MicroRNA-378促进BMMSCS中的成骨血管生成偶联，用于潜在的骨再生

摘要

骨组织再生与成骨和血管生成密切相关。成骨生长因子和血管生长因子的协调调节会促进骨再生，而二者的不平衡则会导致外源性输送导致局部骨形成或血管量过大。因此，认为microRNA在基因水平上通过内源性信号通路调控多种代谢进程。在这项研究中，我们同时发现microRNA 378是成骨和血管生成的正调控因子，并且在人骨髓间充质干细胞(hBMMSCs)中，在成骨细胞诱导后，microRNA 378的含量比对照组增加。过表达microRNA 378后，成骨基因和血管生成基因表达同时增加。茜素红、碱性磷酸酶(ALP)染色增强，血管内皮生长因子(VEGF)分泌增多。因此，我们认为miR378是骨再生中成骨-血管生成耦合的理想靶点，为骨再生的基因治疗提供了一个潜在的工具。

1.介绍

移植后血供不足会导致巨大的移植物发生炎症坏死，导致临床使用失败率高[1］．因此，血管生成对于骨形成进展是重要的，其中血液供应诱导骨组细胞的迁移和骨组织的矿化[2，3.］．成骨和血管生成的不平衡会导致局部骨组织过度矿化或血管肿大[4］．

多种内源性信号通路调控成骨和血管生成。Wnt信号通路正调控BMMSC的成骨，ALP和runt相关转录因子2 (Runx2)是成骨-血管生成下游的代表性因子[5- - - - - -7］．丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路通过靶向VEGF表达正调控血管生成[8- - - - - -10］．然而，外源性的成骨和血管生成刺激剂会导致骨形成不平衡，导致过度的骨形成或血管渗漏，有发生肿瘤的风险[11，12］．因此，有必要通过潜在的、内源性的、平衡的刺激来增加骨生成和血管生成。

MicroRNA（miRNA）是一类大类的小型非编码的RNA，其作为基因表达的阻遏物在后颅调节水平上起作用。单一的miRNA通常涉及几个基因调节网络，其作为不同信令途径的检查点的作用[13- - - - - -15］．因此，我们试图鉴定一个microRNA作为骨再生的成骨-血管生成耦合。从以前的报道来看，miR378、miR214和miR155在成骨和血管生成过程中都受到很大的影响。通过靶基因预测，选择miR378作为调节成骨和血管生成的关键因子。

2.方法

２.１.人骨髓基质细胞培养

原代人骨髓间充质干细胞如前所述分离[16］．样本采集遵循西安交通大学附属3201医院伦理权威机构批准的方案。实验在捐赠者或受试者的理解和同意下进行，并声明负责的伦理委员会已经批准了实验。

首先，收集5例健康骨髓标本，年龄18 ~ 30岁，采用自体髂骨移植修复牙槽骨裂。取1 mL骨髓标本放入10 cm培养皿中，加入20 mLα.-MEM (Gibco BRL, Gaithersburg, MD)添加15% FBS (Gibco, BRL)，然后在5% CO中孵育₂, 37°C。实验使用3-5代细胞。

其次，使用荧光激活细胞分选(FACS)分析CD45、CD34、CD14、CD29、CD44、CD90和CD106 (R&D Systems, Inc.)。我们的实验使用了2-4代多菌落来源的hMSCs。

２.２.MC3T3文化

取4毫升α.-MEM完全培养基进入离心管，37°C预培养10分钟。从液氮中取出的低温保存的MC3T3细胞(ATCC, USA)在37°C水浴中迅速摇动并迅速重塑。将细胞转移到预热的培养基中，离心上清。适量的α.-MEM在37°C 5% CO下完全培养₂孵化器。在第二天，将新鲜培养基更换并在37℃下孵育5％CO₂孵化器。细胞用于实验3至5代。

2．3.内皮祖细胞的文化

取8毫升EGM-2MV(瑞士龙沙)培养基，在37°C水浴中加热。从液氮罐中取出rEPC (ATCC, USA)，快速摇入37°C水浴中，快速摇匀细胞。取弃上清离心，加入适量新鲜培养基，37℃，5% CO₂培养箱继续培养后每3天更换一次培养基。细胞用于实验3至5代。

２.４.转染

使用siPORT NeoFX转染剂(Ambion, Applied Biosystems, USA)转染miR-378模拟物、miR-378抑制剂或阴性对照(广东瑞博，中国)，并遵循制造商的说明。简单地说，转染试剂被稀释α.-MEM (Gibco BRL)，并与50 nM miR-378 mimic、100 nM miR-378 inhibitor或相同浓度的mir -阴性对照混合。室温孵育10 min后，分装到6孔板(Nunc)中。将BMMSC悬浮液以1 × 10的密度加入每个烧瓶中⁶细胞/ ml并在正常条件下培养。6小时转染后培养基被替换。在转染后在不同时间点（第2,7和14天）收获细胞，通过定量RT-PCR（QRT-PCR）分析RNA水平。将所有反应重复3次。

2.5。成骨分化

为了诱导成骨细胞分化，在达到80％汇合后，培养BMMSC和MC3T3细胞α.-mem补充了5％的FBS，100nm地塞米松，50 μ.g/mL抗坏血酸β-甘油磷酸14天。媒体每三天更换一次。钙累积通过2%茜素红染色检测，并通过1%茜素红溶解 毫升十二烷基硫酸钠溶液。十二烷基硫酸钠溶液与茜素红的光吸收读数为570 纳米，带微孔板读取器（Bio-TEK Instruments，威努斯基，VT，美国）。在7天和14天的成骨诱导后，细胞在4%多聚甲醛中固定20天后，在磷酸盐缓冲盐水（PBS）中洗涤两次 使用BCIP/NBT碱性磷酸酶显色试剂盒（Beyotime Co.，上海，中国）测定最小ALP染色。通过PCR检测成骨基因Runx2、ALP、骨钙素（OCN）、I型胶原（Col I）和骨唾液蛋白（BSP）的表达。

2.6。基底膜基质™血管造影术

BMMSC和EPC悬液培养至第三代，用于后续的Matrigel实验。将BMMSCs培养至第三代，然后通过miR-378模拟物、miR-378抑制剂或阴性对照转染BMRCs进行后续实验。

Matrigel [growth factor-reduced (GFR) Matrigel Matrix, BD, USA]置于冰箱中，在4°C冰箱中解冻过夜。在实验中，基质总是被放在冰箱里。加10μ.将基质凝胶滴入载玻片的每孔，盖上盖子，静置约30分钟后等待凝胶化。糊化后加入50μ.细胞悬液浓度为1 × 10⁶细胞/mL至载玻片、盖子和支架的每一列，一段时间后，所有细胞将沉入基质凝胶表面。分析了分支数、分支长度、节点数、网格数和网格面积。

2.7。定量RT-PCR

BMMSCs在成骨培养基中培养并在14天的诱导中收获。通过BMMSCs中的QRT-PCR检查骨ucoperic标记基因（Runx2，AlP，BMP2和骨钙素）。用MiR-378模拟物转染BMMSCs，MiR-378抑制剂或阴性对照，MiR-378水平，Runx2，BMP2，OCN，VEGF，血管血素1（Ang1）和COL I后被BMMSCs均进行检查用miR-378模拟物，miR-378抑制剂或阴性对照转染。用Trizol试剂（Invitrogen，Carlsbad，Ca）分离出总细胞RNA。然后，将分离的RNA用作cDNA合成的模板，使用制备的上标II第一链cDNA合成试剂盒（Inverten Life Technologies，Carlsbad，CA）。根据制造商的协议进行实时PCR。引物列于表中1．每种样品重复三次QRT-PCR试验。

2.8. 酶联免疫吸附试验（ELISA）

转染miR-378模拟物、miR-378抑制剂或阴性对照后，分析VEGF的分泌情况。骨髓间充质干细胞与α.-MEM (Gibco)培养6 h后，用添加5.0%血清替代品nu-Serum# (NuS, BD)的新鲜生长培养基替代培养基。分别在6 h、12 h、24 h、36 h、48 h和60 h采集样本。根据制造商说明书(R&D Corp.)，采用ELISA法检测培养基中VEGF蛋白水平。用酶标仪(MTP-800Lab，日冕电晕公司，日本)在450 nm处测定吸光度。绘制标准曲线测定VEGF浓度。每个样品的所有测试都重复三次。这些值表示为ng/mL。

2.9。免疫印迹

在转染miR-378模拟物、miR-378抑制剂或阴性对照后，分析VEGF的表达。从三组细胞中提取总蛋白;采用WB法检测VEGF的表达水平。

2.10.统计分析

所有实验至少进行了三次。结果以平均值和标准偏差表示。统计分析（学生的t- 最低）已作为两个样本进行t测试。

3.结果

３．１．miR378参与骨髓间充质干细胞成骨

将bmmsc培养至P3，流式细胞仪分析细胞标记物。结果显示，bmmsc阳性表达CD29、CD44、CD90、CD106，阴性表达CD14、CD34、CD45(图)1）．通过靶基因预测分析，预测miR378为Wnt和MAPK信号通路的交集。因此，我们选择miR378作为同时促进成骨和血管生成的调控因子。诱导14天后进行茜素红染色。与MC3T3相比，经成骨诱导的BMMSCs染色增强了3倍(图)2(一个)）．在诱导成骨7 d和14 d后，采用qRTPCR分析成骨基因。结果表明，诱导7 d后，BMMSCs的ALP和Runx2表达增加到3 ~ 4倍，14 d后增加到2 ~ 3倍。此外，OCN表达在诱导7天后增强90倍，在诱导14天后增强140倍(图)2 (b)）．同时，我们还测试了miR378水平。结果显示，诱导7 d和14 d后，miR378的表达量显著高于对照组(图3)2 (c)）．

３.２．骨形成增加与miR378呈正相关

为了测试miR378对成骨的影响，我们用miR378模拟物转染bmmsc。miR378模拟物转染2天、7天和14天后，qRTPCR检测的miR378水平至少比对照增加了90倍(图)3(一个)）．同时，采用qRTPCR检测成骨基因Runx2、BMP-2、ColI和OCN的表达。结果显示，与对照组相比，所有成骨基因表达均显著增加(图)3 (b))，特别是OCN的表达是对照组的60倍(图3 (b)）．相反，转染miR378抑制剂2天、7天和14天后，miR378水平下降了4- 6倍(图)3(一个)）．与对照组相比，成骨基因表达均下降2 - 5倍3 (b)）．

在bmmsc中转染miR-378模拟物14天后，ALP和茜素红染色明显强于对照组。相反，在bmmsc中转染miR-378抑制剂14天后，ALP和茜素红染色明显弱于对照组(图)3 (c)）．

３．３．计量分析

使用Matrigel进行BMMSC和EPC血管生成的计量分析。BMMSC对照组和EPC对照组无明显血管分支、淋巴结、网片。而BMMSC组和EPC血管组有明显的血管分支、节点和网片，且BMMSC血管组的分支、节点和网片数量明显高于EPC(图)4（a））．

为了检测miR-378对血管的影响，我们分别用miR-378模拟物、miR-378抑制剂和阴性对照转染BMMSC细胞。转染14天后，用基质凝胶检测分枝数、分枝数、节点数、网孔数和网孔面积。结果显示，转染miR-378 mimics后，分枝数量和分枝长度均显著高于阴性对照。节点数、网格数、网格面积均高于阴性对照组。相反，转染miR-378 inhibitor后，分支、分支、节点、网孔数、网孔面积均小于阴性对照组(图3)4（b））．

3．4．与miR378呈正相关的血管生成增加

与对照组相比，转染miR-378模拟物后2天、7天、14天，除成骨基因外，血管生成基因VEGF和ANG-1的表达也显著增加。在转染miR-378抑制剂2天、7天、14天后，VEGF和ANG-1的表达几乎下降了2倍(图)5（a））．

在BMMSCs中6小时，12小时，24小时，48小时和60小时转染MiR378 Mimics或抑制剂，ELISA测定VEGF分泌。结果表明，MiR378模拟转染后VEGF分泌显着大于对照。特别是在24小时模拟转染后，VEGF分泌达到峰值，比对照达到6倍。在BMMSCs中转染miR378抑制剂后，VEGF分泌显着低于对照（图5（b））．

转染miR-378模拟物、miR-378抑制剂或阴性对照后，用Western blot分析VEGF的表达。结果显示，miR-378 mimic组的表达水平明显高于阴性对照组，miR-378 inhibitor组的表达水平低于阴性对照组(图)6）．

我们在体外通过miRNA378的过度表达促进BMMSCs中的成骨-血管生成偶联，并为骨再生提供了潜在的基因工具选择。

4。讨论

mirna被证明参与了几乎所有的代谢过程[14］．因此，MiRNA被研究为靶向基因治疗部位。我们将MiR378鉴定为本文中的血管生成 - 成骨偶联。体外实验，血管生成和成骨发生在BMMSCs中MiR378正面调节。MiR378被认为是通过同时增加血管生成和骨质发生来促进骨骼的预期因素。

最近，越来越多的实验将重点放在骨开发/血管生成和miRNA功能上。据报道，MiR214抑制了osterix和毒病症中涉及的不同下游途径的骨质发生和血管生成分化[17- - - - - -20.］．然而，负调控在促进组织再生方面的应用较少。一些研究人员发现miR566可以通过靶向Von Hippel-Lindau肿瘤抑制因子来调节血管生成[21]在体外，miR-29b被证明通过靶向几种骨形成抑制剂促进成骨细胞分化[22，23］．MiR17被认为负调控骨组织形成的成骨[24，25]此外，miR26a被鉴定为调节骨生成和血管生成以促进骨再生[26，27］．在这项工作中，我们试图确定miR378作为骨再生的成骨-血管生成耦合的选择。

MiR378已被报告为各种细胞和有机代谢过程所涉及的关键因素。李发现miR378可以通过靶向sufu和fus-1表达来促进细胞存活，肿瘤生长和血管生成[28］．据报道，通过靶向CASP3和激活PI3K / AKT信号传导途径，据报道MIR-378过表达衰减高葡萄糖抑制的成骨分化[29］．为了验证miR378作为成骨-血管生成偶联，我们检测了成骨基因在成骨和骨形成中发挥重要作用的Runx2、OCN、ALP和BMP2等成骨基因标志物[5，6，11，30.］．转染miR378后，成骨标志物显著升高，表明过表达miR378的bmmsc具有更强的成骨能力。ALP和茜素红染色也证实了这一结论。

血管生成与血管生成生长因子的功能密切相关。VEGF被认为是促进血管内皮细胞增殖和成管最重要的因子[8，11，12］．血管紧张素对血管生成也是必要的。VEGF和ANG1/2 mRNA水平升高，表明过表达miRNA378的bmscs血管生成能力增强。

我们通过体外过表达miRNA378促进骨胳间充质干细胞的成骨和血管生成，为骨再生提供了一种潜在的基因工具。并确定进一步的体外给药系统和潜在的骨再生。

利益冲突

作者声明他们没有利益冲突。

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