PAK5诱发EMT和促进细胞迁移和入侵通过激活PI3K / AKT通路在卵巢癌

文摘

卵巢癌是最致命的妇科癌症,目前排名第五导致女性癌症相关的死亡。P21^{cdc42 / rac1}活化激酶5 (PAK5)是一种新发现的蛋白质,一直表示有致癌潜力。本研究调查的表达水平PAK5卵巢癌临床和功能角色的PAK5卵巢癌进展。最初发现PAK5卵巢癌组织中高度表达,特别是在远处转移患者。高表达PAK5预测卵巢癌患者的生存命运差( )。击倒的PAK5 SKOV3细胞引起上皮细胞表型,而过度A2780 PAK5导致显著的间充质细胞表型的细胞。PAK5耗尽SKOV3细胞时,细胞表现出受损的伤口恢复的能力。细胞迁移和入侵能力也显著地抑制。相反,当PAK5 A2780细胞中过表达,伤口恢复能力提高了68%。细胞迁移和入侵能力都增加到约2倍。PAK5击倒后,PI3K的磷酸化水平p85 Tyr458及其下游AKT在Ser473都降低了。PI3K和AKT的总蛋白以及一种蛋白激酶的磷酸化水平Thr308仍不受影响。这些数据表明,PI3K诱导epithelial-to-mesenchymal过渡和促进细胞迁移和入侵通过激活PI3K / AKT通路在卵巢癌。PAK5的致癌基因可能在卵巢癌可能意味着任何治疗策略针对PAK5卵巢癌治疗的希望值。

1。介绍

卵巢癌是女性癌症相关死亡的主要原因之一,目前排名第五导致女性癌症相关的死亡。根据最近的一项统计,有22280例新诊断病例的卵巢癌每年在美国,其中每年据估计,15500年死于(1]。目前卵巢癌患者治疗选择包括手术、放疗和化疗。然而,大多数病人在手术后复发或对化疗药物产生抗药性2,3]。由于不合时宜的诊断和治疗策略有限,卵巢癌患者的预后仍然贫困估计超过70%的患者诊断处于高级阶段(2,3),5年生存率仅约30% (4]。因此,必须寻找新靶点为卵巢癌的早期诊断和治疗。

P21^{cdc42 / rac1}活化激酶5 (PAK5)在2002年首次克隆和表征brain-specific激酶和导致丝状伪足的形成在神经细胞(4]。的基因pak5位于智人20 p12染色体位点和由12个外显子和编码编码一个80 kDa的蛋白质。PAK5 PAK二世亚科的成员之一的柏加斯和定位在线粒体和细胞核。在哺乳动物中,柏加斯(PAK1-6)被分成组我(PAK1、PAK2 PAK3都)和组II (PAK4、PAK5 PAK6)基于他们的结构和序列同源性5]。PAK5包含719个氨基酸残基,完全按顺序区别于其他柏加斯。PAK5包含一个高度保守的p21-GTPase-binding域(PBD),这是整个PAK家族特征,以便与GTP-binding Cdc42优先(5]。

PAK5是最后确定的和最不理解PAK家族的成员6,7]。自从其识别大脑神经细胞,越来越多的证据认为PAK5肿瘤恶化的一个重要中介。PAK5目前是参与调节细胞骨架变化,antiapoptosis,在肿瘤细胞增殖6]。PAK5的凋亡特性取决于其核质穿梭(8]。cytoskeleton-mediating变化的监管PAK5表明PAK5的角色在细胞形态、附着力和能动性。例如,击倒PAK5在人类神经胶质瘤细胞抑制细胞迁移和入侵与EGR1-MMP2交互信号(9]。PAK5-mediated磷酸化和NF -核易位κB-p65促进乳腺癌细胞增殖在体外和在活的有机体内(10]。的极大兴趣,证据也表明,PAK5促进epithelial-to-mesenchymal过渡在结肠癌等几种类型的癌症(11和膀胱癌12]。所有这些开创性的研究暗示PAK5调解癌症恶化有很大的潜力。

最近,据报道,PAK5超表达促进紫杉醇药物抗性的卵巢上皮癌(13),这表明PAK5也可能在卵巢癌的监管。然而,没有相关的研究。本研究旨在调查PAK5的表达谱在卵巢癌的临床和研究它的功能角色在卵巢癌细胞epithelial-to-mesenchymal转换和迁移和入侵。底层机制,导致PAK5-mediated生物活性也在本研究评估。我们功能丧失和功能研究表明PAK5诱导epithelial-to-mesenchymal过渡和促进细胞迁移和入侵通过激活PI3K / AKT通路在卵巢癌。

2。材料和方法

2.1。人类标本和伦理语句

总共有66例临床病例,手术解剖和收集诊断出患有卵巢癌。成对非癌变组织也从每个病人。同时我们也获得了原发肿瘤组织和远处转移性位点从6例卵巢癌。在第二个后续研究中,我们医院的卵巢癌患者连续随访80个月,和存活率计算基于PAK5的表达水平。所有患者充分显示其同意参与我们的研究,并从每个病人获得书面同意书。协议使用人体组织是在鑫华医院伦理委员会批准董事会隶属于上海交通大学医学院。

2.2。免疫组织化学(包含IHC)分析

组织幻灯片脱蜡在60°C 4 h后三10分钟洗与二甲苯然后水化梯度乙醇包括100%,95%,85%,75%,和50%序列与蒸馏水最后5分钟。检索抗原,幻灯片被投入10毫米柠檬酸缓冲(pH值6.0)当缓冲区被加热到95°C和保持30分钟。然后,内源性过氧化物酶活性抑制3%过氧化氢在室温下为30分钟。与5%的正常山羊血清阻塞后30分钟,一夜之间,幻灯片被孵化的anti-PAK5抗体在4°C。部分被孵化1 h HRP-conjugated二级抗体。免疫反应是使用3开发的,3-diaminobenzidine(轻拍;北京中山生物技术,中国)衬底。后,苏木精复染色和脱水,部分带盖密封滑。

评估免疫染色、免疫反应性失明的方式是由两个独立的病理学家评估在光学显微镜下(BX-51奥林巴斯光学显微镜),和收集的图像是一个Camedia主c - 3040数码相机。积极PAK5疣状被定义为细胞质有或没有核染色和分级根据强度和阳性染色细胞的比例。PAK5染色强度的得分范围0 - 3(0 = - 1 =弱,2 =温和,和3 =强烈)。PAK5-positive染色细胞的百分比也得分分为四类:1(0 - 25%),2(26 - 50%),3(51 - 75%)和4 (76 - 100%)。PAK5染色的程度是由免疫反应性的评估分数(IRS),由乘法计算的分数染色强度和阳性细胞的百分比。

2.3。细胞和试剂

人类卵巢癌细胞系SKOV3, A2780 OVCAR,极品,COC1细胞库的购买中国科学院(中国上海)。细胞系都保持在杜尔贝科修改鹰介质(DMEM)(美国Gibco,洛杉矶,CA)提供10%胎牛血清的边后卫(Gibco)。培养基是刷新每两天,除非另有说明。主要抗体是商业购买的圣克鲁斯生物技术(美国圣克鲁斯,CA)除了磷酸化检测抗体的获得细胞信号技术(美国波士顿)。PAK5击倒,两个特定成分被GenePharma化学合成(上海,中国)。负控制成分的争夺(shNC)也作为控制合成成分。PAK5表达质粒是购自Addgene Inc .(美国Cambridge, MA)。

2.4。定量实时聚合酶链反应(存在)

从人体组织和培养细胞总rna提取与试剂盒试剂(豆类,大连,中国)。此后,rna是相对地转录成cDNA使用逆转录工具包(豆类、日本)。rt - pcr进行SYBR绿色试剂的ABI 7900机器。本研究中使用的引物如下:pak5(前5-CCAAAGCCTATGGTGGACCC-3和反向5-AGGCCGTTGATGGAGGTTTC-3),gapdh(前5-GTGGACATCCGCAAAGAC-3和反向5-AAAGGGTGTAACGCAACTA-3)。

的相对表达人类PAK5规范化gapdh和计算2^−ΔΔCt方法。

2.5。免疫印迹

细胞提取得到裂解缓冲(50毫米三羟甲基氨基甲烷(pH值8)液,100毫米氯化钠,NP-40 1%, 0.5%钠脱氧胆酸盐,0.5毫米phenylmethylsulfonyl氟化物,和1μg / ml抑肽酶)。蛋白质浓度评估使用bicinchoninic酸工具包(皮尔斯、钙、美国),和等量的蛋白质(60μg)分离10% SDS-polyacrylamide凝胶电泳(sds - page)和转移到聚乙二烯二氟化物膜(微孔、钙、美国)。屁股被封锁的1 h Tris-buffered盐水含0.1% Tween-20补充与5%脱脂牛奶,然后被孵化主要抗体在一夜之间在4°C。洗后,屁股被孵化与HRP-conjugated二级抗体,检测使用增强的电化学发光(ECL)试剂(费舍尔科学、钙、美国)。

2.6。免疫荧光和共焦显微镜

短暂,SKOV3和A2780细胞进行预处理指示和培养在玻璃罩24-well板滑倒。细胞被固定在4%多聚甲醛在室温下10分钟,然后冲洗3次冷PBS 5分钟/次。permeabilized triton - 100为0.3%后15分钟,细胞被封锁与PBS含有5%牛血清白蛋白(BSA,σ)60分钟。随后,细胞被孵化与主对f -肌动蛋白抗体稀释在4°C阻断缓冲区在一夜之间,其次是可视化与red-expressing二级抗体(60分钟)稀释1:1000年阻止缓冲区。核与4复染色 ,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) 10分钟。图像检测和记录使用免疫荧光共焦激光扫描显微镜(880年蔡司LSM,德国)。

2.7。伤口愈合实验

SKOV3和A2780表示被放在预处理6-well板块形成汇合的单层。然后,人工伤口垂直,每组的细胞与无菌吸管技巧。观察伤口恢复每6 h。伤口恢复的速度(称为相对迁移率(%))然后计算18 h后监测。

2.8。Transwell迁移和入侵检测

SKOV3和A2780显示预处理使胰蛋白酶化,然后悬浮在FBS-free介质,和100年μl细胞悬液的添加到transwell的上院。DMEM补充5%的边后卫是放置在众议院。入侵检测基本上是类似于迁移试验协议除了人工基底膜(BD生物科学)是均匀的缩微胶片transwell室前化验。24小时免费的轮回后,跨膜细胞被洗,与结晶紫染色。每组细胞在五个随机选择的景象被数倒置显微镜下(尼康、日本)。

2.9。统计分析

所有数据被当作平均值±标准偏差(SD)。学生的以及用于比较控制和实验组之间的区别。kaplan meier方法进行评估的存活率差异通过log-rank (Mantel-Cox)测试。任何价值 被认为是一个重要的区别。每个实验重复一式三份。

3所示。结果

3.1。PAK5卵巢癌中高度表达,预测预后不良

起初,我们收集了66例卵巢癌的临床以及配对正常非癌变组织。表达PAK5在临床使用包含IHC分析评估组织,和染色强度得分在0到7范围内。包含IHC分析表明,PAK5明显染色在卵巢癌组织中,而在正常组织几乎没有发现(图1(一))。免疫反应性的分数表明PAK5染色的平均得分国税局在癌组织明显升高,使增加约2倍的正常组织(图1 (b))。后将所有66例卵巢癌病例分成转移和nonmetastasis情况下,它是进一步发现,美国国税局染色分数在转移情况下显著高于nonmetastasis情况下(图1 (c))。在6例,存在分析显示,5例显示明显高于mRNA的PAK5转移组织比主要位点(图1 (d))。存在分析还表明,PAK5的mRNA水平差异表达的一系列卵巢癌细胞系,包括SKOV3, A2780, OVCR,极品,和COC1,而提出的最高水平A2780细胞SKOV3细胞和最低的水平。更重要的是,在一个80 -月随访研究,发现患者更高PAK5表达式的成活率有显著降低。PAK5水平较高的只有不到20%的病人幸存下来,反驳大大超过40%患者存活率PAK5水平较低(图1 (f))。这些临床观察表明,PAK5卵巢癌中高度表达,预测预后不良。

3.2。击倒的PAK5 Mesenchymal-to-Epithelial过渡SKOV3细胞引起的

针对事实SKOV3 PAK5水平最高和A2780 PAK5的最小水平,然后合成两个特定成分对PAK5(表示shRNA # 1和shRNA # 2、职责)。击倒SKOV3细胞中表达。存在分析表明,要么成分明显耗尽PAK5的mRNA水平,而第二个成分(成分# 2)最好击倒效率(图2(一个))和shRNA # 2是因此采用后续分析。免疫印迹分析也证实,要么shRNA转染引起显著减少PAK5蛋白质水平(图2 (b))。有趣的是,这是观察到击倒PAK5 SKOV3细胞后,细胞采用一个apico-basal极化形态(图2 (b))。免疫荧光分析还表明,击倒PAK5造成下降的f -肌动蛋白的表达,细胞活性(图的一个指标2 (d))。此外,免疫印迹分析表明,上皮钙粘蛋白标记的蛋白质水平显著升高的击倒PAK5使用shRNA # 2。相反,间叶细胞标记,包括波形蛋白,平滑肌肌动蛋白(SMA), N-cadherin,扭曲,被击倒的减少PAK5 SKOV3细胞(图所示2 (e))。所有这些数据暗示击倒PAK5细胞活性的降低,导致细胞的形态学变化间质表型。

3.3。Reexpression A2780的PAK5细胞促进Epithelial-to-Mesenchymal过渡

随后,A2780的细胞,至少表达PAK5与表达质粒转染的PAK5 reexpress A2780细胞。表达质粒的蛋白质水平显著增加PAK5 A2780细胞(图所示3(一个)),确认PAK5质粒的工作效率。控制A2780细胞相比,PAK5-overexpressed A2780细胞表现出形态的apico-basal极化,间充质细胞表型的信号(图3 (b))。f -肌动蛋白高表达在A2780 PAK5 reexpression后,细胞免疫荧光分析(图就证明了这一点3 (c))。符合形态学观察,发现reexpression PAK5导致钙粘蛋白的表达减少,而间质标记包括波形蛋白的蛋白质含量增加,SMA, N-cadherin,扭(图3 (d))。所有这些数据表明,在A2780 PAK5提升epithelial-to-mesenchymal过渡细胞的过度。

3.4。击倒的PAK5抑制细胞SKOV3细胞迁移和入侵的能力

在伤口愈合实验,观察到控制SKOV3细胞表现出积极的复苏挠伤口的能力。然而,在耗尽PAK5 SKOV3细胞,标记观察伤口后18 h shRNA # 2 (shPAK5转染(图)4(一))。事实上,伤口只有大约40% 18 h (shPAK5转染后恢复,这明显低于对照组SKOV3细胞(图4 (b))。细胞迁移能力也反映了细胞迁移试验,哪里有明显减少(SKOV3细胞的低表面膜后PAK5损耗(图4 (c))。迁移细胞的计数显示,平均只有36 PAK5-depleted组(SKOV3细胞,这明显与近100细胞SKOV3细胞(图的控制4 (d))。SKOV3细胞也表现出减少侵入性能力击倒后PAK5如图所示的入侵后测定结晶紫染色(图4 (e))。入侵细胞的定量表明PAK5-depleted SKOV3细胞的入侵能力只有一半的控制SKOV3细胞(图4 (f))。所有这些数据暗示击倒PAK5抑制细胞SKOV3细胞的迁移和入侵。

3.5。超表达A2780 PAK5促进细胞迁移和入侵的细胞

另一方面,A2780细胞PAK5过度受到细胞迁移和入侵的评估。在伤口愈合试验,发现A2780细胞显示一个相对缓慢的复苏能力的挠伤口在18 h。然而,与PAK5 A2780细胞过度积极恢复伤口,促进伤口恢复率近68%,而控制细胞(数据5(一个)和5 (b))。在细胞迁移试验,与PAK5 A2780细胞过度彩色膜表面(图下面5 (c))。PAK5-overexpressed A2780细胞显示,移民增加约2倍(图的能力5 (d))。同样,在细胞入侵检测,更多的细胞被染色后的底面PAK5过度A2780细胞(图所示5 (e))。入侵细胞的定量表明PAK5过度导致细胞入侵的能力增加了121%(图5 (f))。这些观察表明,过度A2780 PAK5促进细胞迁移和入侵的细胞。

3.6。PAK5灭活PI3K / AKT通路的击倒

从力学上看,发现SKOV3细胞PAK5击倒后,PI3K的磷酸化水平p85 (Tyr458)下降。因此,下游的一种蛋白激酶的磷酸化水平在Ser473也抑制了PAK5损耗。在Thr308 phosphor-AKT PAK5损耗并没有改变。不变的水平也观察PI3K p85和AKT的总蛋白。这些数据表明,击倒PAK5灭活的PI3K / AKT通路(如图6)。

4所示。讨论

卵巢癌是一种最致命的妇科癌症,因为它是最常诊断处于高级阶段(60 - 74%)14]。作为一个全球女性癌症相关死亡的主要原因,卵巢癌患者的预后仍然贫困由于不合时宜的诊断和有限的治疗策略。因此开发新型治疗或诊断策略是紧急的卵巢癌。到目前为止,能够很好的证明,卵巢癌的一个共同特点是不受控制的细胞生长和转移机制(14]。因此,小说的识别分子与卵巢癌细胞迁移和入侵可能有助于开发更有效的治疗方法。

在目前的研究中,我们确定了PAK5作为卵巢癌进展的关键中介。PAK5最初发现在临床卵巢癌和PAK5表达与远处转移和预后不良有关。卵巢癌的高表达PAK5基本上是按照在神经胶质瘤(9[]和结直肠癌患者15]。

更重要的是,它发现击倒的PAK5 SKOV3细胞导致细胞形态学变化和细胞骨架f -肌动蛋白的表达减少,而过度的PAK5 A2780细胞采用apico-basal极化。这个观察是一致的与先前的文献,认为规定cytoskeleton-mediating细胞形态学的变化,附着力和运动性肿瘤恶化的特征函数PAK5 [6]。针对这一事实形态改变细胞骨架大大影响癌症细胞的能动性,渗透,血管生成,从而导致附近的侵犯及远处转移的发生(16),PAK5细胞迁移和入侵的影响被检查。是观察PAK5耗尽后,SKOV3细胞与上皮细胞表型和超表达了A2780 PAK5导致显著的间充质细胞表型的细胞。细胞的形态学变化进行epithelial-to-mesenchymal过渡期间都伴随着大量分子的表达变化(17]。根据,上皮钙粘蛋白标志被提升,而间质标记波形蛋白,N-cadherin,转折后被抑制PAK5损耗。所有这些观察结果表明PAK5促进了epithelial-to-mesenchymal过渡在卵巢癌细胞株。此外,PAK5耗尽SKOV3细胞时,细胞表现出受损的伤口恢复的能力。细胞迁移和入侵能力也显著地抑制。相反,当PAK5 A2780细胞中过表达,伤口恢复能力提高了68%。细胞迁移和入侵能力都增加到约2倍。我们的观察表明,PAK5诱导epithelial-to-mesenchymal过渡和提升在卵巢癌细胞迁移和入侵。也考虑到PAK5调控细胞迁移和入侵在结肠癌等癌症类型(11,15),膀胱癌(12],和乳腺癌[18),其他出版物和我们的发现可能表明PAK5有广泛的调节作用固体肿瘤恶化。

pi3激酶/ AKT通路(PI3K / AKT)集成了信号从外部监管基本细胞功能和细胞刺激经常异常激活在人类癌症19]。pi3k函数作为形成,包括监管p85单元和催化p110亚基。在外源性刺激G protein-coupled受体(GPCRs)或受体酪氨酸激酶(rtk)被激活,细胞膜和pi3k招募。膜PI3K通过Tyr458磷酸化,激活和PI3K随后催化PtdIns 4的磷酸化,激活5-bisphoshate (PIP2)生成脂质第二信使PtdIns 3、4, 5-triphosphosate (PIP3) [4]。因此,PIP3第二信使激活下游信号通路,其中许多分歧AKT的下游(19]。AKT是PI3K信号的核心渠道,PI3K调节至关重要的细胞功能利用AKT-dependent机制(20.]。根据磷酸化,激活一种蛋白激酶调节各种细胞功能包括细胞生存、增殖、生长、迁移和入侵通过磷酸化超过200确认基板(19]。在目前的研究中,我们发现在SKOV3细胞PAK5击倒后,PI3K的磷酸化水平(在Tyr458)和一种蛋白激酶(Ser473)相应减少,而他们的总蛋白质含量保持不变。我们的数据表明,PAK5监管PI3K / AKT通路的激活过程;换句话说,PI3K / AKT信号可能是导致PAK5-mediated卵巢癌进展的分子机制。

总之,目前的研究认为PAK5卵巢癌细胞迁移和入侵的关键中介。PAK5也在卵巢癌细胞诱导epithelial-to-mesenchymal过渡。PAK5授予一个致癌属性主要是通过调节PI3K / AKT通路。我们的数据表明,任何针对PAK5可能作为一个有前途的治疗策略途径治疗卵巢癌。小抑制剂针对PI3K / AKT激活也可能冲PAK5-mediated生物活性和开放新颖见解卵巢癌治疗。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的发现可以从相应的作者。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

Diyou李和潘方面贡献了同样的工作。

确认

这个项目是由上海卫生规划委员会(上海年轻学者,国家科学基金会20144 y0144)。

引用

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