文摘
多形性胶质母细胞瘤(GBM)是最常见和最致命的癌症之一,中枢神经系统(CNS)。本高渗透能力健康的大脑组织很难移除手术,占其致命的结果。提高生存的机会,关键是筛选与anti-invasive GBM-targeted抗癌药物和antimigratory潜力。二甲双胍,常用药物治疗糖尿病,最近成为一个有前途的抗癌分子。这提示我们,调查针对本研究二甲双胍的抗癌潜力,特别对细胞活性和入侵的影响。结果显示显著减少SF268癌细胞的生存与二甲双胍对治疗的反应。此外,二甲双胍的抑制效率2 d细胞活性和细胞入侵除了增加细胞粘附也证明SF268和U87细胞。最后,一种蛋白激酶磷酸化水平的差别,对这些基因的失活在二甲双胍治疗也证明。总之,这项研究提供了洞察anti-invasive antimetastatic二甲双胍的潜力以及其潜在的作用机制。
1。介绍
神经胶质瘤是脑部肿瘤,起源于中枢神经系统(CNS)。件(本研究),占大约80%的恶性神经胶质瘤,包含癌症干细胞自我更新(二者)导致肿瘤起始和抵抗治疗(1,2]。死亡由于恶性神经胶质瘤是癌症死亡的第三大常见原因(3,4]。恶性神经胶质瘤的管理,特别是本,仍然是具有挑战性的,尽管在癌症治疗医学和科学进步。这很大程度上归因于他们增加抵抗化疗以及高度侵袭性行为使他们很难通过手术移除(5,6]。这样的缺点来呼吁新GBM-targeted抗癌药物的筛选与antimigratory anti-invasive潜力。
二甲双胍(N, N-dimethylbiguanide)是一个属于双胍类降糖药。它通常用于治疗2型糖尿病(7,8]。二甲双胍降低高血糖通过抑制肝葡萄糖生产,增加胰岛素敏感性和葡萄糖吸收的外围组织,抑制葡萄糖的吸收和胃肠道以及抑制线粒体呼吸(7,9- - - - - -11]。药物的作用机制已被证明是腺苷酸蛋白激酶(AMPK)的依赖和AMPK-independent [7,10,12]。癌细胞度假村葡萄糖代谢增加,以满足其所需的能源需求的快速增长和扩散13,14]。因此,二甲双胍已成为一种有前途的抗癌剂在各种癌症包括本研究[15- - - - - -23]。具体来说,二甲双胍抑制本增长已被证明在体外和在活的有机体内单独或结合其他化学疗法和放射疗法24- - - - - -31日]。此外,二甲双胍对神经胶质瘤的抗癌潜力也得到了证实癌症干细胞和大脑肿瘤起源细胞(26,27,30.,32- - - - - -35]。然而,二甲双胍对神经胶质瘤细胞的能动性和入侵的影响以及它的作用机制仍知之甚少。
神经胶质瘤的入侵是一个多步过程受细胞外和细胞内的交互(36- - - - - -38]。它始于癌细胞从原发肿瘤站点的超然,绑定到细胞外基质(ECM)和随后的ECM降解完成入侵过程。细胞活性是至关重要的肿瘤细胞的迁移和入侵。细胞活性需要粘附细胞的形成和解放突起结构(36,37,39,40]。
在这项研究中,我们试图评估二甲双胍对SF268脑癌细胞的抗癌潜力和研究药物的antimigratory anti-invasive潜力以及其作用机理。为了这个目标,我们首先评价二甲双胍对使用WST-1 SF268癌细胞增殖的细胞毒性效应分析。然后我们进行了2 d运动性、粘附和入侵检测,以确定药物的antimigratory和anti-invasive潜力。最后,我们研究了二甲双胍的作用机制,通过评估其影响PI3K通路,胶质母细胞瘤中最放松管制的信号通路之一。具体地说,我们研究了参与凋亡蛋白AKT的PI3K通路在二甲双胍的抗癌,anti-invasive, antimigratory潜力。
2。材料和方法
2.1。细胞培养
人星形细胞瘤细胞系SF268和U87从美国购买类型文化集合(美国弗吉尼亚州马纳萨斯)。细胞在DMEM培养(杜尔贝科修改鹰的介质)补充10%的边后卫和100 U青霉素、链霉素和标准的细胞培养条件下维持在37°C和5%的股份有限公司2在潮湿的环境中。
2.2。抗体和试剂
兔单克隆抗体对pan-Akt和兔单克隆抗体对Akt1磷酸化S473买来Abcam(英国剑桥)。Anti-rabbit HRP-conjugated二级抗体来自Promega(美国WI Promega,有限公司)。胶原蛋白从英杰公司购买(罗克维尔市,医学博士,美国),二甲双胍(盐酸1-dimethylbiguanide)(纯度> 99%)Sigma-Aldrich(圣路易斯,密苏里州,美国),WST-1从罗氏(德国)、ECL化学发光试剂从通用电气医疗集团(小都,英国),x射线电影爱克发医疗(Mortsel、比利时),和collagen-based入侵分析微孔(美国伯灵顿,MA)。
2.3。扩散分析
细胞被播种在乘96孔板(增长面积:0.6厘米210)的密度5细胞/毫升治疗前有或没有二甲双胍溶解在DMSO溶液。治疗期后,10μl细胞增殖的试剂(WST-1)被添加到每个。2 h盘子被孵化的37°C和5%的公司2在450 nm,吸光度是阅读使用Multiskan FC微型板块ELISA读者从热费希尔科学(美国罗克福德,IL)。结果归一化到相应的控制,和细胞增殖的百分比。为下一组实验中,我们采用的方法库利et al。41]。
2.4。免疫印迹
控制和治疗细胞刮SDS和细胞溶解在缓冲组成的4%,10%β巯基乙醇、20%甘油、0.004%溴酚蓝和0.125 Tris-HCl在pH值为6.8。细胞溶解产物被煮5分钟前通过sds - page分离蛋白质样本8%或15%变性聚丙烯酰胺凝胶。蛋白质被转移到PVDF膜在一夜之间在前30 V阻塞PBS含有0.1%脱脂奶粉5% Tween-20 1 h在室温下。后,膜与初级孵化抗体的浓度1:500 2小时在室温下洗和孵化之前适当的二次抗体的浓度1:1000 2 h。最后,膜清洗,乐队被可视化治疗免疫印迹ECL化学发光试剂从通用电气医疗集团(小都,英国)。对x光片的结果爱克发医疗(Mortsel、比利时)。蛋白质表达水平受到使用ImageJ微密度分析的量化。
2.5。伤口愈合实验
细胞生长confluency文化板块,伤口是在单层无菌吸管小费。细胞被洗两次与PBS删除与新媒体碎片和补充。相差受伤区域图像是在0和受伤后24小时。ImageJ被用来量化为每个伤口,伤口宽度12个不同的点和伤口闭合的平均利率计算μm / h。
2.6。随机的活性测定
进行运动分析,细胞治疗与渥曼青霉素或二甲双胍或不及时治疗。细胞随机移动的图片收集血清每隔60秒或每3分钟2 h使用20 x的目标。在成像过程中,温度是控制使用加热阶段设定在37°C。媒介与矿物油缓冲用玫瑰和覆盖。细胞运动是量化使用ImageJ ROI追踪插件的软件,由大卫·Entenberg博士写的。这是用来计算单个细胞的总路程。行驶距离净细胞通过测量计算行驶距离之间的第一个和最后一个帧。
2.7。入侵检测
入侵检测进行了48 h与二甲双胍治疗后使用从微孔collagen-based入侵检测工具(美国伯灵顿,MA)根据制造商的协议。简而言之,SF268采用无血清细胞被饿死在收获前24小时和再悬浮在淬火介质(血清)。300年培养板插入患者使用μl无血清培养基在电镀前30分钟在室温下的细胞密度为0.6×106细胞/毫升。具体地说,250年μl的无血清培养基从插入删除,取而代之的是250年μl细胞悬液。插入被放置在一个包含500 24-well板μl每个孵化前的完全培养基为24小时37°C有限公司2孵化器。孵化后,nonmigrating细胞内上部杯被使用棉签和细胞通过膜迁移到杯子的底部表面沾了20分钟与400年在室温下μl细胞染色提供装备。污渍是提取提取缓冲和100μl提取斑被转移到一个96孔板适用于比色测量使用Multiskan FC微型板块ELISA读者,和光学密度为560 nm。
2.8。附着力试验
执行附着力试验,96 -孔板满是胶原蛋白使用胶原蛋白溶液类型我一夜之间从老鼠尾巴和孵化37°C。洗后洗涤缓冲在DMEM (0.1% BSA), 0.5% BSA的盘子被封锁在DMEM 37°C有限公司2孵化器1 h。接下来,盘子都洗和冷冻冰。同时,SF268细胞使胰蛋白酶化和稀释4×10的密度5cell /毫升之前添加50μl细胞悬液的每个在37°C,孵化有限公司5%230分钟的孵化器。盘子被动摇和洗3次。接下来,这些细胞被固定为4%多聚甲醛在室温下10分钟,洗净,与结晶紫染色(5毫克/毫升2%乙醇)10分钟。染色后,盘子是用水洗和晾干。最后,结晶紫与2% SDS可溶性细胞培植了30分钟。板块的吸收是在550 nm使用Multiskan FC微型板块ELISA读者。
2.9。统计分析
所有的结果报告代表三个独立实验的平均值。所有的错误估计,给出平均值±标准平均误差(SEM)。使用执行统计分析以及或单向方差分析(方差分析)。结果显示有统计学意义值≤0.05。
3所示。结果
3.1。二甲双胍治疗减少细胞生存能力SF268和U87细胞
首先,我们研究了二甲双胍对人类胶质母细胞瘤的抗癌潜力SF268和U87癌细胞。这一目标,细胞治疗与二甲双胍的浓度增加(1、1.5、2、2.5、5、10、15、20或50毫米)前24小时评估细胞增殖和生存能力。结果呈现在图1(一)SF268和1 b U87显示,二甲双胍可以显著减少细胞生存能力的细胞系以剂量依赖性的方式比未经处理的控制。SF268,二甲双胍施加最大的细胞毒性效应浓度的2.5毫米,即胶质母细胞瘤细胞的增殖减少的双重响应与二甲双胍治疗比未经处理的控制。对细胞毒性的影响在SF268趋于稳定在2.5毫米的浓度。因此这个浓度是选择的进一步调查研究。
(一)
(b)
3.2。二甲双胍治疗抑制细胞运动性SF268和U87细胞
后确定二甲双胍对SF268胶质母细胞瘤的细胞毒性潜在癌症细胞系,我们测试了药物调节细胞活性的能力。因此,SF268癌细胞暴露在二甲双胍治疗的能动性和未经处理的癌细胞在2 d评估使用伤口愈合和延时化验。数据2(一个)- - - - - -2 (c)(以及补充电影S1和S2)表明,暴露SF268胶质母细胞瘤细胞2.5毫米二甲双胍24 h显著抑制细胞的能动性。定量,伤口闭合率达到1μ0.22 m / h和μ为控制和m / h metformin-treated细胞,分别。同时,总迁移距离与二甲双胍治疗减少了大约50%。延时分析跟踪单个细胞迁移,从而消除的潜在干扰对扩散的影响。我们也想看看U87细胞的二甲双胍对细胞迁移的影响。延时分析显示下降了40%的总迁移距离U87细胞与二甲双胍治疗后24小时(图(2.5毫米)2 (d)和补充电影S3和S4)。
(一)
(b)
(c)
(d)
3.3。二甲双胍治疗减少细胞入侵SF268和U87细胞
建立在2 d二甲双胍抑制细胞活性,我们进一步研究了二甲双胍对入侵的影响,癌症的一个主要特征。使用transwell迁移试验,化学引诱物的边后卫在较低的井,SF268 U87细胞2.5毫米二甲双胍治疗,疗程24小时之前评估入侵的能力在体外在collagen-based入侵检测。数据3(一个)和3 (b)显示更少侵入细胞后用二甲双胍治疗和控制。定量,二甲双胍抑制细胞入侵SF268约30%,比未经处理的控制和50% U87细胞(数字3 (b)和3 (d)、职责)。
(一)
(b)
(c)
(d)
3.4。二甲双胍治疗增加SF268粘附胶原蛋白
进一步调查2 d细胞的抑制活性和入侵响应与二甲双胍治疗,我们评估了二甲双胍对SF268细胞胶原蛋白的粘附的影响,ECM的一个主要组成部分。结果在图4(一)显示增加的稳定和粘附SF268 metformin-treated细胞24小时(2.5毫米)胶原蛋白比控制。如图4 (b)发现,大约35%增加附着力与二甲双胍治疗后比治疗控制。
(一)
(b)
3.5。二甲双胍对SF268细胞活性被抑制PI3K模仿
因为以前的工作表明,二甲双胍抑制细胞迁移和入侵通过抑制一种蛋白激酶,我们想看看这个模型适用于SF268胶质母细胞瘤细胞。我们检查了二甲双胍对PI3K / Akt信号通路的影响。图5(一个)表明用2.5毫米的二甲双胍治疗SF268细胞24小时没有影响Akt蛋白的表达水平。然而,当看到在这两个数字5(一个)和5 (b),用二甲双胍治疗显著抑制一种蛋白激酶的磷酸化反映PI3K通路的激活。具体来说,一种蛋白激酶磷酸化对二甲双胍治疗降低了30%表明这种蛋白质的部分失活。
(一)
(b)
(c)
评估PI3K / Akt通路的作用在胶质母细胞瘤的迁移,我们使用渥曼青霉素抑制PI3K。细胞活性的抑制导致明显降低在2 d随机蠕动试验如图5 (c)和补充电影S5和S6。我们的研究结果表明,PI3K / Akt通路在GBM侵袭性起着重要的作用。
4所示。讨论
这项工作提供了一个了解二甲双胍治疗影响SF268 U87胶质母细胞瘤癌细胞生存能力,能动性和入侵。它还建立了一种蛋白激酶凋亡蛋白PI3K信号通路的关键中介二甲双胍的作用机理。据我们所知,这是为数不多的研究调查的抗癌潜力二甲双胍对激进SF268 U87和评估anti-invasive antimigratory这种药物在GBM癌症模型的影响。
首先,我们研究了抗癌药物的潜力在体外和建立了二甲双胍是细胞毒性SF268 U87癌细胞就是明证减少二甲双胍治疗后细胞生存能力。这是符合一个类似的研究表明T98G胶质母细胞瘤的治疗各种形式的细胞与二甲双胍降低细胞生存和触发凋亡细胞的形态学改变28]。减少SF268 U87细胞治疗后生存能力2.5毫米也类似于另一组获得的结果报告U87MG降低,T98G,和U251癌细胞生存能力46%,92%和99%,分别在2.5毫米二甲双胍治疗与控制(42]。
我们的研究结果进一步显示,二甲双胍降低2 d细胞运动性80%,因此几乎废除它。这个属性之前已经报道过在其他癌症模型包括胰腺癌、乳腺癌、肾细胞、结肠癌、肺癌、卵巢癌,神经胶质瘤,前列腺癌(43- - - - - -47]。例如,二甲双胍在胆管细胞型肝癌细胞抑制伤口愈合和二甲双胍联合顺铂被证明抑制鼻咽癌细胞的迁移46,47]。这是第一个二甲双胍antimigratory效果的证据在2 d的本,在体外。
另外,我们观察到的增加SF268癌症细胞胶原蛋白的粘附与二甲双胍治疗。粘着斑细胞运动需要解散;因此,附着力的增加与减少细胞运动性发现前面所讨论的。然而,另一个小组发现细胞粘附和入侵U251 GBM癌细胞抑制与二甲双胍治疗后(48]。增加粘附在此我们报告是一致的与先前的工作在我们的实验室,这表明RhoGAP STARD13维护RhoA活跃,防止粘着斑解散(49,50]。事实上,metformin-treated细胞表现出更细长的表现型(补充电影S2),这让我想起了StarD13 KnDn SF268细胞表型之前观察到在我们的实验室,可以解释为增加附着力和缺乏尾巴而超然的细胞迁移。因此我们目前测试二甲双胍对STARD13 RhoA和相互作用与细胞粘附和细胞的能动性。
在平行,我们调查了二甲双胍对3 d运动性或入侵SF268 U87癌细胞和演示有效减少细胞入侵与二甲双胍对治疗的反应。这是符合文学,在黑色素瘤、卵巢癌,U251脑癌等(48,51,52]。
最后,我们表明,二甲双胍能灭活一种蛋白激酶,PI3K通路的一个重要信号分子暗示潜在作用抑制PI3K在中介的抗癌潜力和anti-invasive以及由二甲双胍antimigratory施加影响。PI3K / Akt通路的重要性在胶质母细胞瘤是验证我们与渥曼青霉素治疗细胞,PI3K抑制剂。渥曼青霉素治疗细胞活性的降低和抑制EGF刺激突起关联与二甲双胍的结果。类似的研究支持这一结论,二甲双胍的影响与Akt-dependent细胞生存的一个重要抑制通路(34]。
5。结论
本研究论述了二甲双胍治疗的新本的抗癌潜力在体外模型没有先前的研究。它还演示了药物的anti-invasive和antimigratory潜力。入侵是“绿带运动”的主要障碍治疗;因此,这些发现提高二甲双胍治疗的机会候选人GBM治疗。因此需要进一步的研究来探讨二甲双胍治疗本研究的效率在活的有机体内。
数据可用性
的数据支持本研究的发现可以从相应的作者在合理的请求。
的利益冲突
作者宣称没有利益冲突。
确认
这项工作是支持的年度部门授予的黎巴嫩美国大学自然科学,贝鲁特,黎巴嫩。ROI_Tracker软件是由大卫Entenberg和约翰Condeelis CA100324和GM064346的支持。这项工作是支持的黎巴嫩美国大学自然科学部门和学校的艺术和科学研究与发展委员会(SRDC)。
补充材料
补充1。补充电影S1。控制细胞SF268进行2 d的能动性。
补充2。补充电影S2。SF268细胞用二甲双胍治疗进行2 d的能动性。
补充3。补充电影S3。U87细胞进行2 d的能动性。
补充4。补充电影S4。U87细胞用二甲双胍治疗进行2 d的能动性。
补充5。补充电影S5。SF268细胞治疗DMSO溶液进行2 d的能动性。
补充6。补充电影S6。SF268细胞治疗渥曼青霉素进行2 d的能动性。