第三类β微管蛋白过度导致药物抗性Eribulin平滑肌肉瘤细胞系

文摘

Eribulin是一种新的药物治疗软组织肉瘤(STS)绑定到微管施加抗肿瘤活性。STS的预后很差,eribulin有望提高治疗效果。我们观察到几个病例,表现出抗eribulin和开发了一个eribulin-resistant平滑肌肉瘤细胞系对耐药性的机制进行调查。eribulin的IC50 125倍比父母的细胞系,耐药细胞系和eribulin没有导致耐药细胞G2 / M逮捕。耐药细胞株显示增加表达凋亡成绩单,但蛋白质含量和功能分析结果类似于父母的细胞系。我们发现第三类β微管蛋白(TUBB3)耐药细胞系中,和TUBB3 siRNA可拆卸的部分恢复eribulin敏感性。TUBB3表达式在临床样本不同,这表明TUBB3有潜力成为抗癌药物的选择及生物标志物可能克服eribulin阻力的一个目标。

1。介绍

高档恶性软组织肉瘤的预后(STS)因深舱是可怜的,因为高频率的远处转移。为了提高高档STS的预后,全身化疗是必要的;然而,很少有药物目前STS (1]。Eribulin,下模拟从海洋中提取海绵Halichondria okadai(2),是一种新的药物最近批准治疗STS (3]。Eribulin发挥抗肿瘤活性抑制肿瘤细胞的微管和适当的微管聚合,导致G2 / M逮捕的细胞周期,导致细胞凋亡4]。

非随机、多中心三期试验(5],eribulin显示患者临床疗效复发恶性STS此前曾接受至少两个方案,包括一个蒽环霉素药物。审判招收了452名患者平滑肌肉瘤( ,65.7%)、脂肪肉瘤( 33.8%),和其他肉瘤( ,0.4%)。Eribulin显著延长总生存期(OAS)与达卡巴嗪(Eribulin集团美洲国家组织中位数为13.5个月和11.5个月达卡巴嗪组, )。值得注意的是,eribulin显示优越的功效等特殊的组织学亚型的平滑肌肉瘤和脂肪肉瘤,这结果是后续临床试验证实了(6]。

平滑肌肉瘤肿瘤由纺锤状细胞和一个相交成束的增长模式和被认为源于平滑肌细胞。与其他STSs一样,根深蒂固的平滑肌肉瘤的预后很差,eribulin将是一个很有前途的药物。然而,我们观察到的几例平滑肌肉瘤显示eribulin阻力。在这项研究中,我们开发了一个eribulin-resistant平滑肌肉瘤细胞系调查机制抵抗。

2。材料和方法

2.1。细胞系和文化条件

人类SK-LMS-1平滑肌肉瘤细胞系获得写明ATCC®(htb - 88™,马纳萨斯,弗吉尼亚州,美国)和维护在杜尔贝科修改鹰的介质(DMEM热费希尔科学,沃尔瑟姆,马萨诸塞州,美国)补充10%胎牛血清(美国UT HyClone实验室、洛根),青霉素100单位/毫升和100μg / ml链霉素在37°C的氛围中5%的股份有限公司₂。

2.2。建立耐药SK-LMS-1细胞

Eribulin甲磺酸(新药Halaven®)购买的卫材(日本筑波)。耐药SK-LMS-1细胞由选择eribulin的存在。Eribulin浓度逐步从0.5提高到100纳米。Eribulin-resistant SK-LMS-1细胞条件培养液中维护100海里eribulin。

2.3。化学敏感性分析和倍增时间测量

父母和耐药SK-LMS-1细胞被播种到96孔板的密度2×10³细胞每口井。孵化后24小时内,各种eribulin浓度(0、0.1、0.5、1、5、10和100海里),长春花碱(0、1、5、10、50、100和1000海里),紫杉醇(0、0.1、0.5、1、5、10和100海里),和阿霉素(0,100,500,1000,5000,和10000海里)被添加到媒体。经过48小时的孵化与药物、可行的细胞的数量在每个测量使用CellTiter-Glo™发光细胞生存能力分析(WI Promega,麦迪逊,美国)。在化学敏感性试验之前,eribulin-resistant SK-LMS-1细胞保持没有eribulin 10天。的化学敏感性分析进行了一式三份。

父母、耐药和回复突变体SK-LMS-1细胞被播种到96孔板的密度2×10³细胞每口井。后1、24和48小时的潜伏期,可行的细胞的数量在每个测量使用CellTiter-Glo发光细胞的可行性分析。

2.4。定量聚合酶链反应

RNA提取使用RNeasy迷你包(试剂盒、希尔登,德国)和反向转录PrimeScript™RT试剂盒(豆类生物,Kusatsu、志贺、日本)。实时定量PCR进行LightCycler 1.5(完美的实时,豆类生物、Kusatsu志贺,日本),前面描述的条件下(7]。以下引物被使用:TUBB1(转发:5-CCCCATACATACCTTGAGGCGA-3和反向:5-GCCAAAAGGACCTGAGCGAA-3),TUBB3(转发:5-ATGCGGGAGATCGTGCACAT-3和反向:5-CCCCTGAGCGGACCATGT-3),TUBB4(转发:5-GCTGTTTGTCTACTTCCTCCTGCT-3和反向:5-CAGTTGTTCCCAGCACCACTCT-3)和TUBB5(转发:5-CGGGGAGGAAGCTTTTGAGGAT-3和反向:5-CTGGGTAGAACCCGCAATTCTCT-3)。数据标准化使用GAPDH作为看家基因。试验进行了一式三份,三个独立的实验进行。

2.5。免疫印迹分析

正常和eribulin-resistant SK-LMS-1细胞与冰冷的PBS洗两次,刮,在微型离心机离心管。使用CelLytic M细胞细胞溶解(Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国)蛋白酶抑制剂(完整的™迷你;Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国)和磷酸酶抑制剂(PhosSTOP;罗氏诊断,德国曼海姆)鸡尾酒。免疫印迹分析如前所述[8),用以下主要抗体:TUBB3(1: 100年,克隆TUJ1 BioLegend,圣地亚哥,美国),Pgp(1: 100年,克隆C219,恩佐生命科学、法明岱尔,纽约,美国),β肌动蛋白(MAB1501 1: 1000年,默克密理博,伯灵顿,马萨诸塞州,美国),和GAPDH (D16H11 1: 1000年,细胞信号技术,丹弗斯,质量)。相对强度计算使用每个目标的信号强度比蛋白质和内部控制通过使用CS Analyzer 3.0(阿,阿默斯特,纽约,美国)。

2.6。流式细胞仪细胞周期分析

细胞收获有或没有10或50 nM eribulin孵化在37°C 12小时,用PBS洗净,与70%乙醇固定在4°C 30分钟。细胞被离心机和用PBS洗净,和0.5毫升propidium碘溶液(π/核糖核酸酶,Cosmo生物公司,东京,日本)是补充道。细胞培养在室温下15分钟前分析。改变细胞的分布进行了分析使用BD Accuri™C6流式细胞分析仪(BD生物科学,圣何塞、钙、美国)。对于每一个样本,10000事件被记录。

2.7。TUBB3 siRNA实验

转染的核是根据制造商的协议。

SK-LMS-1细胞系被播种到6-well盘子1×10的密度⁵细胞每一夜之间,在37°C的环境没有抗生素。孵化后,细胞转染TUBB3 siRNA (s20296热费希尔科学,沃尔瑟姆,马萨诸塞州,美国)或负控制核(消声器®选择负控制1号核,热费希尔科学、沃尔瑟姆,马萨诸塞州,美国)使用Lipofectamine®2000(热费希尔科学、沃尔瑟姆,马萨诸塞州,美国)。证实了引入siRNAs定量聚合酶链反应和免疫印迹。转染24小时后,执行的化学敏感性分析是如上所述。

2.8。药物转运体功能分析凋亡

凋亡的功能测试都使用了EFLUXX-ID®绿色多药耐药性分析工具包(美国纽约恩佐生命科学、法明岱尔)。细胞被孵化与FBS-free介质,用PBS, resuspended FBS-free媒介。单细胞悬浮液混合稀释凋亡抑制剂在37°C 5分钟,然后用稀释所有样本都孵化EFLUXX-ID绿色检测试剂37°C 30分钟。孵化后,5μl(碘化propidium立即被添加到所有样品和荧光测量使用BD Accuri C6流式细胞分析仪。

2.9。道德准则

我们所有的工作都是符合赫尔辛基宣言,和实验进行了人类主体的理解和同意。机构审查委员会在福冈九州大学,日本已批准实验(批准文号26 - 224)。

2.10。患者和免疫组织化学

如前所述(执行免疫组织化学染色9]。我们使用的样本软组织平滑肌肉瘤注册文件的解剖病理学系研究生医学科学,九州大学,日本福冈。68个样本的软组织平滑肌肉瘤68例准备免疫组织化学。这些样品已经获得活检标本或手术切除肿瘤。化疗后的样品并不包括在免疫组织化学。所有样品都是固定在10%中性缓冲福尔马林和嵌入在石蜡。deparaffinized二甲苯和脱水后在分级乙醇系列中,部分使用1.0 nM EDTA (Wako纯化学工业,日本大阪)在100°C的微波炉前15分钟被孵化anti-TUBB3单克隆抗体(1:100年,克隆TUJ1 BioLegend,圣地亚哥,美国)在一夜之间在4°C。样本然后孵化Dako设想双重链接System-HRP(美国安捷伦,圣克拉拉,CA),可视化使用diaminobenzidine基质系统(Wako纯化学工业,日本大阪),并与稀释苏木精复染色。

2.11。统计分析

学生的以及用于双官能团的比较。 被认为是具有统计学意义。数据在图给出 偏差(SD)。生存率较用于kaplan meier生存估计平滑肌肉瘤的临床样本。 被认为是具有统计学意义。所有统计分析与统计分析系统(SAS)软件包(JMP专业12个,SAS研究所卡里,数控,美国)。

3所示。结果

3.1。建立Eribulin-Resistant SK-LMS-1细胞系和细胞周期分析

SK-LMS-1细胞受到逐步增加的浓度eribulin最终浓度100海里,和发展eribulin阻力定期确认使用化学敏感性试验。2个月后,一个稳定eribulin-resistant克隆成立,我们证实药物抗性eribulin(图1(一))。我们发现耐药细胞株大约125倍耐eribulin比亲本细胞系(IC50 50 nM和0.42 nM的父母行)(图1(一))。

建议的机制eribulin抗癌活性的抑制微管的生长,从而诱导G2 / M被捕。我们利用流式细胞仪分析eribulin对细胞周期的影响eribulin-resistant和父母SK-LMS-1细胞系。我们发现父母的细胞系由64.4±3.2% G1细胞和20.8±2.7% G2细胞在缺乏eribulin和由23.0±3.8% G1细胞和60.5±3.7% G2在存在10 nM eribulin,表明eribulin诱导G2 / M被捕。69.3±1.4%的耐药细胞系由G1细胞和16.2±0.6% G2细胞在缺乏eribulin和由64.6±3.6% G1细胞和19.2±1.9% G2在存在10 nM eribulin。这些结果说明eribulin不诱导G2 / M逮捕在耐药细胞系(图1 (b))。我们还孵化父母和耐药细胞系的50 nM eribulin和分析每个细胞株的细胞周期。父母的细胞系的细胞G2 eribulin较高的浓度逐渐增加,但这些耐药细胞系的没有增加(图1 (c))。

3.2。Eribulin-Resistant SK-LMS-1细胞系展品抗力移转到其他Microtubule-Interacting但不是蒽环霉素的药物

因为之前的研究报道,TUBB3过度诱导耐药性紫杉烷类等microtubule-interacting药物或长春花alcaloids,我们调查是否eribulin-resistant细胞系表现出抗力移转到其他microtubule-interacting药物和蒽环霉素作为标准治疗肉瘤。根据先前的研究,eribulin-resistant细胞系表现出抗力移转紫杉醇和长春花碱但不是蒽环霉素(图1 (d))。

3.3。表达和功能分析在Eribulin-Resistant细胞凋亡

eribulin阻力增加一个可信的场景表达ATP-dependent药物外排泵22 1 (Pgp)耐药细胞。我们检查了多药耐药性1(凋亡)的表达基因,编码Pgp,父母和耐药细胞系使用定量PCR和评估Pgp蛋白质含量用免疫印迹分析。在定量PCR检测,eribulin-resistant细胞系表现出更高的表达比亲本细胞系凋亡(图2(一个))。然而,我们没有发现显著差异在父母之间的蛋白质含量和eribulin-resistant细胞株(图2 (b))。此外,功能分析的Pgp显示没有显著差异的效率Pgp和父母之间eribulin-resistant细胞系(图2 (c))。总的来说,这些结果表明,Pgp不发挥主导作用的药物抗性eribulin-resistant细胞系。

3.4。改变β微管蛋白表达谱可以诱发SK-LMS-1 Eribulin抵抗细胞

eribulin的主要目标是微管,聚合物组成的α- - -β微管蛋白二聚体。Tubulin-binding药物已知的绑定β微管蛋白,有几个同形像。我们推测表达谱的变化β微管蛋白同形像eribulin可能导致药物抗性。定量PCR检测表明,eribulin-resistant细胞系有显著提高β微管蛋白3 (TUBB3)比亲本细胞系表达,而表达TUBB1没有明显差异,TUBB4或TUBB5(图3(一个))。这个结果证实了免疫印迹(图3 (b))。测试是否抑制TUBB3表达式可能恢复灵敏度eribulin耐药细胞系,我们用siRNA针对TUBB3转染的细胞。我们确认击倒TUBB3使用定量聚合酶链反应和免疫印迹(图3 (c))。重要的是,击倒TUBB3表达导致chemosensitization eribulin耐药细胞系(图3 (d))。这些结果表明,TUBB3过度可能发挥重要作用在药物抗性eribulin耐药细胞系。确定药物抗性是否可逆,我们培养耐药细胞株没有eribulin 4周,建立了“回复突变的细胞,”和监控细胞是否成为敏感药物。回复突变的细胞行保持其化学抗性eribulin 4周后孵化没有eribulin,证明药物抗性不可逆(图3 (e))。

3.5。TUBB3 SK-LMS-1的表达参与了细胞增殖率

我们调查了家长的细胞增殖率,eribulin-resistant细胞和回复突变体。eribulin-resistant细胞和回复突变体出现了轻微的趋势比亲代细胞倍增时间延长;然而,差异不显著(图3 (f))。接下来,我们核抑制TUBB3表达式的父母和耐药细胞系和调查每个细胞增殖率。我们发现,减少TUBB3表达父母和抗平滑肌肉瘤细胞导致细胞增殖率下降的趋势,但差异无统计学意义(数据没有显示)。

3.6。TUBB3的过度表达与临床平滑肌肉瘤预后不良样品

为了检查TUBB3的表达模式在临床样本,我们TUBB3进行免疫组织化学染色。值得注意的是,我们发现TUBB3是变量的表达式,27例68例(39.7%)显示TUBB3的高表达,而其余41例(60.3%)显示低表达的TUBB3(图4(一))。调查与TUBB3表达与预后的关系或细胞生长(MIB-1表达式)在临床样本,我们调查样本的总体生存时间和MIB-1表达我们执行TUBB3的免疫组织化学染色。我们发现高TUBB3与贫穷总生存期(图表达显著相关4 (b)中位总生存时间:低TUBB3组;70个月和高TUBB3组;26个月, 细胞生长(图)和更高4 (c)MIB-1积极比率:低TUBB3组;高28.6±3.9% TUBB3组;40.4±4.8%, )。

此外,我们分析了组织活检样本两个平滑肌肉瘤患者eribulin;一个显示高水平的TUBB3表达式,另一个显示低水平。我们观察到进步TUBB3高表达患者的疾病,而低表达患者TUBB3继续稳定疾病与eribulin初始治疗后12周(图4 (d))。我们也进行免疫组织化学染色的Pgp和调查了Pgp表达在这些临床样本。作为以前的报告(10),我们认识到轻微的Pgp表达式在临床样品,所以我们不能评估任何与Pgp的关系表达式和药物抗性eribulin(补充图。1)。

4所示。讨论

耐药性是肿瘤治疗中最严重的问题之一。由于STS很少有有效的药物,治疗策略STS强烈限制耐药性一旦建立了(11]。了解耐药的机制是一个重要的一步改善STS患者的生存。先前的研究已经表明,常见的耐药机制在不同的肿瘤药物外排泵的超表达如Pgp (12]。Pgp Eribulin是一个潜在的衬底,一些细胞系,包括乳腺癌细胞系,获得抗Eribulin通过过度凋亡和Pgp (13]。我们观察到凋亡的表达增加耐药细胞系相比,父母的细胞系;然而,在蛋白质含量没有明显差异的Pgp或功能。Pgp可能起着主导作用的药物抗性在乳腺癌但不是eribulin平滑肌肉瘤或有错误在转录后的加工eribulin-resistant Pgp的细胞系,并进一步的确切机制还需要进一步研究。

几类抗癌药物抑制癌细胞分裂,作用于微管和微管蛋白的突变或microtubule-associated蛋白质可能诱导耐药(14]。紫杉烷与微管蛋白结合,稳定微管通过防止解聚作用,导致细胞周期阻滞和细胞凋亡15,16]。长春花生物碱与微管蛋白结合,抑制微管的聚合17]。Eribulin绑定到一个独特的网站微管蛋白和不可逆地抑制微管生长1]。因此,细胞不能形成有丝分裂纺锤波和逮捕在G2 / M过渡最终发生细胞凋亡。我们发现政府的eribulin父母细胞系诱导G2 / M逮捕和细胞凋亡,但耐药细胞株没有进行细胞周期阻滞eribulin管理后,继续增殖。

蚀变的β微管蛋白,特别是过度的TUBB3同形像,与耐药(18]。TUBB3主要表达在神经元和睾丸(19),但有报告说,某些癌症TUBB3和过表达可能参与肿瘤侵犯和预后20.]。重要的是,威尔逊等人表明eribulin亲和力增加了微管在缺乏TUBB3 [21]。符合这一点,我们表明,高TUBB3表达诱导阻力eribulin平滑肌肉瘤细胞系,我们假设抗eribulin源于TUBB3超表达。我们的耐药细胞株表达高TUBB3展出抗力移转到其他microtubule-interacting药物,如长春花生物碱或紫杉烷。这与之前的研究一致。

与癌症可能TUBB3协会的过度侵犯或转移已经报道了好几癌症,包括非小细胞肺癌(22],乳腺癌[20.),膀胱癌症(23),食管腺癌(24]。然而,微管蛋白的生物学作用,以及微管蛋白表达谱的同形像,在肉瘤仍然未知。在这项研究中,我们发现TUBB3过度诱导更高的肿瘤生长在体外和临床样本。因为高肿瘤生长的一个主要原因使肿瘤侵犯,我们认为表达的平滑肌肉瘤患者高TUBB3导致TUBB3患者预后差比低。肿瘤细胞耐药性的增长也是一个重要因素。在这项研究中,eribulin耐药细胞系的表达更高TUBB3往往生长更迅速比父细胞系和TUBB3击倒的siRNA导致细胞生长的抑制作用的趋势。所以eribulin阻力TUBB3过度可能是由于细胞增殖的增加部分。我们的研究是第一个报告显示表达水平在一大群平滑肌肉瘤患者,并阐明关系TUBB3表达水平和平滑肌肉瘤患者的预后。重要的是,TUBB3表达水平异构平滑肌肉瘤患者合理推断,灵敏度与TUBB3 eribulin可能是负相关的表达水平。

在这项研究中,我们清楚地揭示出其关键作用的TUBB3收购eribulin抗平滑肌肉瘤细胞系。因为TUBB3表达水平变量平滑肌肉瘤患者,TUBB3有潜力的生物标志物的选择药物治疗。即,如果过度TUBB3观察到,这表明eribulin将无效和替代药物应考虑。机制的说明TUBB3过度可能导致新的治疗策略来克服将来eribulin阻力。

5。结论

我们开发了一个eribulin-resistant平滑肌肉瘤细胞系调查机制抵抗,发现TUBB3过度诱导药物抗性eribulin和击倒TUBB3表达式的siRNA导致chemosensitization eribulin耐药细胞系。这是第一次报告的关键作用的收购TUBB3 eribulin阻力平滑肌肉瘤。我们还发现TUBB3表达水平变量平滑肌肉瘤病人。TUBB3有可能成为治疗目标克服eribulin阻力和选择药物治疗的生物标志物。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的发现包括临床样本的信息,所以不能免费,因为病人隐私。

的利益冲突

作者没有利益冲突的披露。

确认

这项工作的部分支持由补助金的年轻科学家(26713046 B k16696 17日)从日本社会促进科学和从日本骨科及创伤学研究基金会的资助Inc .(没有。332)。

补充材料

补充图1:Pgp的免疫组织化学染色法两种平滑肌肉瘤患者。PGP进行免疫组织化学染色的一个示例中使用的两个病人4(一)。左面板代表的组织样本病人继续稳定疾病(SD)与eribulin初始治疗后12周。右面板代表病人的组织样本导致进步与eribulin疾病治疗后(PD)。我们只有轻微的Pgp表达式在两个样本。比例尺代表20μm (a)和(b)。(补充材料)

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