文摘

尽管最近的进步化疗和手术切除,食道癌的5年生存率仍然在低水平。因此,它是非常重要的去发现一个新的代理提高食道癌患者的预期寿命。Dihydroartemisinin (DHA),青蒿素的半合成衍生物,最近表现出对各种癌症细胞有前途的抗癌活性。但到目前为止,具体机制仍不清楚。我们以前证明DHA食道癌细胞生存能力降低剂量依赖性的方式在体外诱导细胞周期阻滞和细胞凋亡。在这里,我们扩展我们的研究进一步观察体内DHA对食管癌细胞的功效。在目前的研究中,第一次,我们发现DHA显著抑制异种移植肿瘤中细胞增殖与控制。DHA诱导细胞凋亡的机制是人类食管癌细胞系Eca109 Ec9706体内剂量依赖性的方式。结果表明,DHA是一种很有前途的代理对食道癌的临床治疗。

1。介绍

食道癌是目前在中国第四癌症死亡的最常见原因。死亡达到平均每年约有15万人(1- - - - - -3]。尽管最近的进步化疗和手术切除,5年生存率仍然在低水平4,5]。存活率较低,可能是由于缺乏早期诊断肿瘤的浸润和转移,和过度依赖限制药物副作用和耐药性,因此产生不满意的结果。因此,它是非常重要的去发现一个新的代理提高食道癌患者的预期寿命。

Dihydroartemisinin (DHA),一线抗疟草药化合物,表明有前途的抗癌活性与低毒性体外和体内正常细胞(6]。越来越多的证据表明,DHA抑制多种癌细胞的生长,如宫颈癌细胞(7[],胰腺癌细胞8前列腺癌细胞),(9),肝癌细胞(10),和神经胶质瘤细胞11]。此外,DHA也有抑制的影响肿瘤细胞的浸润和转移12]。

我们已经证明了DHA的生存能力降低食道癌细胞剂量依赖性的方式。机制至少部分是由于DHA移植诱导细胞凋亡的伯灵顿的表达,bcl - 2表达下调,Bcl-xL, procaspase-3,和增加caspase-9激活,通过下调诱导细胞周期阻滞细胞周期素E, CDK2、到。我们的结论是DHA可能是小说代理对食道癌(13,14]。然而,DHA是否也积极对食道癌细胞体内仍然需要调查。

在我们的研究中,我们建立了人类食管肿瘤异种移植在BALB / c裸小鼠和对待他们体内DHA和肿瘤大小的变化是密切监测。我们评估其细胞毒性效应与肿瘤生长曲线、染色,ki - 67增殖指数和TUNEL染色。

2。材料和方法

2.1。道德声明

研究协议是按照动物保健和使用委员会制度的指导方针在哈尔滨医科大学。

2.2。细胞和老鼠

人类食管癌细胞系Eca109和Ec9706(医学遗传学实验室、生物学系、哈尔滨医科大学)是经常在RPMI 1640培养基培养补充10%胎牛血清,青霉素(100 U /毫升),链霉素(100毫克/毫升)有限公司为5%2在37°C湿润孵化器。动物实验是按照指南进行护理和使用实验动物。雄性老鼠比雌性老鼠更积极。为了避免意外伤害,选择雌性老鼠在这个实验中。雌性BALB / c裸小鼠,3 - 4周,得到从动物研究中心(线性、上海、中国)。所有的老鼠被安置在特定的无菌条件下和维护。

2.3。试剂

DHA是购自Sigma-Aldrich(圣路易斯,密苏里州,美国),并溶解在二甲亚砜160更易与L (DMSO)之前的实验。反- ki - 67抗体购自Abcam(剑桥,麻萨诸塞州,美国)。TUNEL代理购买从罗氏(中国上海)。

2.4。实验设计

建立了肿瘤的皮下注射5×106Eca109或Ec9706细胞成老鼠的侧翼,成功率为80%。肿瘤与Eca109更稳定,肿瘤与Ec9706发达更快。在第七天,肿瘤达到25 Eca109组和75毫米左右3Ec9706组;两组的老鼠被随机分配到4组(每组4)。对照组的老鼠收到每日腹腔内注射25μL (DMSO,老鼠在其他三个治疗组收到了DHA的腹腔内注射剂量的2,10或50毫克/公斤,分别。老鼠被密切监视着。肿瘤大小每隔一天测量Eca109,每隔两天用游标卡尺Ec9706腹腔内注射,和肿瘤体积是根据公式计算 。小鼠安乐死在大约2周后根据治疗时间,液化性坏死率的肿瘤可能增加2周后,肿瘤被删除,用10%多聚甲醛固定。

2.5。免疫组织化学

ki - 67的表达在肿瘤领域一旦检测出肿瘤固定很好通过免疫组织化学的方法使用一个商业工具根据制造商的指示。短暂的,一夜之间,石蜡包埋部分被孵化后反- ki - 67 Ab微波抗原检索。他们随后孵化与适当的二次30分钟Ab使用超灵敏TMS-P工具包和免疫反应性开发σ快速轻拍(3,30-diaminobenzidine tetrahydrochloride)。部分与苏木精复染色,安装,并通过显微镜检查。适当的积极的和消极的控制运行每一批。

2.6。原位检测细胞凋亡

使用ApopTag过氧化物酶被TUNEL检测到凋亡细胞原位细胞凋亡检测设备(罗氏公司、英国),根据制造商的指示。每个肿瘤部分上面布满了TUNEL混合物(2μL TdT), 48μL标签解决方案)和50μL额外转换器POD脱蜡和30分钟孵化后15 - 25°C和3% BSA, Tris-HCl正常牛血清20%,和0.1博士TUNEL负面的控制是通过省略TdT的标签,和TUNEL特异性被比较标记和细胞形态学检查。

2.7。统计分析

免疫组织化学分析的ki - 67细胞和凋亡细胞,随机选择至少两个图像选择随机×200放大图。积极染色的面积和平均荧光强度(集成光密度(IOD))测定如前所述在荧光强度阈值定义适用于所有部分和分析使用图像专业+软件(15]。IOD的结果表示每给定部分的总面积和实验动物的IOD值取平均值。所有结果的平均值±SD(标准差)。数据与SNK (Student-Newman-Keuls)分析和方差分析(方差分析),和 被认为是具有统计学意义。

3所示。结果

3.1。肿瘤体积变化

当肿瘤体积达到25毫米左右3在Eca109和75毫米3Ec9706的老鼠被随机分配到四组接受注射一千DMSO(控制),2,分别为10或50毫克/公斤DHA(如图1)。non-DHA-treated对照组,肿瘤体积增加非常迅速。之间的显著差异在观察肿瘤体积non-DHA-treated控制和DHA-treated组8天;此外,在统计上有显著差异的肿瘤体积被发现在三个治疗组治疗后10天。与对照组相比,肿瘤生长明显抑制了22.9%,48.9%和63%在Eca109 ( ),21.1%,35.3%,60%在Eca9706 ( )在小鼠2、10和50毫克/公斤DHA。

(一)
(一)
(b)
(b)
图1
Eca109和Ec9706的测量肿瘤体积。non-DHA-treated对照组(a),肿瘤体积增加非常迅速。与对照组相比,肿瘤生长明显抑制了22.9%,48.9%,63%,Eca109小鼠治疗2、10和50毫克/公斤DHA ( )。non-DHA-treated对照组(b),肿瘤体积增加非常迅速。与对照组相比,肿瘤生长明显抑制了21.1%,35.3%,60%,Eca9706小鼠治疗2、10和50毫克/公斤DHA ( )。
3.2。原位Dihydroartemisinin抑制细胞增殖

疣状ki - 67是专门的核。ki - 67表达显著增加肿瘤细胞增殖有关。高架ki - 67表达与细胞有丝分裂指数和组织学评分高;在此基础上,我们显示DHA抑制原位Eca109和Ec9706细胞的扩散。在我们的结果中,我们检查了ki - 67染色和评估了IOD值ki - 67染色。在Eca109, IOD值显著降低2毫克/公斤DHA组(11676.1±924),10毫克/公斤DHA组(6239.8±624),和50毫克/公斤DHA组(687.6±106.6)相比,对照组中的值(32395.6±1427.2; )。Ec9706的IOD值显著下降2毫克/公斤DHA组(14031±939.3),10毫克/公斤DHA组(8508.6±736),和50毫克/公斤DHA组(1053.2±172.7)相比,对照组中的值(16642.7±1023.1; ,数据2和3)。此外,DHA疗法对细胞增殖的抑制作用剂量依赖性的方式进行显示,ki - 67阳性细胞在10毫克/公斤DHA组(Eca109: 6239.8±624 Ec9706: 8508.6±736)明显少于2毫克/公斤的DHA集团(Eca109: 11676.1±924 Ec9706: 14031±939.3),甚至更少的ki - 67 - 50毫克/公斤组阳性细胞(Ec9706 Eca109: 687.6±106.6: 1053.2±172.7)比10毫克/公斤。


图2
考试在Eca109 ki - 67免疫染色。IOD值显著降低了2毫克/公斤DHA组(b)(11676.1±924), 10毫克/公斤DHA组(c)(6239.8±624),和50毫克/公斤DHA组(d)(687.6±106.6)相比,对照组(a)中的值(32395.6±1427.2; )。箭头指向的是ki - 67阳性细胞。酒吧规模:50μm。

图3
考试在Eca9706 ki - 67免疫染色。IOD值显著降低了2毫克/公斤DHA组(b)(14031±939.3), 10毫克/公斤DHA组(c)(8508.6±736),和50毫克/公斤DHA组(d)(1053.2±172.7)相比,对照组(a)中的值(16642.7±1023.1; )。箭头指向的是ki - 67阳性细胞。酒吧规模:50μm。
3.3。Dihydroartemisinin原位细胞凋亡细胞

应用TUNEL染色检测细胞凋亡的肿瘤细胞在四组。我们评估了IOD值TUNEL染色。在Eca109, IOD值显著增加2毫克/公斤DHA组(8010.9±1477),10毫克/公斤DHA组(11643.7±744.4),和50毫克/公斤DHA组(22555.5±1542.9)相比,对照组中的值(5617.7±408; )。Ec9706的IOD值显著增加2毫克/公斤DHA组(6515.8±507),10毫克/公斤DHA组(14915.2±972.1),和50毫克/公斤DHA组(22019.4±1093.1)相比,对照组中的值(1209.5±118.4; )。大量的细胞凋亡可能是由于DHA的存在,这是符合ki - 67染色的结果。TUNEL染色与可变剂量正相关的剂量依赖性的方式(数字4和5)。


图4
在Eca109 TUNEL染色检测。IOD值显著增加2毫克/公斤DHA组(b)(8010.9±1477), 10毫克/公斤DHA组(c)(11643.7±744.4),和50毫克/公斤DHA组(d)(22555.5±1542.9)相比,对照组(a)中的值(5617.7±408; )。箭头指向TUNEL-positive细胞。规模50条μm。

图5
在Eca9706 TUNEL染色检测。IOD值显著增加2毫克/公斤DHA组(b)(6515.8±507), 10毫克/公斤DHA组(c)(14915.2±972.1),和50毫克/公斤DHA组(d)(22019.4±1093.1)相比,对照组(a)中的值(1209.5±118.4; )。箭头指向TUNEL-positive细胞。规模50条μm。

4所示。讨论

在当前的研究中,我们首先报告体内DHA对食道癌的抗肿瘤效应。DHA-treated抑制增长和促进细胞凋亡,细胞显示特征表明DHA可能是一个有效的和有前途的代理打击食道癌。DHA的抗效应在许多类型的细胞已被证明(7- - - - - -12]。符合这些报告,我们的结果表明,DHA对食道癌细胞产生细胞毒性。DHA以剂量依赖性的方式抑制细胞增殖和生存能力。因为癌症的主要特征的结果不受控制的细胞周期和逃避凋亡[16),治疗药物如DHA,逮捕细胞周期和促进肿瘤细胞的凋亡,是高度期望。

DHA作为癌症的小说和有前途的药物,抗癌的活性在不同肿瘤细胞(7- - - - - -12),但DHA对食道癌的影响仍不完全理解,和我们以前的研究表明,DHA可能是小说对食管癌体外代理,已经发表的数据,支持这一理论,DHA具有潜在机制对食道癌(13]。在这里,纠正体内数据的缺失。

ki - 67,一个普遍接受的核内蛋白,在许多恶性肿瘤与细胞增殖有关。作为一个有价值的实验研究和某些癌症的组织病理学评估,ki - 67提供了重要的预后信息来支持预后评估治疗(17- - - - - -19]。维斯纳等人证明是具有统计学意义的整体存活率通过检查ki - 67作为常规临床预后标记用于乳腺癌患者(20.]。此外,Klintman等人建议,作为预测工具,ki - 67可以作为一个替代或补充因素癌症恶化组织学评分(21]。结果,ki - 67指数是最重要的一个标记的肿瘤扩散。

在我们的研究中,ki - 67免疫组织化学显示,DHA降低了细胞增殖。类似于我们的研究中,一些专家发现,DHA诱导hyperexpression ki - 67在胰腺癌细胞和卵巢癌细胞22,23]。我们的数据表明,有一个核的抑制反应之间的相关性和DHA和细胞核染色的程度是高度相关的DHA的浓度。积极的原子核更丰富的对照组相比,治疗组。我们推断,DHA可能抑制肿瘤的生长和改善生存,阻碍细胞增殖。与我们的结果一致,检查DHA作为治疗药物对乳腺癌细胞,Lucibello DHA等人得出的结论是,抑制细胞增殖和凋亡针对TCTP的磷酸化形式(24]。同样,风等人发现顺铂治疗结合DHA能提高cisplatin-induced在卵巢癌细胞增殖抑制作用。这种机制至少部分是由于DHA的失活mTOR激酶和促进细胞凋亡25]。此外,在最近的一项研究中,小高等人分析了DHA在横纹肌肉瘤细胞的抗癌活性;作者得出的结论是,DHA可能代表一个小说类抑制剂通过冥想的哺乳动物雷帕霉素靶(mTOR),一个中央控制器对细胞增殖和生存的肿瘤细胞(26]。

细胞凋亡与坏死,检测不到发炎,是一种有效的迹象的方法删除冗余或受损细胞从组织从而获得组织内稳态27]。目前,有两种主要的半胱天冬酶通路识别,线粒体apoptosome-mediated内在途径或死亡receptor-induced外在途径。这两种方式在几个级别上是相互联系的。最重要的bcl - 2蛋白调节细胞凋亡,这是位于线粒体膜,而伯灵顿bcl - 2直接结合,抑制其功能(27]。伯灵顿的比率增加/ bcl - 2刺激从线粒体细胞色素c的释放到胞质,胞质细胞色素c然后结合proapoptotic蛋白酶激活因子- 1 (Apaf-1),导致发起者的激活半胱天冬酶蛋白水解事件开始,杀死细胞(28- - - - - -30.]。

本研究的结果表明,诱导肿瘤细胞的凋亡可能是DHA在肿瘤细胞生存能力的一个重要机制31日,32]。在胰腺癌的情况下,陈等人建议DHA诱导细胞凋亡减少的比率bcl - 2 /伯灵顿和增加剂量依赖性的方式caspase-9[的激活22]。同样,张等人透露,DHA诱导细胞凋亡,激活caspase-3和伯灵顿的比率增加/ bcl - 2在人类肝癌细胞(10]。更重要的是,娇等人表明,DHA在人类卵巢癌细胞诱导细胞凋亡的减少Bcl-xL和bcl - 2和增加伯灵顿和坏23]。这些发现表明,DHA表现出部分抗癌活性细胞凋亡。

在我们之前的详细文献[13),DHA治疗诱导显著细胞凋亡两种类型的食道癌细胞剂量依赖性的方式。我们目前TUNEL结果表明,DHA食道癌细胞的凋亡率治疗组高于对照组,而食管癌细胞的凋亡率2毫克/公斤DHA组明显低于50毫克/公斤DHA。这些结果表明,浓度的增加DHA可能导致增加细胞凋亡或死亡。类似于我们的研究中,徐等人证明了DHA促进细胞凋亡在前列腺癌生物细胞(9]。

总之,我们调查了DHA的抗癌效应对人类食道癌细胞体内。这项研究表明,DHA抑制细胞增殖和诱导细胞凋亡在食道癌,和我们没有观察不良反应。我们的研究表明,DHA是一个非常有趣的自然产品,我们希望一个光明的未来。我们将处理更多的组织学和分子研究,促进翻译DHA的诊所。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突,关于这篇文章的出版。

作者的贡献

Cailing江和李Shumin贡献同样这项工作。

确认

这项工作得到了中国自然科学基金(81372610)、黑龙江省教育部门基金会(12531355),黑龙江省卫生部门基金会(660),和科学研究基金会的哈尔滨医科大学第三附属医院(JJZ2011-18)。作者是感谢老师的中央癌症实验室哈尔滨医科大学对他们的帮助。作者感谢Yuyan Ma和杨梅的杨的技术援助。