液体活检在罕见的癌症:教训血管外皮细胞瘤

文摘

血管外皮细胞瘤(HPT)是一种罕见的肿瘤间质成纤维细胞的类型和罕见的研究甚少。最常见的网站转移性疾病患者的颅内HPT骨、肝、肺,暗示一个血性的传播;出于这个原因,我们调查,第一次循环肿瘤细胞的存在(ctc)血管外皮细胞瘤病人CellSearch®和SceenCell®设备。外周血样本被CellSearch绘制和加工,一个EpCAM-dependent装置,和ScreenCell®,设备大小的基础。我们发现历史进程执行由CellSearch CTC系统和免疫荧光分析在CTC隔离ScreenCell证明单CTC和CTC集群的存在。单一的分子表征CTC和CTC集群,利用抗体针对EpCAM, CD34,细胞角蛋白(8、18和19),和CD45,显示一个伟大的异质性在CTC集群。我们认为,目前的研究可能会打开一个新场景的罕见肿瘤:液体活检和循环肿瘤细胞的分子特征可能导致个性化的靶向治疗和罕见的肿瘤。

1。介绍

血管外皮细胞瘤(HPT)是一种罕见的肿瘤间质成纤维细胞的类型(1]。尽管最初认为起源于血管周(2),绝对精确的组织发生尚未建立。仅从临床的角度来看,HPT代表不可预知的疾病,自遥远的复发通常延迟后的数十年,甚至可能发生的主要肿瘤的诊断(3),这表明一个强烈需要长期随访4]。目前为止也由于是有限的治疗临床前和临床研究项目经费不足,和新策略是必需的,以便早期发现肿瘤复发和转移,从而提高诊断、治疗和监测的患者。最常见的网站转移性疾病患者的颅内HPT骨、肝、肺,暗示一个血性的传播(5]。循环肿瘤细胞(ctc)代表了一种独特的信息血液播散的肿瘤,被认为是一个有用的工具在新临床相关的生物标记物的鉴定6]。虽然ctc主要通过上皮癌隔绝antigen-targeted抗体(EpCAM)报告显示,EpCAM表达并不局限于epithelial-derived肿瘤,但共享的ctc孤立mesenchymal-derived癌症患者(7]。在目前的研究中,我们试图探讨可行性孤立ctc从二次肝血管外皮细胞瘤患者使用CellSearch系统,fda唯一批准的ctc枚举。CellSearch捕获细胞使用特定于EpCAM单克隆抗体和标识使用微分ctc荧光抗体检测细胞角蛋白的存在(CK)在核包含完整的细胞和缺乏CD45, ctc的特征(DAPI + / CK + / EpCAM + / CD-45 -)。

2。材料和方法

2.1。循环肿瘤细胞检测

循环肿瘤细胞检测通过两个方法,一个EpCAM-dependent (CellSearch)和其他大小(ScreenCell)。知情同意后外周血样本绘制成两个管,丢弃后第一个毫升避免与皮肤的上皮细胞污染采样期间采取的针。7.5毫升的血液收集CellSave防腐管(Menarini硅生物系统,卡斯特尔马焦雷Bo,意大利)和处理CellSearch (Menarini硅生物系统),采用CellSearch CTC装备,根据制造商的指示。6毫升血液收集管包含K₂由ScreenCell EDTA和加工阶段工具包(ScreenCell、Sarcelles、法国)隔离固定细胞的细胞学研究。短暂,为了修复细胞和红细胞溶解,3毫升的血液被稀释4毫升FC2过滤缓冲区(ScreenCell)。8分钟后在室温下孵化7毫升的稀释样本添加到设备舱和过滤压力梯度下使用真空采血管管。洗后用PBS去除红细胞碎片,过滤器被吸收纸上在室温下晾干,然后储存在−20°C。过滤是一式两份,在3分钟内完成。

2.2。免疫荧光分析ctc

免疫荧光,非特异性蛋白质绑定被5%正常山羊血清。标本permeabilized PBS-Tween 20 (PBS-T) 20分钟。

协议1:过滤器首先是孵化一夜之间在4°C主要鼠单克隆anti-EpCAM (VU1D9;1:50;英杰公司有限公司,佩斯利,英国)抗体,然后与PBS-T洗两次后,探讨1 h和antimouse alexafluor - 488二级抗体(1:50,英杰公司)。接下来,部分是孵化一夜之间在4°C藻红蛋白染色的解决方案——(PE)共轭细胞角蛋白(CK) 8、18、19和allophycocyanin——(APC)共轭CD45抗体(CellSearch CTC工具包)。核与4复染色 ,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)。

协议2:过滤器首先是孵化一夜之间在4°C主要鼠单克隆anti-EpCAM和兔多克隆anti-CD45 (1: 50;细胞信号技术,丹弗斯,妈,美国)的抗体,然后与PBS-T洗两次后,探讨1 h和antimouse alexafluor - 350和antirabbit alexafluor - 594 (1: 50;英杰公司)二级抗体。接下来,部分是孵化一夜之间在4°C CD34第三类/ FITC (Dako北美公司,Carpinteria、钙、美国)。最后,标本与DRAQ5复染色(细胞信号技术),细胞渗透性的红光对于DNA荧光染料,细胞核的可视化。

所有主要的抗体稀释在PBS-T 1%的牛血清白蛋白。

过滤器被数字扫描仪扫描(Aperio ScanScope FL系统,Aperio技术,Inc .,牛津大学,英国),还分析了共焦显微镜(徕卡TCS-SP2)。

CTC集群被定义为组的CTC包含根据以前的出版物(≥3不同的核8]。在代表图像,不同的伪彩色被任意分配,无关地实际的荧光团,的四个荧光通道和改变了可视化优化不同的信号。当图像中显示,核总是用蓝色显示。

3所示。结果与讨论

间质血管外皮细胞瘤的性质,我们未能发现典型epithelial-like ctc,但我们能够识别5 DAPI + / EpCAM + / CK - / CD45事件,这可能与nonepithelial特性的细胞。根据CellSearch指南,所有对象没有明确的细胞角蛋白染色被定义为“可疑对象。“类似事件之前被我们组有预后意义在其他癌症,如肾细胞癌,经常缺乏细胞角蛋白表达(9]。为了更好地描述这些非典型ctc,我们处理一个血液样本通过使用ScreenCell,一个设备,允许size-selective ctc从其他血细胞的分离。评估分子的非典型ctc,免疫荧光染色法进行从病人的血液,获得两个过滤器使用在第一个相同的抗体用于CellSearch系统(EpCAM、CK和CD-45 ctc的定义特征)和第二个CD34(血管外皮细胞瘤特定标记)(图1)[10,11]。在检查过滤器,单个或集群ctc是识别和观察平均一个集群过滤器。ctc不定地轮或拉长,提出核胞浆比例高,胞,一个椭圆形的细胞核。在检查过滤器,单一和集群ctc EpCAM但不利于CD45阳性被发现。EpCAM表达在细胞表面局部在单个细胞,但保留在内部集群的一部分。在集群表面可以解释缺乏EpCAM CellSearch未能检测CTC集群,已经证明在epithelial-like肿瘤,如nonsmall细胞肺癌(12]。EpCAM-positive集群不定地表达CK但经常负面CD45和CD34阳性。一些研究表明,CTC集群是由许多肿瘤细胞混合nontumor细胞如间充质细胞,上皮细胞,免疫细胞,血小板,周围的周和癌症相关的成纤维细胞13]。在我们的病人,coexpression EpCAM, CK, CD34在CTC集群中证实了伟大的异质性CTC集群及其多方面的专利组合。液体活检的可行性的一种罕见的肿瘤,如HPC,可能有几个重要的临床意义。首先,多数颅内脑膜手持电脑类似脑膜瘤的临床表现和组织学特性,因此可能误诊,尽管重要的预后差异(14]。保持扫描和跟踪的工具,如抽血,可能会不同。第二,系统性治疗HPC的选择有限,因为越来越多的靶向治疗,独特的ctc的分子特征有可能转化为个性化治疗(15]。这个目的,临床试验罕见癌症通常不执行由于小数量的符合条件的患者,而更常见的癌症根据biomarker-driven越来越接受治疗的方法,“一刀切”的方法仍然是标准的照顾罕见的肿瘤。个性化针对性治疗需要开发专门为血管外皮细胞瘤以及所有其他罕见的癌症,和液体活检无疑正确的凭证来促进这一过程。

的利益冲突

作者没有利益冲突的声明。

作者的贡献

Paola Gazzaniga和沃尔特·詹尼·贡献了同样的工作。

确认

这项工作被A.R.Ger.On支持。Onlus。

引用

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