织学疾病和一个小样本量的OC患者,这可能导致缺乏力量和随之而来的不精确。第二,虽然三种叶酸代谢酶的生物功能已经被先前的基因功能分析,推断出背后的机制这三个叶酸代谢酶的预测值OC仍不清楚,和它们的功能角色应该在实验研究中进一步探讨。

总之,FOLR1的评价,DHFR, MTRR表达可能为医生提供有用的信息做出最佳的临床决策。MTRR是更好的为确定OC的预后因素。结合这三个酶诊断的识别可能导致患者可能发展为化疗抵抗和OC小说可能是一个潜在的目标治疗,这需要进一步的分析验证研究。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的发现可以从相应的作者。

的利益冲突

我们声明我们没有财务或个人关系与他人或组织不当会影响我们的工作和没有专业或其他个人兴趣任何性质的任何产品,服务,和/或公司可能被视为影响手稿。

确认

这项研究是由中国国家自然科学基金(81572579)和广西自然科学基金(2018号gxnsfba138048)和广西中年教师的基本能力改进项目院校(2018号ky0124)。

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