GTSE1, CDC20、PCNA和MCM6协同影响细胞周期规定,表明在肝癌预后不良

文摘

GTSE1也与肿瘤恶化;然而,其对肝癌预后的作用。通过分析肝细胞癌(HCC)的数据集在地理和TCGA数据库,我们表明,高表达的GTSE1与先进的病理阶段和肝细胞癌患者的不良预后。调查潜在的分子机制,我们生成GTSE1击倒肝癌细胞系和探索GTSE1缺乏症在细胞生长的影响。GTSE1击倒和野生型肝癌细胞之间,我们确定了979个差异表达基因(520基因表达下调和459年调节)基因表达芯片分析的分析。功能性浓缩度的分析表明,S期没有GTSE1表达特异表达,流式细胞仪分析进一步验证。此外,其他三个度:CDC20、PCNA和MCM6还发现导致GTSE1-related细胞周期阻滞和与贫穷有关肝癌患者的总体生存。CDC20一起,总之,GTSE1 PCNA,和MCM6,可能表现为协同作用促进肝癌的预后不良通过激活细胞周期。基因像GTSE1 CDC20、PCNA和MCM6可能承诺在肝癌预后的分子生物标志物。

1。介绍

肝癌是最常见的原因之一,世界各地的癌症死亡率。Hepatocarcinogenesis经常与基因失调有关,这可能是受风险因素包括肝炎病毒感染,有毒的曝光,饮酒,和肥胖1]。由于诊断和外科技术的进步,最近一直在观察改善患者的结果。然而,缺乏有效的预后指标大大限制了整体存活率。因此,识别预后标记对提高肝癌治疗至关重要。

GTSE1p53-inducible基因映射到染色体22 q13.2-q13.3表达明确在G2和S期细胞周期的2,3]。GTSE1蛋白主要定位在微管,调节微管动力学通过抑制微管解聚酶MCAK,染色体稳定性的关键,准确对齐,和隔离4]。除此之外,它还调节细胞质p53的本地化特征核质穿梭能力(5]。DNA损伤后,GTSE1 G2检查点恢复需要通过调节p53本地化,稳定,和功能(6,7]。在正常的条件下,GTSE1由功能激活p53绑定的吗GTSE1启动子区域和编码GTSE1蛋白质从G2 M过渡导致延迟3,8]。最近的研究显示,过度的GTSE1有助于促进细胞增殖,迁移和入侵在不同的癌症通过translocalizing p53细胞质(9,10]。

GTSE1的高表达与乳腺癌患者的总生存期短,膀胱癌、肝癌和/或(9- - - - - -13]。此外,高架GTSE1显著干扰化疗疗效和影响肝细胞癌(HCC)患者的生存概率(9,13]。然而,GTSE1如何与其他细胞相互作用的潜在机制cycle-related基因影响肝癌的预后仍然知之甚少。在这项研究中,我们综合核糖核酸微阵列分析与细胞实验来确定GTSE1在肝癌预后的作用,发现其他三个细胞差异表达基因cycle-related GTSE1击倒后可以应用在预测肝癌的预后。

2。材料和方法

2.1。生物信息学分析

RNA-Seq数据和临床数据从TCGA-LIHC下载数据集。LinkedOmics [14)是用于分析GTSE1表达式之间的关系和临床因素和MCM6表达水平之间的相关性,PCNA, CDC20, GTSE1。卡方测试GTSE1表达和临床因素之间进行。HCCDB数据库(15)(http://lifeome.net/database/hccdb)是用于分析GTSE1功能,MCM, PCNA, CDC20基因在肝癌患者的预后kaplan meier绘图仪。基因和基因组的京都百科全书(KEGG)和基因本体论(去)通路富集分析使用大卫(执行数据库进行注释、可视化和一体化的发现;https://david.abcc.ncifcrf.gov/)。字符串(11.0版)是用于执行GTSE1的蛋白质相互作用网络分析,MCM6, PCNA, CDC20,它提供了许多coexpression联合评估,实验/生化数据,并在策划协会数据库和comentioned PubMed抽象。

2.2。建设有效的针对GTSE1 Lentiviral-Mediated RNAi

小核RNA)目标站点(psc34526: CTACTCCTACAAATCAATT;psc34528: GCGAGATTCCTGTCTAAAT)设计对GTSE1基因(智人G2和S期表示1,信使rna;NCBI的参考序列:NM_016426)。双链DNA寡核苷酸被合成基于短发卡RNA(成分)干扰序列和subcloned慢病毒质粒克隆GV115向量在全球名列细胞(Tiangen,中国)。慢病毒从293 T细胞,cotransfected重组质粒,pHelper1.0 pHelper2.0。病毒效价是由荧光方法。此外,慢病毒载体与争夺插入序列(TTCTCCGAACGTGTCACGT)同时准备作为一个负控制(shCtrl)。

2.3。细胞和细胞培养

人类肝癌细胞bel - 7404用于研究。在罗斯威尔公园纪念研究所1640培养基培养细胞,并配以胎牛血清(的边后卫,Ausbian,澳大利亚)和5μg / mL嘌呤霉素(美国Clontech)。bel - 7404细胞维持在37°C公司为5%₂。

2.4。转染和实时qPCR

对GTSE1 shRNA慢病毒转染成bel - 7404细胞使用聚凝胺和增强感染(埃尼集团的解决方案。年代,GeneChem,中国)按照标准程序。72 h后,细胞转染lentiviral-mediated shRNA收获,和GTSE1击倒效率检查在mRNA水平用实时定量聚合酶链反应(存在)。总RNA提取试剂盒试剂(Pufei,中国),转换为互补脱氧核糖核酸与M-MLV逆转录酶酶(美国Promega),并测量与豆类SYBR大师混合物工具包(豆类、日本)一个MX3000p实时PCR系统(美国安捷伦)。规范化的表达GTSE1, GAPDH是用作内部控制。一个2^−ΔΔCT方法被用来计算相对mRNA水平。三实验进行。

2.5。西方墨点法

总蛋白提取与2 x裂解缓冲区,通过sds - page分离,并转移到PVDF膜electroblotting设备(Bio-Rad,里士满,CA)。膜被TBST解决方案包含5%脱脂牛奶在室温下1 h。膜然后用鼠标Anti-Flag孵化(Sigma-Aldrich 1: 2000年,美国)和鼠标anti-GAPDH(圣克鲁斯1:5000年,美国)。然后膜清洗三次TBST孵化和山羊Anti-Mouse免疫球蛋白(圣克鲁斯1:2000年,美国)在室温下2 h。蛋白质乐队是由x射线成像可视化与皮尔斯™ECL免疫印迹基质工具包(美国热费希尔科学)。

2.6。板与粘附细胞分析血细胞计数Celigo®

细胞转染shRNA慢病毒稳定表达绿色荧光蛋白(GFP),和粘附细胞血细胞计数系统Celigo®允许快速细胞荧光成像和量化表达式(16]。细胞在指数阶段与胰蛋白酶消化(Sangon,中国),resuspended,播种在96孔板。一百毫升水中贝尔- 7404添加到每个在37°C,孵化有限公司5%₂。电镀后,分析了板使用Celigo®配备绿色荧光通道每24小时5天。细胞增殖曲线被绘制基于细胞总数和扩散率(每天/细胞计数细胞计数在第一天)。

2.7。微阵列分析和功能富集分析

执行总RNA提取试剂盒试剂(Pufei,中国)根据标准程序。样本选择的微阵列分析必须符合以下要求: (热NanoDrop 2000), ,和 (安捷伦2100生物分析仪)。aRNA(放大RNA)然后通过GeneChip获得3行+工具包(Affymetrix)。杂交aRNA和GeneChip®Primeview™人类基因表达与GeneChip数组进行杂交和染色设备清洗。微阵列与GeneChip扫描器读取3000。 和 被设置为截止准则。

2.8。流式细胞仪进行细胞周期分析

细胞被胰蛋白酶化后收获,和细胞悬浮液在冰冷的D-Hanks洗(GeneChem,中国)。那么冰冷的细胞被固定在75%乙醇。流式细胞仪分析,细胞悬液细胞染色处理解决方案( PI: 核糖核酸酶: :10:1000)10分钟在黑暗中在4°C。番石榴easyCyte HT系统(美国微孔)被用来执行细胞周期分析。

2.9。统计分析

这样的所有值 错误的意思。统计测试都是双面的。一个值小于0.05的被认为是具有统计学意义。

3所示。结果

3.1。GTSE1高表达于肝癌与不良预后相关

GTSE1被确认使用生物信息学分析的预后价值。TCGA-LIHC样本分为两组中值的归一化GTSE1表达信号的截断值进行了分析(表1)。GTSE1表达呈正相关,初级阶段肝脏肿瘤( )和明显高于亚洲患者( )。调节GTSE1表达式在肝癌与更高的病理阶段与意义( ),表明GTSE1可能提供有效的预后预测(17]。进一步确定GTSE1表达式在肝癌的预后价值,GTSE1之间的关系表达式和总生存期(OS)在肝细胞癌患者进行了分析基于HCCDB,肝细胞癌表达图谱数据库包含15个公共肝癌表达数据集有4000份临床样本(15]。的预后价值GTSE1研究使用三个数据集:GSE14520 TCGA-LIHC, ICGC-LIRI-JP(图1)。GSE14520是一群在美国64名肝癌患者。癌症基因组图谱肝脏肝细胞癌(TCGA-LIHC)队列是由768名肝癌患者的所有比赛。第三集,肝脏Cancer-RIKEN, JP (ICGC-LIRI-JP),是一群在日本260名肝癌患者。在所有的数据集,肝癌样本分为高/低表达组中值表达式GTSE1(截止log2的价值 )。kaplan meier曲线和生存率较表示,高或低水平的GTSE1表达式代表显著不同的在所有3肝癌预后的数据集:GSE14520 ( ,图1(一)),TCGA-LIHC ( ,图1 (b))和ICGC-LIRI-JP ( ,图1 (c))。ICGC-LIRI-JP, OS的患者高GTSE1表达明显降低相比,那些低GTSE1表达式。

3.2。缺乏GTSE1抑制人肝癌细胞增殖

调查GTSE1在肝癌细胞功能,GTSE1撞倒在肝癌细胞株bel - 7404使用lentiviral-mediated成分。两种成分链,psc34526 psc34528,更好的GTSE1沉默性能设计和测试(补充表1)。超过80%的细胞在psc34526和psc34528组GFP阳性,表明感染后72 h转染效率(补充图1)。减少表达GTSE1 bel - 7404细胞在mRNA水平( )和蛋白质水平( )验证使用实时定量聚合酶链反应和免疫印迹,分别(数据吗2(一个)和2 (b))。psc34526的可拆卸的效率(87.8%)和psc34528(88.2%)可比性,因此链都是应用于进一步化验除了额外的说明(补充表2)。

bel - 7404细胞的细胞功能与GTSE1击倒(psc34526和psc34528)比较与细胞转染与扩散控制链,转移,入侵,细胞凋亡水平。培养细胞成像,计算基于GFP荧光(图5天2 (c))。细胞增殖率在60 - 70%抑制( )与对照组相比,扩散曲线(图所示2 (d)和2 (e)),这也验证了使用MTT试验(补充图2)。此外,GTSE1击倒bel - 7404细胞表现出较低的转移率(补充表3)和降低入侵利率(补充表4)。他们的集落形成能力降低(补充图3)。同时,细胞凋亡百分率和caspase3/7 shGTSE1组活动增加(补充图4)。总之,bel - 7404细胞与GTSE1击倒表现出更少的癌细胞的特征。

3.3。979度中确定人类肝癌细胞GTSE1击倒

转录组分析表明,bel - 7404细胞之间GTSE1击倒(shGTSE1 psc34526, psc34528)和对照组(shCtrl),确定了979个基因差异表达基因( , )shgtse1 - bel - 7404,包括459个激活基因和520年压抑的基因。功能特征的识别度使用KEGG通路分析表明p53信号通路富集度,谷胱甘肽代谢,蛋白质在内质网(图处理3(一个))。去分析下蜂窝组件(CC)和生物进步(BP)度数据所示3 (b)和3 (c)。在CC,识别度可以通过面上细胞器,胞内面上细胞器和细胞外囊泡。最显著地丰富度的BP蛋白质代谢过程、生物过程的监管,组织和细胞成分。

3.4。细胞周期失调GTSE1击倒人类肝癌细胞的验证

一个功能富集分析交互网络(图4(一))显示,14度标记红色的是参与细胞cycle-related通路。六人主要分布在S期的细胞分裂(MCM6, PCNA、Mdm2 GADD45A, Cip1,和CDK2)和调节在shGTSE1细胞(图4 (b))。这些度在细胞周期的影响评估通过流式细胞仪shCtrl和shGTSE1细胞。细胞周期分析的完整的数据提供了补充表5。如数据所示4 (b)和4 (c)shGTSE1细胞(psc34526和psc34528)在S期显著降低( , )在G2 / M期细胞停滞和G1期( )与shCtrl组相比,都符合期望基于交互网络。因此,GTSE1击倒G1-to-S或S-to-G2过渡细胞周期的影响。

3.5。额外GTSE1-Interacted度是与肝癌的预后有关

Coexpression水平的三个细胞cycle-related度(MCM6、CDC20和PCNA)和GTSE1进行评估。基于TCGA-LIHC数据集和LinkedOmics,皮尔森的两两相关性肝癌患者(图绘制5(a))。MCM6的信使rna表达水平,CDC20和PCNA均呈正相关,GTSE1(皮尔森的相关性 ,分别为0.8722和0.5828),这表明三度与GTSE1可能有协同效应。三度的表达水平与GTSE1 CDC20是最重要的一个相关。

调查可能的四种基因之间的相关性,蛋白质相互作用网络(图5(b)) GTSE1、MCM6 CDC20,用绳子和PCNA建成。PPI的浓缩网络的价值是0.00304,这意味着至少四个蛋白质部分生物连接作为一个组。DEG-transcribed蛋白质、CDC20之间的分数和GTSE1最高,建议最重要的功能链接。CDC20之间的交互、MCM6和PCNA与实验确定。因此,GTSE1可能影响细胞周期进展与CDC20协同,MCM6和PCNA。

MCM6、CDC20和PCNA也与肝癌的预后相关。样本分为高表达组和低表达组中表达水平的MCM6, CDC20,和PCNA在三个数据集从HCCDB数据库(图9.53,8.15,和10.79,分别)。高患者MCM6(图5(c)), CDC20(图5增殖细胞核抗原(图(d)),或5(e))蛋白表达了不利预后与GTSE1图是相一致的1。

4所示。讨论

GTSE1 microtubule-localized细胞cycle-related蛋白质。它调节微管稳定通过抑制MCAK(有丝分裂centromere-associated驱动蛋白),有效的解聚酶的活动。它还p21调节^{CIP1 / WAF1}稳定的表达是至关重要的细胞周期控制(18]。尽管先前的研究已经证明了GTSE1在各种癌症的预后价值,其在肝癌的潜在机制仍有待特征。在这项研究中,我们生成GTSE1击倒肝癌细胞和微阵列进行分析。979度被确定,他们从事p53信号通路和蛋白质在内质网处理,面上器官、组织和细胞成分。

三个细胞cycle-related度(CDC20,PCNA,MCM6)明显coexpressedGTSE1,而且他们可能表现为协同作用影响细胞周期的规定。细胞分裂周期20同族体(CDC20)是一个重要的辅助因子控制染色体隔离和有丝分裂退出(19]。GTSE1相似,它调节稳定性的磷酸化MCAK metaphase-anaphase过渡(20.]。增殖细胞核抗原(PCNA)是一个36 kDa蛋白质,它与人类的DNA聚合酶δ在DNA复制和DNA修复(21- - - - - -23]。它配合p21在细胞周期22]。因此,GTSE-1可能调解p21保护的稳定微管,然后一起p21 DNA-bound PCNA参与DNA修复。MCM家族股份在真核基因组复制通过功能的解旋酶复制伸长(24]。GTSE1结合到微管左端的跟踪蛋白质EB1癌症(11)和调节微管稳定准确的染色体定位和隔离4]。微管不稳定将直接绑定到minichromosome 12 (MIS12)所需的核心蛋白质保持结构完整性有丝分裂着丝粒的25]。因此,GTSE1可能会联合行动与MCM中介姐姐动粒减数分裂的凝聚力。以往的经验显示,阻止细胞周期蛋白依赖性激酶招募MCM染色质会导致中心体overduplication没有通过有丝分裂(26]。中心体是microtubule-assembly中心,GTSE1可能调节centrosomal微管形成一个MCAK-dependent方式。

GTSE1,连同CDC20、PCNA和MCM,提出不宜肝癌的预后研究。新兴证据显示异常表达的基因在细胞周期和细胞凋亡的规定,像p53, Rb, p27、TGFβ/ IGF2R,肝癌患者的发病机理及预后有关(1]。GTSE1已经证明是一个可怜的临床结果的潜在生物标志物在几种类型的癌症10,13,27]。先前的研究表明GTSE1在肝细胞癌(HCC)增殖的功能作用,集落形成、入侵和总生存期(9,13]。在我们的研究中,度在GTSE1击倒肝癌细胞在肿瘤形成的关键步骤包括细胞周期特异表达和无限的细胞生长,这可能解释癌症预后不良。

除了GTSE1, CDC20的过度表达,PCNA和MCM中已发现了多种人类癌症(28- - - - - -30.]。MCM的家庭,MCM2的异常表达,MCM3, MCM4, MCM5和MCM7也导致减少肝癌病人预后根据HCCDB数据库(15]。minichromosome维护蛋白(MCM)家庭是涉及的控制真核基因组复制和被证明是有用的标记肿瘤扩散(24]。几项研究表明过度MCM6也预测可怜的几种类型的癌症患者的生存期,包括肝细胞癌(31日- - - - - -34]。未来的研究应该试图澄清的底层机制一起GTSE1 minichromosome-related protein-mediated DNA复制和癌症的预后。

5。结论

本研究的目的是阐明GTSE1的角色在肝癌的预后和肝癌找到潜在的预后指标。在这项研究中,我们发现,增加GTSE1表达了先进的病理阶段和肝癌患者的预后不良。与之前的研究一致,表达下调GTSE1验证了导致减少细胞增殖和细胞周期阻滞。此外,979个基因与细胞组件组织和生物过程调控与GTSE1击倒差异表达。度,CDC20、PCNA和MCM6可能表现为协同作用影响细胞周期规定GTSE1和可能潜在的预后预测肝癌。我们的研究为肝癌的分子机制提供了一个宝贵的资源发展和预后的预测。未来的研究验证底层肝癌肿瘤发生和预后的分子机制可能强调GTSE1和minichromosome维护蛋白质之间的关系(MCM)的家庭。

数据可用性

本研究的数据集分析中可以发现HCCDB数据库(http://lifeome.net/database/hccdb)。表达数据的GTSE1击倒肝癌细胞株bel - 7404是可用的https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE130083。

的利益冲突

作者声明,这项研究是在没有进行任何商业或财务关系可能被视为一个潜在的利益冲突。

作者的贡献

永昌郑、岳史和Si Yu贡献同样这项工作。

确认

这项研究是由北京市科委研究基金会(没有。Z171100000417004),北京自然科学基金(没有。L172055),国家博士后创新人才项目(没有。BX201600087),国家科学基金会中国(31871343)、贵州和关键技术的研究和发展计划科学技术厅项目(批准号[2019]2793)。

补充材料

补充图1:图像bel - 7404细胞转染的成分对GTSE1慢病毒。(一)转染psc34526的形象。(B)转染psc34528的形象。超过80%的细胞在shGTSE1 (psc34526)和shGTSE1 (psc34528)组织被感染后转染后72小时。补充图2:MTT测定细胞增长率来衡量。(一)吸收值和相对褶皱的变化shCtrl和shGTSE1 (psc34526)在490海里。(B)吸收值和相对褶皱的变化shCtrl和shGTSE1 (psc34528)在490海里。A和B, OD 490代表活细胞的数量。给出的数据 。GAPDH作为内生控制。补充图3:bel - 7404细胞的集落形成GTSE1击倒。(一)形象和殖民地数量评估shGTSE1 (psc34526)。(B)形象和殖民地数量评估shGTSE1 (psc34528)。对于A和B,给出的数据 。 与shCtrl。GAPDH作为内生控制。补充图4:细胞凋亡测定和caspase3/7化验的结果。(一)细胞凋亡的比例shGTSE1 (psc34526) shGTSE1 (psc34526)和shCtrl RNAi转染后5天。(B) Caspase3/7活动之间shGTSE1 (psc34526) shGTSE1 (psc34526)和shCtrl RNAi转染后5天。对于A和B,给出的数据 。 和 与shCtrl。GAPDH作为内生控制。补充表1:序列的shRNA GTSE1补充表2:针对GTSE1 shRNA击倒的效率。补充表3:细胞计数transwell化验(200 x)。补充表4:细胞计数的入侵检测(200 x)。补充表5:细胞周期分析的数据。(补充材料)

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