中药提取物Huaier增加达菲抗原趋化因子受体的表达,减少其配体的表达

文摘

的目标是。本研究的目的是调查是否从Huaier水提物,一个中国传统医学(中医),会影响达菲抗原趋化因子受体的表达(DARC)及其配体。此外,我们比较DARC的状态原发性和转移性乳腺癌组织相同的病人。方法。免疫组织化学是主要用来检测DARC的表达和转移性乳腺癌患者集中在30。Huaier的影响水提物对DARC的表达及其配体被定量实时聚合酶链反应,研究西方墨点法和酶联免疫吸附试验。结果。DARC的分数表达主要集中是明显高于在转移焦点,而变化ER、PR,和HER2受体小学和转移集中之间没有显著差异。Huaier水提物提升DARC的表达和分泌的减少CC趋化因子配体2 (CCL-2),科学家趋化因子配体8 (CXCL-8引发)、基质金属蛋白酶2 (MMP-2),科学家趋化因子配体1 (CXCL-1)。结论。目前的研究表明不同表达水平之间的DARC小学和转移性乳腺癌的主要是显著的,而ER的表达差异,公关,和HER2主要与转移集中并不重要。DARC可能起到负面作用在乳腺癌的转移。中药提取物Huaier可以增加DARC表达式并减少其配体的表达,如CCL-2 MMP-2, CXCL-1引发。

1。介绍

乳腺癌是女性中最严重的恶性肿瘤在中国(1]。乳腺癌死亡率的主要原因是远处器官转移。然而,转移性乳腺癌患者的5年生存率仍在25%左右,和中位生存期约为2 - 3年2,3]。

趋化因子是一类特定的小分子蛋白质,扮演重要角色的招聘和激活白细胞。他们还强调在癌症进展和转移,以及宿主免疫反应的调节。有一些特殊的趋化因子受体无法通过经典G protein-mediated通路传输信号。因此,这些受体作为拾荒者通过有效地内化同源趋化因子配体(4]。

达菲抗原趋化因子受体(DARC)是一个典型的趋化因子诱饵受体是血友病患者的首次发现。人们普遍表示对红细胞和血管内皮细胞。DARC可以绑定趋化因子与血管生成相关。自DARC缺乏7跨膜糖蛋白,DARC不会引起细胞信号转导和细胞代谢后绑定与其配体(5]。已经表明,DARC涉及消极监管机构在常见癌症的发病机理,主要是通过没收promalignant趋化因子。DARC的差别几项研究表明,对这些表明乳腺癌的预后不良,大肠癌、前列腺癌、宫颈鳞状细胞癌、甲状腺癌、胃癌(6- - - - - -10]。

激素受体阳性MCF-7细胞表达高水平的DARC,和三- mda - mb - 231细胞表达DARC的低水平。激素受体阳性的癌症的生物学行为似乎更比三重阴性癌症,温柔和DARC的表达水平与恶性肿瘤的等级有关。当提高DARC通过基因转染表达,细胞生长和转移潜力减少(10]。如果有一种方法来提高DARC表达式由一个外部因素,它可以是一个重要的方法来减少乳腺癌转移。

中药,一个丰富的强有力的抗癌药物,全球正吸引着越来越多的关注。最近,抗癌活性栓菌属robiniophilaMurr。(Huaier)已被广泛研究。Huaier是孤立的药用真菌中提取的用于中药已有大约1600年,和蛋白多糖已被确认为有效成分(11]。它已经广泛用于治疗乳腺癌、肝癌、前列腺癌和妇科恶性肿瘤(12- - - - - -14]。

先前的研究表明,Huaier水提物可以抑制乳腺癌细胞的增殖,诱导细胞凋亡,抑制肿瘤转移,诱导自噬细胞死亡,干扰DNA修复,并刺激T和B淋巴细胞的能力11,15,16]。然而,机制还不完全清楚。是否Huaier水提物影响趋化因子的表达和DARC尚未研究。为了测试我们的假设,我们比较的表达DARC原发性和转移性乳腺癌。然后,我们调查的影响Huaier水提物对DARC及其配体趋化因子的表达。

2。材料和方法

2.1。病人

总共有30名女乳腺癌患者选择来自广东中医医院(广州)研究。肿瘤标本都浸润性导管癌,根据世界卫生组织的肿瘤分类。原发性乳腺癌患者的平均年龄为50.33岁(从29到69年)。然而,这些患者复发和转移发生时的平均年龄为52.9岁(从34 - 71年)。平均无病生存期(DFS)时间是2.6年(范围从1到9年)。根据临床病理的代理定义的子类型采用13圣加伦国际乳腺癌会议(2013)专家小组(17),我们将病人分成4组。此外,3例腔的像,11例腔的b(人类表皮生长因子受体2 (HER2)负),5例腔的b (HER2阳性),3例HER2阳性(nonluminal)和8例三-(导管)。知情同意之前就从每个病人获得注册。所有标本都获得知情同意后,按照道德标准和程序进行的《赫尔辛基宣言》。书面许可提供的医院和当地伦理委员会广东省中医医院的研究。原发肿瘤特征提出了在桌子上1。

2.2。免疫组织化学染色

部分与山羊反孵化anti-DARC多克隆抗体(1:100稀释;美国圣克鲁斯,CA)一夜之间在4°C。ABC过氧化物酶染色工作,根据制造商的说明(美国向量实验室,伯林盖姆,CA)。比色检测与执行3,3-diaminobenzidine (DAB)。积极的反应被定义为那些布朗显示信号在细胞细胞质和细胞膜。DARC的染色指数(值经历)是由增加的分数染色强度得分的积极的区域。强度是得分如下:(0,-;1、弱;2、温和;3,强劲。阳性细胞的频率定义如下:0,不到5%;1、5% - -25%;2、26% - -50%; 3, 51%–75%; and 4, greater than 75%. The last score was intensity score multiplied by frequency score. For ER, PR, and HER2, the determinations were performed by Pathology Department of Guangdong Traditional Chinese Medicine Hospital.

2.3。细胞

mda - mb - 231和MCF-7细胞系来源于美国类型文化集合(写明ATCC)(美国弗吉尼亚州马纳萨斯)。mda - mb - 231细胞保持在课时中补充10%胎牛血清在无菌培养皿中37°C。MCF-7 rpmi - 1640年培养基培养细胞补充10%胎牛血清和penicillin-streptomycin(位于马里兰州Rockville流实验室)37°C。mycoplasma-free细胞系都认证。然后,我们把细胞4毫克/毫升或8毫克/毫升Huaier水提物24 h或48 h。

2.4。定量实时聚合酶链反应(存在)

总RNA分离后用试剂盒试剂制造商的手册(热费希尔科学、沃尔瑟姆,妈,美国)。RNA与DNase治疗。总RNA (1μg)转换为互补使用RevertAid合成第一链cDNA工具包(热费希尔科学、沃尔瑟姆,妈,美国)。DARC的特定引物和其他相关分子用于实验如表所示2。放大产品在1.2%琼脂糖凝胶电泳,溴化乙锭染色。

执行中存在使用荧光温度周期计(内髓,乔丹研究,圣布鲁诺,加拿大)和SYBR绿色核心PCR试剂盒根据制造商的指示(豆类,大连,中国)。50°C的初始孵化2分钟之后,变性在95°C 10秒然后在95°C 40周期为1分钟15秒和60°C。PCR检测的产品绑定SYBR荧光绿色的双链DNA,比较阈值和周期(2^−ΔΔcT)方法被用来使量化这些基因的信使rna。所有样品都测试了一式三份。目标基因表达与管家GAPDH基因。PCR后,融化曲线获得和分析。

2.5。酶联免疫吸附试验(ELISA)

细胞被播种在six-well盘子被处理之前Huaier水提物。24 h后的增长,1.5毫升的媒介收集从每个评估水平的CC趋化因子配体2 (CCL-2),科学家趋化因子配体8 (CXCL-8引发)、基质金属蛋白酶2 (MMP-2),科学家趋化因子配体1 (CXCL-1) ELISA。每个时间点的上层清液的收集和分析蛋白表达使用商用酶联免疫试剂盒(DuoSet、研发系统公司、明尼阿波利斯、锰,美国)根据制造商的指示。板块在450海里。蛋白质浓度在媒体条件计算从标准曲线生成通过添加特定无条件媒体的重组。

2.6。西方墨点法

从培养细胞蛋白质提取,然后量化bicinchoninic酸(BCA)试验设备(美国皮尔斯,罗克福德,IL),使用牛血清白蛋白作为标准。等量的蛋白质(50μg)从不同的细胞10% sds - page分离,然后孵化与目标蛋白的抗体。目标蛋白质被增强化学发光检测(ECL)工具包(Amersham淀粉微球的生物技术,乌普萨拉,瑞典)和暴露于以下毫升电影(美国伊士曼柯达公司,罗彻斯特,纽约)。捕捉到的图像Alpha图像950文档系统(αInnotech,圣莱安德罗、钙、美国)。

2.7。统计分析

数据表示为 。SPSS软件13.0版本(美国、IBM、纽约Armonk)是用于统计分析。DARC的表达差异主要与转移性肿瘤之间使用皮尔逊的评估测试。

3所示。结果

3.1。DARC的表达水平明显高于原发性乳腺癌组织,在转移性组织

调查DARC的表达水平在原发性和转移性乳腺癌组织,HER2的表达雌激素受体(ER)和孕酮(PR)首次测量。HER2的表达在3例从消极在转移性肿瘤的原发肿瘤组织积极组织。ER表达9病人和PR表达7在原发肿瘤患者积极组织和转移性肿瘤组织。总不调和的HER2、ER和PR是30%,23%,和10%,分别但HER2的表达变化,ER, PR小学和转移病灶之间没有显著差异。表达分数DARC的主要焦点是显著高于转移焦点( )(图1和表3)。结果表明表达的DARC原发性乳腺癌组织中显著高于在转移性组织。

3.2。治疗Huaier水提物增强了表达的DARC MCF-7和mda - mb - 231细胞

调查DARC的表达变化与Huaier治疗后水提物,存在和西方墨点法进行md - mb - 231和MCF-7细胞。DARC的数据显示,信使rna表达水平与Huaier治疗后水提物(4或8毫克/毫升)24或48小时显著高于控制( ;图2),治疗后蛋白表达水平的DARC Huaier水提物(4或8毫克/毫升)48 h显著高于控制( ;图3)。结果表明,治疗Huaier水提物增强MCF-7 DARC的表达和mda - mb - 231细胞。

3.3。DARC的配体的信使rna表达水平降低Huaier水提物,尤其是MCF-7细胞

学习的效果Huaier水提物在体外DARC的配体,存在也使用。CXCL-1的数据显示,信使rna表达水平,引发,CCL-2, MMP-2 MCF-7细胞治疗后Huaier水提物(4或8毫克/毫升)24小时显著低于控制( )(图4(一))。然而,mRNA水平CCL-2但不是CXCL-1,引发,MMP-2被治疗显著降低Huaier水提物(4或8毫克/毫升)mda - mb - 231细胞( )(图4 (b))。这些结果表明,信使rna表达水平DARC的配体也可以减少Huaier水提物,尤其是MCF-7细胞。

3.4。Huaier水提物减少DARC配体的分泌MCF-7和mda - mb - 231细胞体外

测试的效果Huaier水提物(4或8毫克/毫升)48 h的分泌DARC配体在体外,ELISA。数据显示治疗Huaier水提物的分泌明显减少DARC配体与控制MCF-7和mda - mb - 231细胞( )(数据5(一个)和5 (b))。结果表明,Huaier水提物减少DARC配体的分泌MCF-7和mda - mb - 231细胞体外。

4所示。讨论

达菲抗原的抗原决定簇达菲血型系统首次发现间日疟原虫的进入人类红细胞(18]。人类DARC可以选择性地绑定到炎性CC、血管生成ELR⁺科学家(谷氨酸leucine-arginine +),科学家与高亲和力趋化因子。虽然DARC在结构上类似于其他趋化因子受体,它不会引起G protein-coupled信号转导或Ca^{2 +}。因此,DARC无法夫妇通过典型的趋化因子受体信号转导途径激活当人工体外细胞表达系统(19,20.]。DARC控制趋化因子通过不同的方式,包括趋化因子释放进入血液,血浆趋化因子的转译后的修改,DARC-independent去除机制(21,22]。自从DARC结合血管生成科学家趋化因子,以及一些CC趋化因子,通过阻止这些趋化因子的生物效应,DARC可以诱发肿瘤坏死和antimetastatic效应(23]。

表明DARC涉及作为乳腺癌负监管机构,主要由封存neovascularity血管生成抑制趋化因子和随后的肿瘤。DARC过度诱导抑制肿瘤发生和/或转移通过干扰体内肿瘤血管生成10]。DARC发现绑定血管生成ELR⁺科学家趋化因子CXCL-1引发和发挥负面作用在肿瘤进展的控制通过减少血管生成ELR血管生成⁺科学家趋化因子的分泌(24]。另一配体,CCL-2,已发现有能力加速肿瘤的生长和转移的癌细胞绑定与典型的特定受体。DARC的过度表达在人类乳腺癌细胞已经报告给下调CCL-2水平和随后抑制乳腺癌细胞的增殖和转移在体内和体外10]。MMP-2起着关键作用的乳腺癌的进展通过降解细胞外基质(ECM)组件(25]。MMP-2 DARC的也是一个重要的配体。

多个典型的缺乏趋化因子绑定,比如DARC D6, CCX-CKR,这是伴随着更高的VEGF和MMP-9表达式,预测ALN的存在和程度在乳腺癌转移26]。此外,DARC亚型在肿瘤微环境可以减少promalignant趋化因子的水平在不同的度,微分对肿瘤生长和血管化的影响,导致微分的潜在转移(4]。此外,血清中DARC的患者明显的浓度与患者的复发风险(27]。然而,DARC的不同的影响主要与转移性乳腺癌没有众所周知的。

调查的表达DARC原发性和转移性乳腺癌,30例复发和转移登记。我们发现DARC的表达在病人使用免疫组织化学染色。我们的研究结果表明,DARC降低乳腺癌的不同阶段。

有许多原因的不同表情DARC原发性和转移性乳腺癌,包括肿瘤的异质性,假阳性或假阴性反应,遗传漂变或克隆选择28]。在目前的研究中,我们还发现的变化,公关,HER2表达原发性和转移性组织。然而,并没有统计上的显著差异(数据没有显示)。这个结果是按照2015年报道的一个荟萃分析(29日]。DARC的表达式在转移性或复发性组织可能会促使一个重要的角色在乳腺癌进展,与肿瘤复发和转移的关系。自DARC表达降低,血管生成的相关趋化因子过表达。乳腺癌细胞可能会变得活跃,转移至遥远的位置。因此,任何药物,能促进DARC表达在乳腺癌细胞可以降低癌症转移。

在治疗癌症,中医已经成为越来越流行的方便的吸入,inexpensiveness,不伤害正常细胞。Huaier是一种真菌中医使用多年。药物,已经由中国食品药品监督管理局批准,被用于多种癌症患者(30.]。然而,Huaier水提取物对DARC的影响及其配体没有被调查。

我们的实验表明,Huaier水提物不仅提高了DARC体外的表达,也降低了其配体的表达,如CCL-2引发,MMP-2, CXCL-1,尤其是在MCF-7细胞。然而,DARC被证实是一个强大的趋化因子控制器在转译后的阶段,而不是在转化阶段。因此,DARC一般不影响趋化因子mRNA的表达。虽然CCL-2的分泌,引发、MMP-2 CXCL-1降低体外,不是定Huaier水提物可减少配体分泌通过促进DARC的表达。自从Huaier水提物可引起细胞凋亡的细胞,这可能会影响蛋白质的分泌。

总之,我们的研究表明,DARC的表达在转移性乳腺癌组织减少,和Huaier水提物影响DARC及其配体的表达。然而,目前的研究仅包括数量有限的病人,和更多的样本需要进一步调查。此外,我们将在未来进行体内实验。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的发现可以从相应的作者。

的利益冲突

所有作者声明没有金融竞争的利益。

确认

这项研究得到了国家自然科学基金的资助中国(没有。81573651)。

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