人大肠癌中肌动蛋白过表达及其对肿瘤迁移的影响

摘要

客观的．人类大肠癌(CRC)是第三大常见癌症;转移性结直肠癌(mCRC)患者的预后较结直肠癌患者差。除了病理特征外，没有可靠的分子标志物来诊断结直肠癌的预后。因此，迫切需要开发一种用于诊断和/或预测人类CRC的生物标志物。此外，capping actin protein (CapG)属于gelsolin家族，已被报道参与多种人类癌症的肿瘤侵袭/转移。在这里，我们首次评估了人类crc中CapG的表达。研究设计．应用免疫组化(IHC)染色法检测人组织芯片中CapG的表达水平。同时，采用real-time RT-PCR和Western blotting检测4个CRC细胞系的mRNA和蛋白水平。最后，采用Matrigel transwell侵袭实验评价了CapG高表达或低表达细胞的侵袭能力。结果．我们证明，在正常结肠组织和人类CRC标本中可以检测到CapG。然而，与CRC标本和正常病例相比，在mCRC标本中，CapG显著过表达。在四种CRC细胞系中也检测到它，包括mRNA和蛋白水平。我们还发现，抑制CapG的表达可以减少肿瘤的迁移。结论．在本研究中，我们认为在临床标本中，CapG可以作为转移性CRC的生物标志物。此外,我们的在体外研究表明，CapG可能参与了人类crc的肿瘤转移。

1.介绍

结直肠癌(CRC)是全球第三大最常见的癌症，也是男性和女性癌症相关死亡的第四大原因。结直肠癌的危险因素包括年龄、生活方式、结直肠癌家族史、炎症性肠病(IBD)和克罗恩病[1]．目前CRC的临床治疗策略包括手术切除、化疗和靶向治疗。然而，CRC患者的预后取决于肿瘤的病理特征和诊断分期。在CRC原位癌患者中，5年生存率为90%。然而，转移性结直肠癌(mCRC)患者预后差，5年生存率为10-20% [2]．靶向治疗包括抗受体酪氨酸激酶(RTK)的单克隆抗体，如表皮生长因子受体(EGFR)，可能有助于改善mCRC患者的生存。因此，对CRC患者的早期诊断或对mCRC患者治疗的预测标志物的识别是迫切需要的。

结直肠癌死亡的主要原因通常与术后转移和化疗药物耐药性有关。如果能在治疗前更准确地判断预后，对患者进行个体化治疗会更有效。原发部位的实体瘤扩散及恶性细胞的脱离促进了后续的扩散。这种转移级联是通过迁移和侵袭性信号调节的细胞骨架和细胞外基质(ECM)重塑的关键因素[3.，4]．

CapG是gelsolin家族的一种膜，具有与肌动蛋白丝的刺状末端高亲和力结合的共同特性，已被证实在乳腺癌、肺癌、前列腺癌等肿瘤的侵袭和转移中发挥重要作用[5- - - - - -7]．CapG通过与肌动蛋白细胞骨架的不同相互作用对细胞运动的调节做出了贡献[8]．据报道，它也对肿瘤的侵袭和迁移起作用[5，6，8]．尽管有报道称gelsolin在结直肠癌病例中过表达并诱导肿瘤侵袭[6]， CapG与CRC的作用及关联尚不清楚。

在本研究中，我们通过组织芯片(TMA)免疫组化染色检测CRC患者的CapG表达，并通过病理进行临床验证。此外，我们还在不同的CRC细胞系中检测了CapG的mRNA和蛋白水平。最后，在过表达capg的细胞系中也证实了细胞浸润。

2.材料和方法

2．1．患者样本

人结直肠癌转移正常组织芯片片(CDA3)购自韩国首尔的SuperBioChips实验室。选取病理诊断为CRC的50例患者(包括10例转移癌患者)和9例正常患者纳入本TMA(数据表:http://www.tissue-array.com/product/product_view.php?product_code=22&category1=1&category2=3&category3=14）.然而，在这张幻灯片中，有两个病例异常地没有肿瘤细胞。这些病例的肿瘤分期和pTNM的诊断可在TMA数据表中找到。此外，这些病例的预后也可在本TMA的补充资料中找到。本研究经嘉义基督教医院迪特曼森医学基金会机构审查委员会(IRB)批准(IRB106018)。

2．2．细胞系和细胞培养

人结直肠癌细胞系，包括HCT116、HT29、SW1116和DLD-1，均来自ATCC。HT29和DLD-1细胞在Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM)中培养;HCT116细胞在RPMI 1640培养基中培养，SW1116细胞在L-15培养基中培养(培养基均购自Gibco BRL, Grand Island, NY)。所有培养基中添加10%胎牛血清(FBS) (Trace Biosciences, Sydney, Australia)，青霉素(200 U/ml;Biowest, Nuaillé，法国)和链霉素(100μg / ml;Bioweat)。细胞保持在37°C, 5% CO₂．

2．3.免疫组织化学染色

TMA中的组织标本去脂，在柠檬酸中煮沸，用双氧水处理，然后与抗capg一抗(GeneTex Inc.，新竹，台湾)在4°C孵育过夜。然后，将TMA与聚合物-辣根过氧化物酶结合的二抗在室温下孵育。用二氨基联苯胺(DAB)制作标本，用苏木精(Dako, Glostrup, Denmark)进行反染色。这些图像是用奥林巴斯显微镜测定的。染色强度从0(无法检测到)，1(弱染色)，3(中等染色)到5(强烈染色)，而组织内阳性染色肿瘤细胞的比例从0%到100%的肿瘤细胞被识别。染色评分用染色强度与肿瘤阳性比例的乘积表示。

２.４.实时定量rt - pcr

Real-time PCR检测四种CRC细胞系中CapG的表达。用RNA分离试剂盒(GE Healthcare, Munich, Germany)提取HCT116、HT29、SW1116和DLD-1细胞的总RNA，用罗氏公司(Roche, Mannheim, Germany)的转录第一链cDNA Synthesis kit制备cDNA，在CFX96 Real-Time System (Bio-Rad)上进行检测。实时PCR条件为:50℃2 min, 95℃10 min, 95℃变性15秒，55℃退火延伸1 min，共40个循环。所使用的引物包括:（1）CapG-F: CGAACACTCAGGTGGAGATT（2）CapG-R: TCCAGTCCTTGAAAAATTGC（3）GAPDH-F: TGCACCACCAACTGCTTAGC（4）GAPDH-R: GGCATGGACTGTGGTCATGAG

2．5．西方墨点法

采用RIPA缓冲液(含PMSF、EGTA、抑肽酶、leupeptin、Na)提取人结直肠癌细胞系HCT116、HT29、SW1116和DLD-1的总细胞裂解液_3.签证官₄(Sigma, MO，美国)和EDTA (Merck, Darmstadt，德国))。每个样品的蛋白质用10%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)进行分析，转移到PVDF膜(Bio-Rad Laboratories Inc.， CA, USA)，并阻断和一抗(CapG抗体;在4°C过夜，然后在室温下二抗染色1小时。最后，使用生物光谱成像系统(UVP, CA, USA)对数据进行检查。采用Image-J软件定量细胞内蛋白表达水平。

2．6．迁移分析

将对照shRNA (CCGGACACTCGAGCACTTTTTG)和CapG shRNA (ccggccgaacactcaggtggagattctcgagaatctccacctgagtgcggttttt)转染HT29细胞，通过transwell迁移实验检测细胞的迁移活性。1×10⁵细胞/孔在transwell上室播种培养24 h, 10%胎牛血清作为化学引诱剂在底部室培养24 h。在底室迁移的细胞用2%结晶紫溶液(Sigma, MO, USA)染色。

2.7。统计分析

所有数据使用GraphPad Prism for Windows, version 6 (GraphPad Software Inc.， San Diego, CA, USA)进行分析。数据以均数±标准差表示，和通过非参数检验，使用Microsoft Excel和SPSS 21.0 (IBM SPSS Statistics, USA)软件计算。小于0.05的值被认为“具有统计学意义”。

3.结果

3．1.CapG在人转移性大肠癌中的表达

患者的人口学资料及临床特点见表1．在这些标本中，CapG的表达指数分为高(表达指数≧1.5)和低(表达指数< 1.5)。年龄、性别、肿瘤分化程度、肿瘤大小及浸润性、淋巴结状况、肿瘤分期等组间CapG表达无显著性差异(表)1）.在9例正常CRC、39例CRC、9例转移CRC的临床标本中，采用免疫组化染色验证并在显微镜下检测CapG的表达(补充资料)1）.CapG在肿瘤组织和正常组织中的表达由临床病理医生陈建钦博士测定，并对其染色强度(无表达:0，弱表达:1，中表达:3，强表达:5)和肿瘤阳性比例(0 - 100%)进行评分。与CRC和正常病例相比，转移性CRC标本中CapG过表达显著(图)1）.这一发现与各种人类癌症的报告一致[5，6]．然而，我们的数据也显示，CRC病例与正常标本之间的CapG表达无统计学意义(图)1）.在此，我们的数据提示，CapG可能是转移的预后标志物，但不能作为CRC患者的诊断肿瘤标志物。

3．2．CapG在大肠癌细胞系中的mRNA和蛋白表达水平

为了评估CapG在人CRC细胞中的表达和进一步的生物活性，我们检测了四种CRC细胞系。培养SW1116、HT29、HCT116和DLD-1人结直肠癌细胞株，采用实时RT-PCR和Western blotting检测CapG mRNA和总蛋白。数字2(一个)结果显示，这些细胞中CapG mRNA的表达水平为SW1116 > HT29 > HCT116 > DLD-1。同样，这些细胞中CapG的蛋白表达水平为SW1116 > HT29 > HCT116 > DLD-1(图)2 (b)）.本研究首次揭示了在SW1116、HT29、HCT116和DLD-1细胞中CapG mRNA和蛋白的差异表达。

3．3.抑制HT29细胞中CapG的表达降低细胞的迁移能力

我们的数据(图1)表明，在转移性CRC病例中，CapG过表达，提示CapG可能参与人CRC肿瘤转移。为了解决这一假设，我们将CapG的shRNA转染到HT29细胞中，并通过transwell迁移实验进一步确定细胞迁移。数字3(一个)结果表明，在HT29细胞中，CapG shRNA能显著抑制CapG的表达。此外，在HT29细胞中，CapG敲低降低了细胞的迁移能力(图)3 (b)和3 (c)）.这些结果表明，人结直肠癌细胞中过表达的CapG可能参与了肿瘤细胞的迁移。

4.讨论

在这项研究中，我们首次探讨了CapG在人类大肠癌中的表达。免疫组化染色显示，与CRC和正常病例相比，转移性CRC标本中CapG高表达(图)1）.提示CapG的高表达可能与CRC的迁移有关，这可能是mCRC早期诊断的一个有用的预后指标。重要的是，我们的发现与之前在人类胶质瘤中的发现一致[9，乳癌[10]、胃癌[11]，以及卵巢癌[12，提示CapG可能是一种肿瘤蛋白。此外，之前的报道显示75例肺腺癌中，淋巴结转移患者与CapG过表达相关[13]．其中，肺腺癌晚期(III期和IV期)过表达的CapG也高于肺腺癌早期[13]．大部分文献表明，CapG与癌细胞的侵袭和迁移有关。之前的研究表明，CapG在小细胞肺癌(H69, Lu22, Lu139, Lu134，和H209)，肺腺癌(PC7, RERF-LCMS)，胃癌(AZ521)和黑色素瘤(A2058)中表现缺失[14]．测试异位CapG从人类二倍体成纤维细胞的致瘤的阶段应变(RBT)和胃癌细胞株AZ521,结果表明,CapG超表达可以抑制致瘤性但没有影响anchorage-independent RBT和AZ521细胞的增长和可能是一个候选肿瘤抑制(14]．已知CapG蛋白具有肌动蛋白调节活性[15，而微丝的改变可能会导致致瘤性的获得或丧失。

此外，CapG属于肌动蛋白调控蛋白的gelsolin/villin家族。Gelsolin与癌细胞的侵袭和转移有关，如前列腺癌[7]及肺腺癌[13]．Gelsolin通过调节侵袭相关尿激酶型纤溶酶原激活物(uPA)促进HCT116和DLD-1细胞的侵袭和转移[6]．此外，uPA系统在引起侵袭性肿瘤行为中发挥作用，促进几种肿瘤的侵袭和转移[6]．Westbrook等人证实CAPG和PDZ结构域蛋白GIPC1 (GIPC1)与乳腺癌骨转移独立相关[10]．CAPG与骨转移的相关性较弱，GIPC1与骨转移的相关性较强[10]．此外，crc还可分为微卫星不稳定(MSI)和稳定(MSS)两种类型。为了进一步证实CapG在人CRC中的作用，我们将CapG的shRNA转染到HT29细胞中，并证实了其对细胞迁移的抑制作用(图)3.）.因此，我们认为CapG可能在人类大肠癌中发挥肿瘤转移的作用。

5.结论

CapG已被证明在多种人类癌症中过表达并参与恶性肿瘤。然而，CapG在人类大肠癌中的表达及其作用尚不清楚。在本研究中，我们证明了在正常结肠组织和人类CRC标本中可以检测到CapG。最重要的是，与CRC和正常病例相比，转移性CRC标本中CapG显著过表达。进一步研究表明，下调人CRC细胞中CapG的表达可降低肿瘤的迁移能力。我们的体外研究表明，在临床标本中，CapG可以作为转移性CRC的生物标志物，并可能在肿瘤转移中发挥作用。

数据可用性

用于支持本研究发现的数据可由通讯作者要求提供。

的利益冲突

作者声明与本研究涉及的任何公司没有财务关系。本研究不涉及利益冲突。

致谢

本研究得到嘉义基督教医院(grant R106-02)及民惠医疗管理学院的资助。作者感谢吉米·库珀对手稿的批判性阅读。

补充材料

补充资料1:组织芯片中CapG在人类大肠癌和正常标本中的表达。组织芯片通过免疫组化检测CapG的表达，显微镜下观察照片。35号和45号标本中均无肿瘤标本。数字60显示了一个空白。（补充材料）

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